龐保亞,李 強(qiáng),任仲海

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院,山東果蔬優(yōu)質(zhì)高效生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心,農(nóng)業(yè)部黃淮地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗室,作物生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗室,山東 泰安 271018

黃瓜（Cucumis sativusL.）一年生的草本植物，屬于葫蘆科（Cucurbitaceae），是世界十大蔬菜之一，我國是世界上黃瓜生產(chǎn)面積最大、總產(chǎn)量最高的國家[1-3]。赤霉素是植物體內(nèi)重要的激素調(diào)節(jié)物質(zhì)之一。研究表明赤霉素在植物生長發(fā)育過程中起重要作用，包括種子萌發(fā)、表皮毛發(fā)育、莖和葉的伸長、花的發(fā)育和果實(shí)的形成[4-10]。另外赤霉素在植物免疫方面也有重要作用[11]。目前，赤霉素合成途徑在一些植物中已經(jīng)研究的比較清楚，在高等植物中赤霉素的生物合成是一個多級化的氧化酶催化反應(yīng)過程并且是保守的[12]，赤霉素氧化酶GA20ox1是催化反應(yīng)的關(guān)鍵酶之一。

在已知的赤霉素生物合成路徑中有三種關(guān)鍵酶類，分別是GA20ox,GA3ox和GA2ox。這三種酶類屬于20G-Fe(II)oxygenase亞家族并且是被多基因家族所編碼[9]。其中赤霉素20-氧化酶是目前已知的在赤霉素合成過程中重要的限速酶，在赤霉素合成后期催化連續(xù)的氧化反應(yīng)[13]，它以中間產(chǎn)物（GA12,GA53,GA15,GA44,GA24,GA19）為底物最終形成GA9和GA20，再經(jīng)過赤霉素3-氧化酶的作用最終形成有生物活性的赤霉素[14]。在擬南芥中，含有5個赤霉素20-氧化酶，進(jìn)化樹分析表明AtGA20ox1，2，3和4的親緣關(guān)系非常近，而AtGA20ox5與其余四種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；分析比較催化活性發(fā)現(xiàn)AtGA20ox1，2，3和4均具有完整的催化能力，而AtGA20ox5只能催化前兩步反應(yīng)，不具有完整的催化活性；功能分析表明AtGA20ox3與AtGA20ox1和AtGA20ox2具有功能冗余性，ga20ox1突變體表現(xiàn)出植株矮小的性狀，而ga20ox2單突變體和ga20ox3單突變體并沒有明顯變化。ga20ox1-3三突變體植株表現(xiàn)出嚴(yán)重的植株矮小和不育，以ga20ox1-3三突變體為背景突變AtGA20ox4或AtGA20ox5沒有進(jìn)一步影響植株表型[15,16]，而超量表達(dá)AtGA20ox1由于提高了赤霉素的水平而增強(qiáng)植株的生長[17-20]，表現(xiàn)出蓮座叢增大和葉柄長度增加[13]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，在水稻中GNP1即AtGA20ox1的同源基因OsGA20ox1可以催化合成赤霉素合成必須的重要中間產(chǎn)物GA20，促進(jìn)赤霉素的合成，同時超量表達(dá)OsGA20ox1可以增加谷粒的數(shù)量和最終的產(chǎn)量[21]。棉花中GhGA20ox1在煙草中異源表達(dá)不僅增加了葉柄的長度，并且顯著增加了子葉下胚軸、果炳和花的長度[22]。研究表明在黃瓜中同樣含有5個赤霉素20氧化酶（CsGA20ox1，2，3，4和5），并且5個氧化酶的功能是相似的，都可以將GA12轉(zhuǎn)化為GA9（主要產(chǎn)物）和GA25（次要產(chǎn)物），另外，CsGA20ox1還可以有效催化13-羥基化途徑中早期的GA53轉(zhuǎn)化為GA20的反應(yīng)[23]。但CsGA20ox1在黃瓜生長發(fā)育過程中的作用還不清楚。

為探明CsGA20ox1在黃瓜生長發(fā)育中的作用，本實(shí)驗采用同源克隆的方法克隆了黃瓜赤霉素20-氧化酶基因CsGA20ox1，成功構(gòu)建了CsGA20ox1超量表達(dá)載體，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化獲得了CsGA20ox1轉(zhuǎn)基因擬南芥株系。通過分析轉(zhuǎn)基因擬南芥種子萌發(fā)速率、轉(zhuǎn)基因擬南芥地上部分生長情況和葉片表皮細(xì)胞大小，初步揭示CsGA20ox1在植株生長發(fā)育中的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

“新泰密刺”黃瓜取自山東農(nóng)業(yè)大學(xué)南校區(qū)園藝試驗站，取樣時間為2017年5月至7月。分別對不同的組織生長根、幼莖、新生葉、開花當(dāng)天的花、開花當(dāng)天的果實(shí)和卷須取樣，樣品用液氮速凍保存用于檢測CsGA20ox1表達(dá)。

選擇3周左右生長狀態(tài)一致的擬南芥（Arabidopsis thaliana(L.)Heynh）轉(zhuǎn)基因植株拍照并測量葉片面積、葉柄長度和蓮座叢面積。取新生葉片，樣品用液氮速凍保存用于檢測CsGA20ox1、AtGA20ox1等基因的表達(dá)。

1.2 總 RNA的提取以及實(shí)時熒光定量PCR分析

轉(zhuǎn)基因擬南芥和黃瓜各組織的RNA提取均采用TRIZOL法，以提取的總RNA為模板，按照北京全式金生物技術(shù)有限公司cDNASynthesis Super Mix試劑盒說明書合成cDNA第1鏈。

選取CsActin（GenBank accession number AB010922）為黃瓜內(nèi)參基因和AtGAPDH為擬南芥內(nèi)參基因。PCR 反應(yīng)體系為：1 μL cDNA，2.5 μL 10×Taq buffer，2 μL dNTPs（2.5 mmol·L-1），上、下游引物各 1 μL（10 μmol·L-1）和 0.5 μL（5 U·μL-1）Taq 酶（全式金，北京），加去離子水至 25 μL。PCR反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性5 min，94℃30 s，56℃30 s，72℃30 s，72℃5 min，28～32個循環(huán)；PCR產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳。熒光定量PCR使用的儀器為BIO-RAD IQ5，所有PCR反應(yīng)都設(shè) 3 次重復(fù)。PCR 反應(yīng)體系為：2×Realtime PCR Super mix 10 μL，上、下游引物濃度為 0.5 μmol·L-1，模板1 μL，加去離子水至20 μL。PCR反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性1 min，95℃15 s，60℃15 s，72℃30 s 40個循環(huán)。采用2-ΔΔCT法進(jìn)行定量數(shù)據(jù)分析。

1.3 亞細(xì)胞定位

通過引物中引入的BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)，將CsGA20ox1基因從pJET-T載體切下回收，并對pROKⅡ進(jìn)行相同酶切位點(diǎn)的酶切，將兩者在22℃連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，鑒定陽性單菌落。構(gòu)建pROKⅡ-CsGA20ox1-GFP表達(dá)載體。

通過液氮凍融法將質(zhì)粒pROKⅡ-CsGA20ox1-GFP和p19轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌C58C1。以農(nóng)桿菌浸潤法侵染本生煙,挑取陽性菌落接種到含對應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基(25 mg·L-1Rif,50 mg·L-1Kan)，每分鐘200 轉(zhuǎn) 28 ℃振蕩培養(yǎng) 12～16 h。將 2 種菌液 5000×g 離心 5 min，懸浮(懸浮緩沖液:10 mmol·L-1MgCl2，10 mmol·L-1MES，150 μmol·L-1As)。含 p19 的菌液與含 pROKⅡ-CsGA20ox1-GFP 菌液等體積混合，使其OD600為0.6～0.8。室溫靜置3 h后注射煙草葉片，48～96 h內(nèi)觀察定位結(jié)果。

熒光觀察時撕取浸潤48～96 h的本生煙葉片下表皮進(jìn)行觀察。GFP經(jīng)488 nm激光激發(fā)，通過550～590 nm濾鏡后獲得熒光信號。

1.4 植物過表達(dá)載體的構(gòu)建及擬南芥轉(zhuǎn)基因株系的獲得

通過引物中引入的BamHⅠ和SacⅠ酶切位點(diǎn)，將CsGA20ox1基因從pJET-T載體切出回收，并對pBI121進(jìn)行相同酶切位點(diǎn)的酶切，將兩者在22℃連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，鑒定陽性單菌落。構(gòu)建pBI121-CsGA20ox1植物過表達(dá)載體。

轉(zhuǎn)基因擬南芥通過侵染擬南芥花序的方法獲得[24]。經(jīng)過50 mg·L-1卡那抗性篩選后，PCR檢測得到陽性轉(zhuǎn)基因植株，收取種子，經(jīng)過自交純化得到純合株系，進(jìn)行表型分析。

1.5 擬南芥葉面積、葉柄長度和蓮座叢面積的測量

野生型（WT）擬南芥和轉(zhuǎn)基因（CsGA20ox1）擬南芥在恒溫光照條件下培養(yǎng)23 d，對蓮座叢和第六片葉進(jìn)行拍照，并運(yùn)用Image J測量葉面積、葉柄長度和蓮座叢面積。

1.6 DIC(Differential Interference Contrast)實(shí)驗

脫色：取上面拍照所用的第六片真葉，用14%冰醋酸和84%的乙醇混合液(比例1:4)，浸泡24 h。

脫水：用75%乙醇浸泡24 h，重復(fù)1次；再用99.5%乙醇浸泡脫水24 h，重復(fù)1次；最后用水合三氯乙醛浸泡30 min。

觀察：制作臨時玻片，通過顯微鏡觀察葉片下表皮細(xì)胞并拍照。

3次生物學(xué)重復(fù)，每次每個株系取三片以上真葉進(jìn)行處理觀察，觀察時選取葉片中間遠(yuǎn)離葉脈及表皮毛的部位，運(yùn)用五點(diǎn)取樣法測量表皮細(xì)胞面積。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃瓜CsGA20ox1的分離克隆及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

圖1 黃瓜CsGA20ox1及其他物種同源基因的進(jìn)化分析Fig.2 Evolution analysis of cucumber CsGA20ox1 and other homologous genes

以黃瓜cDNA為模板，CsGA20ox1-OE-F/R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得1122 bp特異條帶。該基因編碼一個含374個氨基酸的蛋白質(zhì)。利用MEGA7.0軟件將黃瓜CsGA20ox1蛋白序列與擬南芥、水稻的GA20ox蛋白序列進(jìn)行同源序列比對分析并構(gòu)建進(jìn)化樹（圖1），結(jié)果表明，黃瓜CsGA20ox1與擬南芥AtGA20ox1、2、3和4的氨基酸序列同源性較高且親緣關(guān)系比較近。

2.2 黃瓜中CsGA20ox1表達(dá)模式分析

為了探明CsGA20ox1在黃瓜不同組織中的表達(dá)特性，在同一時間獲取黃瓜各個組織，提取總RNA（三個生物學(xué)重復(fù)）后反轉(zhuǎn)錄得到cDNA第一鏈，以此作為模板進(jìn)行定量PCR分析。結(jié)果如圖2所示，CsGA20ox1在黃瓜子房和幼葉中表達(dá)量較高，在花和卷須中表達(dá)量相對較低。

圖2 CsGA20ox1在黃瓜不同組織中的表達(dá)分析Fig.2Analysis of the expression of CsGA20ox1 gene in different tissues of cucumber

2.3 CsGA20ox1的亞細(xì)胞定位

為探究CsGA20ox1的亞細(xì)胞定位，構(gòu)建了以35S為強(qiáng)啟動子驅(qū)動的含有CsGA20ox1完整編碼區(qū)并連接GFP的融合蛋白表達(dá)載體（35S::CsGA20ox1-GFP），以35S::GFP為對照，通過農(nóng)桿菌侵染煙草葉片進(jìn)行瞬時表達(dá)。經(jīng)過三次生物學(xué)重復(fù)，每次觀察三個以上臨時玻片得到結(jié)果如圖3（D-F）所示，融合蛋白在煙草葉片表皮細(xì)胞的細(xì)胞核中有熒光信號，表明CsGA20ox1在細(xì)胞核中有表達(dá)。

圖3 CsGA20ox1的亞細(xì)胞定位Fig.3 Subcellular localization of CsGA20ox1

2.4 擬南芥中異源表達(dá)CsGA20ox1

構(gòu)建CsGA20ox1超量表達(dá)載體pBI121-CsGA20ox1（圖4），轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404，利用侵染擬南芥花序的方法進(jìn)行基因的遺傳轉(zhuǎn)化。通過自交純化得到OE-7、OE-9和OE-10純合轉(zhuǎn)基因株系，實(shí)時熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)基因株系CsGA20ox1表達(dá)量如圖5。

圖4 pBI-121-CsGA20ox1結(jié)構(gòu)示意圖Fig.4 pBI-121-CsGA20ox1 structure diagram

2.5 超量表達(dá)CsGA20ox1提高擬南芥種子萌發(fā)速率

對獲得的CsGA20ox1擬南芥轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行種子萌發(fā)實(shí)驗。每次播種100粒種子統(tǒng)計發(fā)芽率，三次生物學(xué)重復(fù)得到結(jié)果如圖6所示，在培養(yǎng)12 h后轉(zhuǎn)基因擬南芥開始萌發(fā)，在24 h、36 h、48 h和60 h轉(zhuǎn)基因擬南芥的種子萌發(fā)率顯著高于野生型擬南芥，72 h后種子發(fā)芽率均達(dá)到99%以上，說明選取的種子良好，表明超量表達(dá)CsGA20ox1提高了擬南芥種子的萌發(fā)速率。

圖5 CsGA20ox1在野生型（WT）和轉(zhuǎn)基因擬南芥OE-7、OE-9、OE-10株系中的表達(dá)水平Fig.5 Expression value of CsGA20ox1 in wild type(WT)and transgenic Arabidopsis thaliana OE-7,OE-9andOE-10strain

圖6 野生型擬南芥（WT）和轉(zhuǎn)基因株系（OE-7、OE-9、OE10）的種子萌發(fā)率統(tǒng)計Fig.6 Seed germination rate of wild type Arabidopsis(WT)and transgenic strain(OE-7,OE-9 and OE-10)

2.6 超量表達(dá)CsGA20ox1可以增加擬南芥地上部分的葉面積、葉柄長度和蓮座葉大小

對獲得的CsGA20ox1轉(zhuǎn)基因擬南芥生長狀況進(jìn)行觀察，在培養(yǎng)23 d后發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因擬南芥蓮座葉面積明顯大于野生型（圖7-A）。通過比較此時期各個葉片的大小發(fā)現(xiàn)第六片真葉差異最明顯。因此，選擇第六片真葉來統(tǒng)計葉面積和葉柄長度。統(tǒng)計結(jié)果表明與野生型相比轉(zhuǎn)基因擬南芥三個株系的葉面積、葉柄長度均有所增加，其中OE-7增加54%、OE-9增加150%、OE-10增加179%。說明CsGA20ox1基因在擬南芥中異源表達(dá)可以促進(jìn)植株地上部分的生長發(fā)育。

圖7 野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥蓮座叢面積及第六片真葉葉面積和葉柄長度表型及統(tǒng)計Fig.7 Phenotype and statistics of rosette area,the sixth euphylla area and petiole length of wild type and transgenic Arabidopsis thaliana

2.7 超量表達(dá)CsGA20ox1增大葉片表皮細(xì)胞面積

異源表達(dá)CsGA20ox1后擬南芥表現(xiàn)出葉面積增大的表型，說明CsGA20ox1可能影響了葉片細(xì)胞的大小或者數(shù)量。取WT和轉(zhuǎn)基因株系植株同一部位葉片，通過DIC實(shí)驗觀察葉片表皮細(xì)胞(選取葉片中部并避免葉脈存在)結(jié)果如圖8，可以看出與野生型相比，轉(zhuǎn)基因株系的葉片表皮細(xì)胞有顯著增大。統(tǒng)計結(jié)果表明與野生型相比，表皮細(xì)胞面積OE-7增加21%、OE-9增加46%、OE-10增加58%。

圖8 觀察統(tǒng)計野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片下表皮細(xì)胞大小Fig.8 Observation and statistics on the size of epidermal cells in leaves of wild-type and transgenicArabidopsis thaliana

3 討 論

進(jìn)化樹分析表明，黃瓜CsGA20ox1與擬南芥AtGA20ox1、AtGA20ox2、AtGA20ox3和AtGA20ox4親緣關(guān)系均非常近，推測其功能相近。同時，組織表達(dá)分析結(jié)果顯示，該基因在黃瓜各組織中均有表達(dá)，其中在幼葉和開花當(dāng)天的果實(shí)中表達(dá)量較高，CsGA20ox1可能在種子萌發(fā)和葉片生長發(fā)育過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。

目前，在黃瓜中赤霉素氧化酶的亞細(xì)胞定位還沒有相關(guān)研究，但是在擬南芥、水稻等植物中已有所研究。在擬南芥赤霉素氧化酶AtGA20ox2的亞細(xì)胞定位是通過構(gòu)建融合熒光蛋白表達(dá)載體并在煙草葉片中瞬時表達(dá)實(shí)現(xiàn)的，檢測熒光信號顯示擬南芥AtGA20ox2同時在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)[25]。另外，赤霉素氧化酶的GA2ox家族基因的亞細(xì)胞定位也有所研究，在水稻中通過侵染洋蔥表皮細(xì)胞研究赤霉素氧化酶OsGA2ox5、OsGA2ox6的亞細(xì)胞定位，結(jié)果顯示其均是在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)[26-27]，而本實(shí)驗結(jié)果（如圖4）CsGA20ox1主要在細(xì)胞核中表達(dá)。

為了進(jìn)一步研究CsGA20ox1在黃瓜生長發(fā)育中的功能，我們構(gòu)建了CsGA20ox1基因的超量表達(dá)載體，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥。轉(zhuǎn)基因擬南芥表現(xiàn)出種子萌發(fā)速率加快（圖7）并且地上部分生長狀況明顯優(yōu)于野生型（圖8），表明CsGA20ox1在促進(jìn)種子萌發(fā)速率和植株生長中發(fā)揮重要作用。以前的研究表明通過外源施加赤霉素可以顯著促進(jìn)茄子、西瓜的種子萌發(fā)[28,29]，在白菜生長過程中通過外源施加赤霉素可以顯著促進(jìn)白菜整個植株的生長發(fā)育[30]。這說明轉(zhuǎn)基因擬南芥（CsGA20ox1）促進(jìn)種子萌發(fā)和植株發(fā)育可能是由于促進(jìn)了擬南芥體內(nèi)赤霉素的合成所引起的。另外轉(zhuǎn)基因擬南芥葉面積的增大可能是由于增加了單個細(xì)胞的面積，通過顯微鏡觀察統(tǒng)計，結(jié)果也證實(shí)了轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片表皮細(xì)胞的平均面積與野生型相比有顯著增加（圖8），但是葉片細(xì)胞數(shù)量有沒有增加還不清楚需要通過進(jìn)一步實(shí)驗探究。

4 結(jié) 論

通過克隆獲得黃瓜CsGA20ox1，該基因編碼373個氨基酸。進(jìn)化樹分析表明該基因與擬南芥AtGA20ox1親緣關(guān)系最近，組織表達(dá)特異性分析結(jié)果顯示黃瓜CsGA20ox1主要在幼葉和開花當(dāng)天的果實(shí)中表達(dá)。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明黃瓜CsGA20ox1主要在細(xì)胞核中表達(dá)。在擬南芥中異源表達(dá)黃瓜基因CsGA20ox1能夠促進(jìn)種子萌發(fā)和植株生長，其中葉片的增大可能是通過增大細(xì)胞面積和增加細(xì)胞數(shù)量實(shí)現(xiàn)的。因此，黃瓜CsGA20ox1可以促進(jìn)種子萌發(fā)和葉片生長發(fā)育。