胡方園 黃婉靜 吳繼紅 陳君毅

青光眼視神經(jīng)病變是全球范圍內(nèi)第1位不可逆性致盲眼病，在全球致盲人群中占21%，預(yù)計(jì)到2040年全球青光眼患者可高達(dá)1億人。青光眼是以視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cell，RGC)凋亡及其軸突退變?yōu)椴±砘A(chǔ)的進(jìn)行性神經(jīng)退行性眼病[1]。RGC的視神經(jīng)保護(hù)一直是青光眼研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)和難點(diǎn)，深入探索RGC有效的保護(hù)劑，將有利于為青光眼臨床治療提供有效的靶向藥物，阻斷視神經(jīng)的進(jìn)行性損傷。此外，視網(wǎng)膜是代謝旺盛的神經(jīng)組織，其血供特點(diǎn)是視網(wǎng)膜血管沒(méi)有側(cè)支循環(huán)代償，尤其是視網(wǎng)膜內(nèi)5層神經(jīng)組織僅受視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)供血。因此，當(dāng)發(fā)生視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)血供障礙時(shí)，視網(wǎng)膜神經(jīng)組織缺血、缺氧，特別是RGC及其軸突極易受到損傷。有研究[2-3]表明，積雪草酸(asiatic acid，AA)在神經(jīng)系統(tǒng)中可以抵抗缺血、缺氧等因素造成的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮有效的神經(jīng)保護(hù)作用，但在青光眼及視網(wǎng)膜視神經(jīng)缺血、缺氧等疾病中的作用還鮮見(jiàn)報(bào)道。還有研究[4]表明，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，凋亡相關(guān)蛋白c-Abl作為關(guān)鍵的凋亡調(diào)控分子，在細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要效能。本文就AA在原代RGC低氧刺激所致凋亡中的保護(hù)作用及其對(duì)c-Abl的調(diào)控作用進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 出生1～3 d的新生SD大鼠，由我院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，飼養(yǎng)環(huán)境良好。

1.1.2 主要試劑 Neurobasal培養(yǎng)基(Thermo)，木瓜蛋白酶(Worthington)，卵類黏蛋白(Sigma-Aldrich)，DNase Ⅰ(Sigma-Aldrich)，轉(zhuǎn)鐵蛋白(Sigma-Aldrich)，黃體酮(Sigma-Aldrich)，腐胺(Sigma-Aldrich)，硒(Sigma-Aldrich)， T3(Sigma-Aldrich)，T4(Sigma-Aldrich)，B27(Invitrogen)，丙酮酸鈉(Gibco)，谷氨酰胺(Gibco), N-乙酰-L-半胱氨酸(Sigma-Aldrich)，胰島素(Sigma-Aldrich)，毛喉素(Sigma-Aldrich)，腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(PeproTech)，睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(PeproTech)，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(PeproTech)，Thy1.1抗體(Santa Cruz)，抗巨噬細(xì)胞抗體(Santa Cruz)，c-Abl抗體(Santa Cruz)，p-c-Abl抗體(Millipore)。

1.2 方法

1.2.1 Thy1.1抗體包被法純化RGC 選取出生1～3 d的新生SD大鼠，解剖游離出視網(wǎng)膜，經(jīng)木瓜蛋白酶溶液37 ℃消化30 min后，加入蛋白酶抑制劑(0.1% 牛血清白蛋白, 0.1%卵類黏蛋白，1% DNase Ⅰ)終止消化，吹打成單細(xì)胞懸液。將獲取的單細(xì)胞懸液緩慢加入已包被好抗巨噬細(xì)胞抗體(50 mmol/L，pH=9.5，Tris-HCl稀釋)的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，37 ℃靜置1 h，視網(wǎng)膜中的巨噬細(xì)胞被吸附到培養(yǎng)皿底部；吸取培養(yǎng)液上清液緩慢加入已包被好抗Thy1.1抗體(50 mmol/L，pH=9.5，Tris-HCl稀釋)的培養(yǎng)皿中，37 ℃靜置1 h，棄細(xì)胞培養(yǎng)基上清液，黏附到培養(yǎng)皿底部的細(xì)胞即是RGC群。獲取的RGC群接種在包被有多聚賴氨酸以及層粘連蛋白的培養(yǎng)皿中，加入RGC培養(yǎng)基(Neurobasal培養(yǎng)基包含0.1 mg/mL 牛血清白蛋白, 0.1 mg/mL 轉(zhuǎn)鐵蛋白，60 ng/mL 黃體酮, 16 μg/mL 腐胺, 40 ng/mL 硒, 40 ng/mL T3, 40 ng/mL T4, 20 μL/mL B27，1 mmol/L 丙酮酸鈉，2 mmol/L 谷氨酰胺, 5 μg/mL N-乙酰-L-半胱氨酸, 5 μg/mL 胰島素, 5 μmol/L 毛喉素, 50 ng/mL 腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子, 10 ng/mL 睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子, 10 ng/mL 堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子, 100 U/mL 抗生素)，于37 ℃ 5% CO2條件下培養(yǎng)，每2 d給予半換液處理。

1.2.2 RGC純度鑒定 經(jīng)Thy1.1抗體包被篩選方法獲取的陽(yáng)性RGC群，抽提總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，隨后以定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative polymerase chain reaction, qPCR)檢測(cè)RGC以及其他類型細(xì)胞的Marker表達(dá)水平。RGC特異性Marker包括Thy1.1、Tuj1、Brn3a及Brn3b；其他視網(wǎng)膜細(xì)胞Marker包括膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白、巨噬細(xì)胞CD68及無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞Syntaxin。

1.2.3 TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè) 低氧條件下(1%O2)，給予原代RGC不同時(shí)間(0、12、24、48 h)的低氧刺激，TUNEL凋亡試劑盒檢測(cè)RGC凋亡。給予原代RGC不同濃度(0、5、10、20、50 μmol/L)的AA預(yù)處理2 h后，1% O2處理48 h，TUNEL凋亡試劑盒檢測(cè)RGC凋亡。

1.2.4 CCK-8細(xì)胞活力檢測(cè) RGC接種于96孔板中，每孔接種3×104個(gè)細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置空白孔(只加培養(yǎng)基)，去除酚紅對(duì)吸光度的影響。2 d后，待RGC生長(zhǎng)良好時(shí)，分別加入0、5、10、20、50 μmol/L的AA預(yù)處理2 h后，1% O2處理48 h， CCK-8檢測(cè)RGC的存活率。

1.2.5 Wes全自動(dòng)蛋白質(zhì)印跡定量分析系統(tǒng) 收集不同處理組的細(xì)胞，提取總蛋白；Wes全自動(dòng)蛋白質(zhì)印跡定量分析系統(tǒng)檢測(cè)c-Abl和p-c-Abl的蛋白表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，定量資料比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SD大鼠原代RGC培養(yǎng)及純度鑒定 利用Thy1.1抗體包被法純化獲取的RGC在體外培養(yǎng)2 d后，顯微鏡下觀察其生長(zhǎng)狀態(tài)良好(圖1A)。采用qPCR檢測(cè)Thy1.1抗體包被法分選的RGC純度，與non-RGC群相比，分選出的RGC群中神經(jīng)節(jié)細(xì)胞特異性標(biāo)志物Thy1.1、Tuj1、Brn3a、Brn3b的表達(dá)水平均顯著高于non-RGC群；而其他細(xì)胞類型的標(biāo)志物GFAP、Syntaxin、CD68則明顯低于non-RGC群(圖1B)。與之相反，non-RGC群中神經(jīng)節(jié)細(xì)胞特異性標(biāo)志物的表達(dá)均低下。

圖1. 大鼠原代RGC純度鑒定 A.顯微鏡下觀察RGC生長(zhǎng)情況(100×)；B.qPCR檢測(cè)原代RGC純度

2.2 低氧條件下原代RGC的凋亡特征 以體外低氧條件(1% O2)模擬青光眼及視網(wǎng)膜缺血性損傷因素，給予原代RGC不同時(shí)長(zhǎng)(0、12、24、48 h)的低氧刺激，TUNEL檢測(cè)RGC的凋亡情況，0、12、24、48 h低氧刺激組的凋亡細(xì)胞數(shù)分別為23.000±3.606、74.500±5.500、125.000±5.000、180.000±10.000(圖2)，隨著低氧刺激時(shí)間的遞增，RGC的TUNEL凋亡細(xì)胞數(shù)呈梯度升高，與正常氧培養(yǎng)相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 AA對(duì)原代RGC低氧損傷的保護(hù)作用 低氧刺激下(1%O2，48 h)，TUNEL檢測(cè)AA干預(yù)后RGC的凋亡情況(圖3)，低氧刺激時(shí)，TUNEL凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與正常氧條件相比明顯增加(P<0.01，2組凋亡細(xì)胞數(shù)分別為38.000±5.000、175.500±5.500)；給予不同濃度(0、5、10、20和50 μmol/L)的AA處理后，凋亡細(xì)胞數(shù)依次為122.000±3.000、69.000±6.000、42.000±3.000、118.000±8.000，RGC的凋亡細(xì)胞數(shù)在10 μmol/L與20 μmol/L AA干預(yù)時(shí)顯著減少(P<0.01)。同時(shí)CCK-8檢測(cè)低氧條件下RGC的細(xì)胞活力，低氧條件下(1%O2，48 h)，RGC的存活率明顯低于正常氧培養(yǎng)條件(P<0.01)；加入不同劑量的AA后，RGC的存活率同樣在10 μmol/L與20 μmol/L AA干預(yù)時(shí)升高， 結(jié)果表明AA在低氧條件下可以抑制RGC的凋亡，促進(jìn)其存活(圖4)。

圖2. TUNEL檢測(cè)RGC凋亡情況 A.給予原代RGC不同時(shí)長(zhǎng)低氧刺激后，熒光顯微鏡下觀察TUNEL染色結(jié)果(100×)；B.TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的統(tǒng)計(jì)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與正常氧條件(0 h)相比，3組不同低氧刺激時(shí)間的凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均顯著增加(＊＊示P<0.01，＊＊＊示P<0.001)

圖3. TUNEL檢測(cè)RGC凋亡情況 A.給予AA預(yù)處理后，低氧(1%O2)條件下培養(yǎng)48 h，熒光顯微鏡下觀察TUNEL染色結(jié)果(100×)；B.TUNEL凋亡細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計(jì)，常氧條件與低氧條件下的凋亡細(xì)胞數(shù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＊＊示P<0.01)；不同濃度AA干預(yù)后與低氧條件相比，凋亡細(xì)胞數(shù)顯著減少(＊示P<0.05，＊＊示P<0.01)

圖4. CCK-8檢測(cè)RGC增殖活力 與正常氧條件相比，低氧刺激(1%O248 h)后，RGC細(xì)胞活力明顯下降(＊＊示P<0.01)；給予10 μmol/L與20 μmol/L AA干預(yù)后，可以促進(jìn)RGC的增殖能力(＊示P<0.05，＊＊示P<0.01)

2.4 AA通過(guò)調(diào)控c-Abl信號(hào)分子保護(hù)原代RGC的低氧損傷 體外低氧(1%O2)刺激原代RGC后，利用Wes全自動(dòng)蛋白質(zhì)印跡定量分析系統(tǒng)檢測(cè)c-Abl總蛋白及磷酸化蛋白表達(dá)水平。原代RGC給予不同時(shí)間的低氧刺激后，磷酸化c-Abl的蛋白表達(dá)水平呈時(shí)間梯度性增加(圖5A)，表明c-Abl的磷酸化激活與RGC凋亡相關(guān)，可能參與調(diào)控RGC的凋亡。

體外給予原代RGC 20 μmol/L AA干預(yù)，1%O2處理48 h后，Wes全自動(dòng)蛋白質(zhì)印跡定量分析系統(tǒng)檢測(cè)蛋白表達(dá)。AA可以顯著抑制低氧條件下c-Abl的蛋白磷酸化水平(圖5B)，結(jié)果表明AA可以通過(guò)抑制c-Abl的磷酸化激活減少原代RGC的凋亡，促進(jìn)其存活。

圖5. Wes全自動(dòng)蛋白質(zhì)印跡定量分析系統(tǒng)檢測(cè)蛋白表達(dá) A.不同時(shí)間的低氧刺激下(1%O2)，c-Abl總蛋白及磷酸化蛋白的表達(dá)情況；B.AA干預(yù)后，觀察常氧條件以及低氧條件下的c-Abl總蛋白及磷酸化蛋白表達(dá)水平

3 討論

青光眼及視網(wǎng)膜視神經(jīng)缺血性疾病是一種多因素引起的視神經(jīng)病變，主要包括氧化應(yīng)激損傷、高眼壓機(jī)械損傷、缺血/再灌注損傷、線粒體功能異常、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的剝奪、胞內(nèi)Ca+毒性、谷氨酸鹽神經(jīng)毒性以及自身免疫因素等，但無(wú)論哪種病理性因素，最終共同的結(jié)局均是RGC的凋亡、進(jìn)行性丟失，并且具有不可逆性[5]。多年來(lái)對(duì)于這些眼病的視網(wǎng)膜視神經(jīng)保護(hù)研究主要靶向于抑制RGC的凋亡，但未有突破性成果。因此，探索RGC有效的保護(hù)藥物具有重要意義。

AA是一種存在于天然產(chǎn)物中的五環(huán)三萜類化合物，具有很強(qiáng)的抗氧化作用，可有效清除氧自由基，同時(shí)還兼具抗炎癥、舒張血管的特性[6]。體外研究[3,7-8]表明，在H2O2、魚(yú)藤酮、神經(jīng)酰胺以及谷氨酸的損傷刺激下，AA可有效抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。在谷氨酸誘導(dǎo)的腦損傷小鼠模型中，AA干預(yù)后可有效改善小鼠的記憶功能[7]。此外，腦缺血-再灌注損傷動(dòng)物模型中，AA也具有很好的神經(jīng)保護(hù)作用[9]。綜上所述，無(wú)論是體外還是體內(nèi)動(dòng)物模型中，AA都可以很好地發(fā)揮抗氧化作用，清除氧自由基，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的存活。AA在青光眼以及視網(wǎng)膜缺血性疾病中的作用尚罕見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)探討了AA在原代RGC缺氧損傷中的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，低氧刺激下原代RGC的凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增加。而AA干預(yù)后，TUNEL實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示低氧條件下RGC的凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少；并且細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明AA干預(yù)后RGC的細(xì)胞活力明顯升高。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)AA可有效抑制低氧損傷中原代RGC的凋亡，促進(jìn)其存活。此外，我們還初步探討了AA抗RGC凋亡的分子機(jī)制。

c-Abl作為非受體酪氨酸激酶家族中的成員之一，廣泛表達(dá)于細(xì)胞中，在細(xì)胞凋亡信號(hào)通路的調(diào)控中發(fā)揮重要效能[10]。研究[4, 11-12]表明，在神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病中，c-Abl在神經(jīng)元的損傷中發(fā)揮重要作用。在MPTP誘導(dǎo)的帕金森病動(dòng)物模型中，c-Abl的磷酸化水平明顯升高，通過(guò)增強(qiáng)與P38α的相互作用促進(jìn)P38α的磷酸化，從而導(dǎo)致神經(jīng)元的死亡[4]。此外，AβO誘導(dǎo)的阿爾茲海默病模型中，c-Abl的活性明顯增加，進(jìn)一步通過(guò)提高HDAC2的活性，激活CDK5/GSK3β信號(hào)通路來(lái)抑制神經(jīng)元相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)以及促進(jìn)神經(jīng)元的凋亡[11-12]。綜上所述，c-Abl作為關(guān)鍵的凋亡調(diào)控分子在神經(jīng)變性疾病中發(fā)揮重要作用，但是在RGC損傷中罕見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，給予原代RGC不同時(shí)間的低氧刺激后，RGC發(fā)生凋亡，磷酸化c-Abl的蛋白表達(dá)水平呈時(shí)間梯度性增加，表明c-Abl的磷酸化激活與RGC的凋亡密切相關(guān)。給予AA干預(yù)后，發(fā)現(xiàn)AA在抑制RGC凋亡的同時(shí)，可以顯著下調(diào)磷酸化c-Abl的表達(dá)水平，初步證實(shí)AA通過(guò)調(diào)控c-Abl的激活在RGC凋亡中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，AA通過(guò)抑制c-Abl的磷酸化激活在大鼠原代RGC的低氧損傷中發(fā)揮保護(hù)作用。據(jù)此研究結(jié)果，后續(xù)可在動(dòng)物模型內(nèi)進(jìn)一步做有效性和安全性研究，有望為青光眼及視網(wǎng)膜視神經(jīng)缺血性病變的神經(jīng)保護(hù)治療提供新的候選藥物。