王麗娟，萬 明，安金剛

(1.中航工業(yè)西安醫(yī)院 皮膚科，陜西 西安710000;2.西安市北方醫(yī)院 皮膚科;3.西安交通大學第二附屬醫(yī)院 皮膚科)

尋常型銀屑病作為一種慢性炎癥性皮膚病，以皮膚瘙癢、干燥、紅疹等為主要臨床表現(xiàn)[1]，該病病因復雜，目前發(fā)生機制尚未完全清楚，且易復發(fā)[2]，給患者生活質(zhì)量造成嚴重影響。研究表明[3]，角質(zhì)形成細胞異常增殖分化、炎癥細胞浸潤、免疫功能異常是尋常性銀屑病主要的病理基礎。近年來研究發(fā)現(xiàn)[4]，內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)在皮膚正常生理代謝、炎癥反應及炎癥性皮膚病中發(fā)揮重要作用。大麻素受體(cannabinoid receptor，CNR)作為一種G蛋白偶聯(lián)受體，包括CNR1和CNR2兩個重要亞型，是內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)重要組成，在調(diào)控內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)參與的各項生理病理過程中發(fā)揮重要作用[5]。本研究為進一步探討CNR在尋常性銀屑病發(fā)病中的作用，對患者血清和皮損組織中CNR1和CNR2表達進行分析，并探討其在評估疾病嚴重程度中的意義。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1臨床資料 選取2015年3月至2017年3月在我院皮膚科門診就診的尋常型銀屑病患者78例，病例納入標準：①所有患者均具有典型的臨床癥狀，符合尋常型銀屑病診斷標準[6]；②本次發(fā)病前未進行外用藥物或系統(tǒng)治療；③無免疫系統(tǒng)、結締組織、類風濕關節(jié)炎等自身免疫性疾病；④近2月內(nèi)未使用過免疫抑制劑等影響免疫功能的藥物；⑤排除孕婦及哺乳期婦女。其中，男性43例，女性35例，平均年齡(31.5±6.7)歲，病程5個月-16年，平均(7.6±2.4)年，根據(jù)患者病程將患者分為靜止期和進展期，其中，靜止期28例，進展期50例。同期，從體檢中心選取45例健康者作為血清對照組，其中，男性26例，女性19例，平均年齡(32.4±7.0)歲，兩組在性別、年齡無差異(P>0.05)，均衡可比。同時，從手術室選取手術切除的正常皮膚組織40份作為皮膚對照組，均經(jīng)病理學檢查證實，其中，男性21例，女性19例，平均年齡(30.8±6.4)歲，與尋常型銀屑病患者在性別、年齡無差異(P>0.05)，均衡可比。本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準，所有研究對象均行知情同意。

1.1.2主要試劑和設備 CNR1和CNR2檢測試劑盒均購自上海研盟生物工程有限公司，Trizol總RNA提取試劑盒購自美國Invitrogen公司，逆轉錄和PCR試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司，CNR1、CNR2及內(nèi)參引物由上海生工生物公司設計合成實時熒光定量PCR儀購自瑞士Roche公司。

1.2方法

1.2.1酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA法)檢測血清中CNR1和CNR2水平 所有尋常型銀屑病患者和血清對照組均采取晨起空腹靜脈血6 ml，4℃下于3 500 r/min離心20 min，留取血清，保存于-70℃以備檢。利用ELISA法檢測血清中CNR1和CNR2水平，所有操作均在標準實驗室按照試劑盒說明完成。

1.2.2實時熒光定量PCR技術檢測組織中CNR1和CNR2基因表達 取尋常型銀屑病患者皮損組織和皮膚對照組正常皮膚組織，研磨后，加入細胞裂解液，用Trizol總RNA提取試劑盒對組織中總RNA提取并檢測純度和濃度。取50 μg總RNA，逆轉錄為模板鏈cDNA，以cDNA為模板進行PCR。引物序列：CNR1：上游：5’-GAGCAAGGACCTGAGACATGC-3’，下游：5’-CTTAACAGTGCTCTTGATGCAGC-3’；CNR2：上游：5’-GACCGCCATTGACCGATACC-3’，下游：5’-GGACCCACATGATGCCCAG-3’； GAPDH：5’-TCACCACCATGGAGAAGGC-3’，下游：5’-GCTAAGCAGTTGGTGGTGCA-3’。PCR反應條件：94℃ 3 min，92℃ 30 s，53℃ 30 s，75℃ 30 s，連續(xù)循環(huán)38次，每個樣品設3個平行反應復孔。用2-△△Ct法計算組織中CNR1和CNR2基因相對表達量。

1.2.3銀屑病皮損面積和嚴重程度指數(shù)(psoriasis area and severity index，PASI)評分 尋常型銀屑病患者就診時根據(jù)皮損面積和皮損嚴重程度對患者進行評分[7]：公式：PASI評分=(E頭+I頭+D頭)×A頭×0.1+(E上肢+I上肢+D上肢)×A上肢×0.2+(E軀干+I軀干+D軀干)×A軀干×0.3+(E下肢+I下肢+D下肢)×A下肢×0.4。其中，A：面積，E：紅斑，I：斑塊肥厚程度，D：鱗屑。

1.3統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1尋常型銀屑病患者和血清對照組血清中CNR1和CNR2水平比較

尋常型銀屑病患者血清中CNR1和CNR2水平均高于血清對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 尋常型銀屑病患者和血清對照組血清中CNR1和CNR2水平比較

2.2不同病程尋常型銀屑病患者血清中CNR1和CNR2水平比較

與血清對照組相比，進展期和靜止期尋常型銀屑病患者血清中CNR1和CNR2水平均升高，且進展期高于靜止期，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 不同病程尋常型銀屑病患者血清中CNR1和CNR2水平比較

注：與血清對照組相比，aP<0.05；與靜止期相比，bP<0.05

2.3尋常型銀屑病患者和皮膚對照組皮膚組織中CNR1和CNR2表達比較

尋常型銀屑病患者皮損組織中CNR1 mRNA和CNR2 mRNA相對表達量均高于皮膚對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 尋常型銀屑病患者和血清對照組血清中CNR1和CNR2水平比較

2.4不同病程尋常型銀屑病患者皮損組織中CNR1和CNR2表達比較

與皮膚對照組相比，進展期和靜止期尋常型銀屑病患者皮損組織中CNR1 mRNA和CNR2 mRNA相對表達量均升高，且進展期高于靜止期，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表4。

表4 不同病程尋常型銀屑病患者皮損組織中CNR1和CNR2表達比較

注：與皮膚對照組相比，aP<0.05；與靜止期相比，bP<0.05

2.5尋常型銀屑病患者血清和皮損組織中CNR1和CNR2表達與PASI評分相關性

Pearson相關分析顯示，尋常型銀屑病患者血清CNR1和CNR2水平均與PASI評分呈正相關(r=0.412、0.435，P<0.05)，皮損組織中CNR1 mRNA和CNR2 mRNA相對表達量均與PASI評分呈正相關(r=0.324、0.406，P<0.05)。

3 討論

銀屑病是常見的皮膚慢性炎癥性疾病，與免疫系統(tǒng)功能異常密切相關，且病程遷延反復、尚無特效的治愈方法[8]，尋常型銀屑病是銀屑病中最常見類型，約占銀屑病的90%以上[9]，由于該病病因及機制尚未完全清楚，已成為臨床研究重點。近年來，內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)在疾病發(fā)生及治療中的作用越來越受到重視，研究發(fā)現(xiàn)[10]，內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)在應激、疼痛、免疫、認知、運動、腫瘤等多種腫瘤生理過程中發(fā)揮重要作用。同時，在維持皮膚穩(wěn)態(tài)及調(diào)控細胞增殖、分化、凋亡中起重要作用[11]。CNR作為內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)中關鍵性組成部分，在其功能發(fā)揮中發(fā)揮核心作用[12]，包括CNR1和CNR2兩種主要的類型，CNR1主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，近年來發(fā)現(xiàn)，脾臟、皮膚、免疫細胞等外周器官及組織中也分布廣泛[13]，CNR2主要分布在脾臟、扁桃體等外周器官，在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[14]。陶科明等[15]指出，CNR1和CNR2在潰瘍性結腸炎中表達上調(diào)，可能參與了其發(fā)生發(fā)展過程。本研究為進一步探討CNR在尋常型銀屑病發(fā)生中的作用，對患者血清和皮損組織中CNR1和CNR2表達進行了分析。

本研究結果顯示，尋常型銀屑病患者血清中CNR1和CNR2水平均高于血清對照組，且皮損組織中CNR1 mRNA和CNR2 mRNA相對表達量均高于皮膚對照組，說明CNR1和CNR2在尋常型銀屑病患者血清和皮損組織中表達水平升高，提示CNR1和CNR2可能參與了尋常型銀屑病發(fā)病過程。本研究結果顯示，與血清對照組和皮膚對照組相比，進展期和靜止期尋常型銀屑病患者血清和皮損組織中CNR1和CNR2表達水平均升高，且進展期高于靜止期，說明CNR1和CNR2可能與尋常型銀屑病患者病情嚴重程度有關，隨著尋常型銀屑病病情活躍程度增加，CNR1和CNR2表達量增加，提示CNR1和CNR2有望成為監(jiān)測患者病情的指標。同時，本研究相關分析亦顯示，患者血清和皮損組織中CNR1和CNR2水平均與PASI評分呈正相關，而PASI是反映銀屑病嚴重程度的指標[16]，進一步說明CNR1和CNR2可能參與了患者病情進展過程。

綜上所述，尋常型銀屑病患者血清和皮損組織中CNR1和CNR2表達升高，且與患者病情嚴重程度有關，可能參與了患者病情進展過程，有望為尋常型銀屑病機制研究及臨床治療提供新的方向和靶位。

作者簡介：安金剛(1978-)，男，山東人，博士，副研究員，主要研究方向為特應性皮炎，銀屑病。