趙翊明，王紫泉，田海霞，和文祥，李道恒

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 資源環(huán)境學(xué)院,農(nóng)業(yè)部西北植物營(yíng)養(yǎng)與農(nóng)業(yè)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌 712100)

砷是自然界豐度排第20位的具有較強(qiáng)毒性和致癌作用的類金屬元素[1]，被稱為土壤五大污染元素之一。自然界中超過(guò)245種礦物中含有砷，人類活動(dòng)，如采礦、化石燃料燃燒、農(nóng)藥使用等都會(huì)造成環(huán)境砷污染[2]。目前我國(guó)受砷、鎘、鉛等污染耕地近2.0×107hm2，占耕地總面積的20%以上[3-4]，其中尤以云南、內(nèi)蒙古、湖南等地最嚴(yán)重，如湖南石門縣雄黃礦附近土壤砷含量最高達(dá)296 mg/kg[5]。砷在土壤中主要以無(wú)機(jī)離子形態(tài)存在，主要有As(Ⅴ)與As(Ⅲ)兩種價(jià)態(tài)，其中As(Ⅲ)比As(Ⅴ)生物毒性更強(qiáng)[6-7]。在自然環(huán)境中，氧化還原電位(Eh)和酸堿度(pH)是影響砷存在價(jià)態(tài)的主要因素[8-9]；當(dāng)pH+pE>10或<8時(shí)，As(Ⅴ)和As(Ⅲ)分別成為環(huán)境中的主要形態(tài)[1,10]。同時(shí)，由我國(guó)《土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(1995年)中可以看出，堿性條件下土壤的砷污染臨界值小于酸性條件下，砷的毒性更強(qiáng)。

土壤酶是具有催化能力的土壤組分中最為活躍的成分之一，它參與土壤物質(zhì)循環(huán)和能量代謝，是土壤中重要的生物活性指標(biāo)。磷酸酶是土壤磷循環(huán)中的重要酶類，可水解有機(jī)磷為無(wú)機(jī)磷，為作物生長(zhǎng)提供有效磷。依據(jù)最適pH不同，磷酸酶可分為酸性、中性和堿性磷酸酶。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)砷污染的酶效應(yīng)進(jìn)行了研究，結(jié)果總體表現(xiàn)為抑制、激活及不變3種規(guī)律[6,11-14]?？梢?jiàn)由于供試樣品、砷價(jià)態(tài)等條件不同，造成研究結(jié)果不盡一致，難以相互比較。此外，大多數(shù)研究直接利用土壤酶完成，鮮有采用不同狀態(tài)酶進(jìn)行重金屬污染的研究，很難深入探討砷與酶的作用機(jī)理；加之，pH是影響砷價(jià)態(tài)與毒性的主要因素之一，特別是在堿性pH條件下，砷的生物毒性更強(qiáng)，但其如何影響砷與酶之間的關(guān)系卻鮮見(jiàn)報(bào)道。鑒于此，本試驗(yàn)擬在不同pH條件下，研究不同狀態(tài)(游離態(tài)、固定態(tài)、土壤)堿性磷酸酶活性與砷污染之間的關(guān)系，揭示堿性磷酸酶活性與砷污染及pH的關(guān)系，探明不同條件下砷對(duì)酶的作用機(jī)理，為判斷砷污染程度、評(píng)價(jià)土壤質(zhì)量及完善土壤酶理論提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 游離態(tài)和固定態(tài)堿性磷酸酶的制備

堿性磷酸酶(Alkaline Phosphate，ALP)儲(chǔ)備液制備：稱取堿性磷酸酶(購(gòu)自Sigma公司，酶活性≥10 EDA)0.150 0 g，溶于pH 8.8的Tris-HCl緩沖溶液，定容，最終酶質(zhì)量濃度為3 mg/mL，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｊ褂脮r(shí)分別將儲(chǔ)備液稀釋成游離態(tài)堿性磷酸酶(Free ALP,F-ALP)溶液(0.03 mg/mL)以及M工作液(0.06 mg/mL)。

固定態(tài)堿性磷酸酶(Immobilized ALP by montmorillonite,M-ALP)制備：取游離態(tài)堿性磷酸酶M工作液2 mL，加入10 mg/mL蒙脫石((Al,Mg)2[Si4O10](OH)2·nH2O，AR)懸液2 mL，25 ℃、250 r/min振蕩2 h，12 000 r/min離心15 min，取沉淀物用pH 7.5 Tris-HCl緩沖液離心洗滌3次后，用4 mL pH 7.5 Tris-HCl緩沖液重新懸浮，充分分散后得固定態(tài)堿性磷酸酶，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 供試土壤

采自我國(guó)內(nèi)蒙古自治區(qū)未污染農(nóng)田土壤(41°20′N,109°50′E)的栗鈣土(Calci-Ustic Isohumosols)。采樣時(shí)先去除表層(0～5 cm)土，用五點(diǎn)采樣法取5～20 cm土層土樣，混勻風(fēng)干，過(guò)孔徑1 mm尼龍篩備用。土壤理化性質(zhì)[15]為：有機(jī)質(zhì)含量16.30 g/kg，pH 8.80(水土體積質(zhì)量比2.5∶1)，全氮含量0.96 g/kg，全磷含量0.38 g/kg，全鉀含量26.40 g/kg，速效磷含量7.01 mg/kg，速效鉀含量177.99 mg/kg，陽(yáng)離子交換量11.61 cmol/kg，黏粒含量10.51%，總砷含量0.17 mg/kg(測(cè)定砷含量時(shí)加入2個(gè)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)土壤樣品GSS 9和GSS 10進(jìn)行質(zhì)量控制。GSS 9和GSS 10的標(biāo)準(zhǔn)As含量分別為(8.4±1.3)，(8.9±0.9) mg/kg，本試驗(yàn)測(cè)得的結(jié)果分別為8.27和9.02 mg/kg)。

1.3 不同pH下游離態(tài)、固定態(tài)堿性磷酸酶對(duì)As(Ⅴ)污染響應(yīng)的試驗(yàn)方案

吸取0.2 mL F-ALP或M-ALP溶液，分別添加0.2 mL不同質(zhì)量濃度(0，10，25，50，100，200，300，400 mg/L)As(Ⅴ)溶液(配制砷溶液采用的砷化合物試劑為Na3AsO4，化學(xué)純)，污染30 min后分別添加pH 7.0，8.0，9.0，10.0 的0.005 mol/L磷酸苯二鈉底物緩沖溶液2 mL，搖勻后于37 ℃培養(yǎng)，在510 nm下用比色法測(cè)定酶活性[16]，同時(shí)用pH計(jì)電極法測(cè)定溶液的pH，用pH計(jì)鉑電極直接測(cè)定法測(cè)定溶液的Eh。游離態(tài)、固定態(tài)堿性磷酸酶活性分別以1 h 內(nèi)單位ALP(μg)、蒙脫石(mg)產(chǎn)生的酚量(μg)表示。

1.4 不同pH下土壤堿性磷酸酶對(duì)As(Ⅴ)污染響應(yīng)的試驗(yàn)方案

稱取土樣3.00 g于50 mL三角瓶中，添加0.15 mL甲苯，15 min后分別加入3 mL不同質(zhì)量濃度(0，10，25，50，100，200，300，400 mg/L)As(Ⅴ)溶液，污染30 min后分別添加pH 7.0，8.0，9.0，10.0的0.5%磷酸苯二鈉底物緩沖溶液20 mL，充分振蕩后于37 ℃培養(yǎng)，測(cè)定土壤堿性磷酸酶(Soil ALP，S-ALP)活性、pH和Eh。土壤堿性磷酸酶活性以1 h 內(nèi)單位干土(g)產(chǎn)生的酚量(μg)表示。

酶活性抑制率=(1-處理酶活性/對(duì)照酶活性)×100%。

pE=n×F×Eh/(2.303×R×T)。

式中：n為電子轉(zhuǎn)移數(shù)；F為法拉第常數(shù)， 其值為6.564 kJ/V；Eh為氧化還原電位；T為絕對(duì)溫度；R為氣體常數(shù)，其值為8.314 J/(mol·K)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用 Microsoft Excel 2007、Origin Pro 8.5和SPSS 19.0 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析及模型擬合，LSD法對(duì)各處理間差異進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 堿性磷酸酶對(duì)As(Ⅴ)污染響應(yīng)過(guò)程中pE的影響

不同pH下堿性磷酸酶對(duì)As(Ⅴ)污染響應(yīng)過(guò)程中pE的影響見(jiàn)圖1。從圖1可以看出，pE隨pH升高而減小，除pH 10.0時(shí)3種堿性磷酸酶pE差異達(dá)到顯著水平外，其余pH條件下不同狀態(tài)堿性磷酸酶之間pE值差異較小。 pH 10.0時(shí)土壤堿性磷酸酶pE最小，為4.24；pH 7.0時(shí)固定態(tài)堿性磷酸酶pE最大，為6.49，二者相差1.53倍。本試驗(yàn)中pH+pE為13.24～14.39，當(dāng)pH+pE>10時(shí)，環(huán)境中砷主要以As(Ⅴ)存在[7]，故可判斷本試驗(yàn)過(guò)程中砷并未發(fā)生還原反應(yīng)，均以五價(jià)存在。

圖柱上標(biāo)不同小寫(xiě)字母表示相同pH下不同體系的pE差異顯著(P<0.05)Different lowercase letters mean significant difference at P<0.05圖1 不同pH下堿性磷酸酶對(duì)As(Ⅴ)污染響應(yīng)過(guò)程中pE的影響Fig.1 Effects of pH on pE in the response of ALP to As (V) pollution

2.2 砷污染下堿性磷酸酶活性的響應(yīng)

選取pH 10.0為代表，分析As(Ⅴ)對(duì)3種堿性磷酸酶活性的影響,結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 pH 10.0下As(Ⅴ)對(duì)堿性磷酸酶活性的影響Table 1 Effect of As (V) on alkaline phosphatase activity at pH 10.0

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note:Different lowercase letters mean significant differece atP<0.05.

從表1可以看出，砷加入導(dǎo)致堿性磷酸酶活性總體減小，表明砷抑制了3種堿性磷酸酶活性。砷質(zhì)量濃度較低(<10 mg/L)時(shí)，堿性磷酸酶活性表現(xiàn)出激活，但是與CK差異不顯著。在相同質(zhì)量濃度下，砷對(duì)固定態(tài)堿性磷酸酶的影響小于游離態(tài)堿性磷酸酶，對(duì)土壤堿性磷酸酶的影響更小。當(dāng)砷質(zhì)量濃度為400 mg/L時(shí)，砷對(duì)游離態(tài)、固定態(tài)、土壤堿性磷酸酶的抑制率分別為59.61%，20.81%，19.90%，可見(jiàn)As(Ⅴ)污染下堿性磷酸酶活性降幅遵循土壤堿性磷酸酶<固定態(tài)堿性磷酸酶<游離態(tài)堿性磷酸酶的規(guī)律性變化，表明載體對(duì)酶具有保護(hù)作用，同時(shí)可緩沖砷的毒性，揭示載體形態(tài)在酶與重金屬關(guān)系研究中具有重要作用。

2.3 pH對(duì)砷與堿性磷酸酶活性關(guān)系的影響

pH對(duì)As (V)與堿性磷酸酶活性關(guān)系的影響見(jiàn)圖2。

圖柱上標(biāo)不同小寫(xiě)字母表示同一pH下As(Ⅴ)濃度間不同堿性磷酸酶活性的差異顯著(P<0.05)Different lowercase letters on bars mean significant difference at P<0.05圖2 pH對(duì)As(V)與堿性磷酸酶活性關(guān)系的影響Fig.2 Effect of pH on the relationship of As(V) and alkaline phosphatase activity

從圖2 可以看出，砷未污染時(shí)，3種堿性磷酸酶活性均隨pH升高而增大,pH 10.0時(shí)，游離態(tài)堿性磷酸酶、固定態(tài)堿性磷酸酶、土壤堿性磷酸酶活性分別為pH 7.0，8.0，9.0時(shí)的4.56，3.50，2.744倍；2.79，2.47，1.11倍；3.91，2.38，1.21倍。砷污染條件下，3種堿性磷酸酶活性也隨pH升高而增加,其中pH 10.0時(shí)游離態(tài)堿性磷酸酶活性明顯高于pH 為9.0，8.0，7.0，pH 10.0，9.0時(shí)固定態(tài)堿性磷酸酶、土壤堿性磷酸酶活性明顯高于pH 為8.0，7.0。砷對(duì)堿性磷酸酶活性的抑制率隨pH增加而增大，即砷對(duì)堿性磷酸酶的毒性隨pH的升高而增大,例如砷質(zhì)量濃度達(dá)到200 mg/L時(shí)，游離態(tài)堿性磷酸酶活性在pH 7.0，8.0，9.0，10.0時(shí)的抑制率分別為21.07%，35.01%，40.46%，43.11%；固定態(tài)堿性磷酸酶活性在pH 7.0，8.0，9.0，10.0時(shí)的抑制率則分別為8.36%，9.69%，11.88%，16.11%；土壤堿性磷酸酶活性在pH 7.0，8.0，9.0，10.0時(shí)的抑制率分別為3.62%，9.11%，15.89%，14.10%。

采用完全抑制模型E=A/(1+B×C)對(duì)不同堿性磷酸酶活性(E)與砷質(zhì)量濃度(C)之間關(guān)系進(jìn)行擬合，結(jié)果(表2)顯示，擬合模型的決定系數(shù)均達(dá)到極顯著水平，表明擬合模型可較好地表征堿性磷酸酶活性與砷質(zhì)量濃度間關(guān)系，且在較寬的pH范圍內(nèi)，堿性磷酸酶在一定程度上可表征環(huán)境中砷的污染程度，并揭示出其機(jī)理主要為完全抑制作用。生態(tài)劑量(酶活性變化10%時(shí)外界污染物的質(zhì)量濃度，ED10)隨pH增大而減小，即pH越小，對(duì)砷毒性的緩沖能力越大。pH 7.0，8.0，9.0時(shí)游離態(tài)堿性磷酸酶、固定態(tài)堿性磷酸酶、土壤堿性磷酸酶的ED10是pH 10.0時(shí)的2.40，1.44，1.14倍；2.63，1.45，1.83倍；1.37，1.16，1.26倍。固定態(tài)堿性磷酸酶及土壤堿性磷酸酶生態(tài)劑量值均大于游離態(tài)堿性磷酸酶，但三者的生態(tài)劑量均低于《土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(1995年)三級(jí)標(biāo)準(zhǔn)(40 mg/kg)，表明在一定程度上，堿性磷酸酶對(duì)砷毒性更加敏感。

表2 不同 pH下堿性磷酸酶活性(E)與砷質(zhì)量濃度(C)之間關(guān)系的擬合結(jié)果Table 2 Regression equations between alkaline phosphatase activities(E) and As concentrations(C)

注： **表示相關(guān)性達(dá)極顯著水平(P<0.01)。下表同。

Note: ** indicates the correlation reached the extremely significant level atP<0.01.The same below.

2.4 砷與環(huán)境條件對(duì)堿性磷酸酶活性的交互作用

為探討pH、pE、砷等因素對(duì)堿性磷酸酶活性的影響，對(duì)其進(jìn)行了方差分析，結(jié)果(表3)可見(jiàn)，砷質(zhì)量濃度、pH+pE均極顯著影響3種堿性磷酸酶活性，且兩因素間存在極顯著的交互作用，即最終的堿性磷酸酶活性是由砷與其pH、Eh等因素共同決定的，這也從側(cè)面反映出研究砷對(duì)堿性磷酸酶活性影響時(shí)需充分考慮pH、Eh的影響。

表3 pH、pE和砷對(duì)堿性磷酸酶活性影響的方差分析Table 3 ANOVA analysis of alkaline phosphatase activity in tested samples

3 討 論

本研究中，堿性磷酸酶活性隨pH的升高而增大。由于本試驗(yàn)中采用堿性磷酸酶的最適pH為9.8，pH為10.0時(shí)幾乎達(dá)到了其最適條件，故其活性顯著大于其余pH條件下。pH 9.0時(shí)固定態(tài)堿性磷酸酶活性已明顯高于pH 7.0和8.0時(shí)，表明固定態(tài)堿性磷酸酶相對(duì)于游離態(tài)堿性磷酸酶對(duì)pH敏感程度降低。這可能是由于，一方面蒙脫石和土壤對(duì)pH的變化具有一定的緩沖性；另一方面當(dāng)酶被固定在蒙脫石上后，pH對(duì)酶活性特征的影響發(fā)生了變化[17]。對(duì)黏土礦物固定態(tài)酸性磷酸酶及β-葡萄糖苷酶等的研究也證實(shí)了固定態(tài)酶能夠降低pH的敏感程度[18-19]。土壤堿性磷酸酶活性隨pH升高變化較為平緩。這是因?yàn)橥寥老到y(tǒng)更加復(fù)雜，土壤中堿性磷酸酶的最適pH為8.0～10.0[20]，土壤堿性磷酸酶活性受土壤性質(zhì)影響較大，導(dǎo)致其對(duì)pH的敏感程度較游離態(tài)或者單一蒙脫石固定態(tài)酶活性小。

本研究結(jié)果顯示，砷污染抑制了堿性磷酸酶活性，且抑制率隨pH升高而增大，表明pH升高，砷對(duì)堿性磷酸酶的毒性增大。此外，ED10隨pH升高而減小，也證實(shí)pH是影響砷毒性的重要因子。隨pH升高，砷酸鹽存在形態(tài)從近中性條件下的一價(jià)陰離子向強(qiáng)堿性條件的三價(jià)陰離子轉(zhuǎn)變，這種變化導(dǎo)致砷在溶液中移動(dòng)能力增強(qiáng)，更容易與堿性磷酸酶結(jié)合，從而導(dǎo)致對(duì)酶的抑制增強(qiáng)。重金屬對(duì)酶活性的抑制主要通過(guò)與酶活性中心結(jié)合阻止底物與酶反應(yīng)，或者改變酶的構(gòu)象，或者與底物反應(yīng)等方式產(chǎn)生作用。砷對(duì)堿性磷酸酶的抑制為競(jìng)爭(zhēng)性抑制，砷酸鹽與磷酸鹽結(jié)構(gòu)相似，砷通過(guò)與酶活性中心結(jié)合阻止了酶-底物復(fù)合物形成而對(duì)其活性產(chǎn)生抑制[10]。有研究顯示，砷對(duì)堿性磷酸酶的抑制常數(shù)(Ki)小于米氏常數(shù)(Km)，表明相同砷質(zhì)量濃度下，砷與堿性磷酸酶的結(jié)合能力要強(qiáng)于底物與其結(jié)合的能力[21]。pH升高，砷與堿性磷酸酶的結(jié)合能力增強(qiáng)，從而導(dǎo)致砷對(duì)堿性磷酸酶的抑制增強(qiáng)。

本研究結(jié)果顯示，砷對(duì)不同狀態(tài)下堿性磷酸酶活性抑制率表現(xiàn)為，游離態(tài)堿性磷酸酶>固定態(tài)堿性磷酸酶>土壤堿性磷酸酶；同時(shí)，ED10也表現(xiàn)出同樣的規(guī)律。揭示了固定態(tài)或土壤堿性磷酸酶對(duì)砷的敏感度降低，蒙脫石和土壤對(duì)堿性磷酸酶的固定能夠降低砷對(duì)堿性磷酸酶的毒性。蒙脫石、土壤對(duì)酶有吸附固定的作用，這種作用可以提高酶對(duì)外界環(huán)境脅迫的穩(wěn)定性，使酶對(duì)外界脅迫的敏感度降低[18-19]，即酶對(duì)砷的敏感度降低。類似研究也發(fā)現(xiàn)，針鐵礦和氧化錳礦物固定后的酸性磷酸酶對(duì)Cu的敏感度降低[22]；Cu脅迫下，針鐵礦對(duì)β-葡萄糖苷酶具有保護(hù)效應(yīng)，其原因是針鐵礦對(duì)Cu有較強(qiáng)的吸附[23]。同時(shí)，黏土礦物、土壤等載體有巨大的表面積及表面能，對(duì)砷有較強(qiáng)的吸附作用[1,2,10]，并且對(duì)As(Ⅴ)的吸附要強(qiáng)于As(Ⅲ)[10]。在氧化條件下，As(Ⅴ)是穩(wěn)定存在的形態(tài)，其可以強(qiáng)烈吸附于黏土礦物、鐵錳氧化物(氫氧化物)及有機(jī)質(zhì)中[1]，在一定程度上緩解砷對(duì)酶活性的毒性[24]，起到了對(duì)酶的保護(hù)作用。

4 結(jié) 論

砷對(duì)堿性磷酸酶活性的抑制作用隨pH升高而增大，砷毒性增強(qiáng)。模型E=A/(1+B×C)可較好地表征砷質(zhì)量濃度(C)與堿性磷酸酶活性(E)之間的關(guān)系。在供試pH范圍內(nèi)，堿性磷酸酶在一定程度上可作為表征環(huán)境中砷污染的指標(biāo)，并反映出其間的作用機(jī)理為完全抑制作用。3種狀態(tài)堿性磷酸酶ED10值均遠(yuǎn)低于國(guó)家《土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(1995年)中砷的三級(jí)污染臨界值，揭示堿性磷酸酶是較為靈敏的砷污染評(píng)價(jià)指標(biāo)。砷對(duì)固定態(tài)及土壤堿性磷酸酶活性的抑制率小于游離態(tài)堿性磷酸酶。酶固定介質(zhì)土壤對(duì)砷的毒性具有緩沖作用，對(duì)酶活性具有保護(hù)效應(yīng)。