高燕燕， 李琳， 趙禹， 朱妞， 楊純

(山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西臨汾041004)

蜥蜴亞目Sauria視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和機能與各自的生活習(xí)性一致(張育輝，賈林芝，2003)，且具有特殊的視覺再生能力(Langetal.，2002)。視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)的增齡改變必然影響機體的視覺功能(孫慶艷等，2004)。膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)在星形膠質(zhì)細胞中的表達可反映其功能活動狀態(tài)(Biginietal.，2001；Williams，2017)。視網(wǎng)膜Müller細胞中表達GFAP是成體脊椎動物的共同特征(Sassoèetal.，1992)。GFAP在無蹼壁虎Gekkoswinhonis視網(wǎng)膜中的分布特點及年齡相關(guān)性變化，提示Müller細胞可能通過增強或減弱GFAP表達參與視網(wǎng)膜衰老過程中的生理功能調(diào)節(jié)(王智超等，2008)。

秦嶺滑蜥Scincellatsinlingensis是我國特有的卵胎生蜥蜴(趙爾宓，1999)，為《國家保護的有益的或者有重要經(jīng)濟、科學(xué)研究價值的野生動物名錄》收錄物種(王志寶，2000)，相關(guān)研究局限于其部分器官系統(tǒng)的組織形態(tài)學(xué)(謝權(quán)等，2012；王麗敏等，2015，2016；Yang & Wang，2016；Yangetal.，2017)，尚無視網(wǎng)膜顯微結(jié)構(gòu)增齡性變化的相關(guān)報道。因此，對秦嶺滑蜥幼體、亞成體和成體視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)以及GFAP陽性表達變化進行探究，旨在積累蜥蜴類爬行動物視覺器官發(fā)育的基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

秦嶺滑蜥采自山西省霍州市太岳山七里峪林區(qū)(110°40′～112°21′E，36°21′～36°45′N)，雌雄兼有。根據(jù)吻肛長(SVL)分為幼體組(SVL<48.08 mm)、亞成體組(48.08 mm≤SVL≤57.08 mm)、成體組(SVL>57.08 mm)(馬小梅，計翔，2001；王麗敏，2016)，每組6只。實驗動物經(jīng)乙醚麻醉致死后，剝離眼球，置于不同固定液中。

1.2 常規(guī)組織化學(xué)染色

材料經(jīng)Bouin’s液固定后，梯度乙醇脫水，透明，石蠟包埋，8 μm連續(xù)切片，蘇木精-伊紅染色。

1.3 免疫組織化學(xué)染色

材料經(jīng)4%多聚甲醛固定過夜后，放入蔗糖溶液中梯度脫水，OCT包埋劑包埋，連續(xù)冰凍切片，切片厚度20 μm，-20 ℃保存，用于GFAP免疫組織化學(xué)染色。反應(yīng)流程依次為：4%多聚甲醛后固定30 min；磷酸鹽緩沖液(PBS)浸洗(0.1 mol·L-1，pH7.2～7.6)，5 min×3次；3%H2O2室溫下避光20 min；PBS浸洗，5 min×3次；5%BSA封閉液，室溫孵育30 min；滴加一抗：Rabbit anti-GFAP(1∶200，博士德)，4 ℃孵育過夜；PBS浸洗，5 min×3次；滴加二抗：生物素標記羊抗兔IgG(博士德)，37 ℃孵育4 h；PBS浸洗，5 min×3次；滴加SABC(博士德)，37 ℃孵育30 min；PBS浸洗，5 min×3次；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色；水溶性封片劑封片。陰性對照實驗采用PBS代替一抗，其余步驟同上。

1.4 觀察與統(tǒng)計分析

切片于Olympus BX-51光學(xué)顯微鏡成像系統(tǒng)下進行觀察，拍照。每張切片隨機選取8個視野測量視網(wǎng)膜總厚度及各層厚度(單位：mm)。利用ImageJ隨機選取10個視野(40×10)，測定各組視網(wǎng)膜GFAP免疫陽性細胞的平均灰度值?；叶确譃?～256級，值越小，免疫陽性反應(yīng)越強。采用SPSS 17.0中的Kolmogorov-Smirnov檢驗所得實驗數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布后，再進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)。實驗結(jié)果以平均值±標準誤表示，顯著性水平設(shè)置為α=0.01(楊純，張育輝，2003)。

2 結(jié)果

2.1 秦嶺滑蜥視網(wǎng)膜顯微結(jié)構(gòu)

光學(xué)顯微鏡下可見秦嶺滑蜥視網(wǎng)膜從內(nèi)到外共分為10層：內(nèi)界膜、神經(jīng)纖維層、神經(jīng)節(jié)細胞層、內(nèi)網(wǎng)狀層、內(nèi)核層、外網(wǎng)狀層、外核層、外界膜、視桿視錐層、色素上皮層(圖版Ⅰ：1～3)。內(nèi)界膜為無細胞結(jié)構(gòu)的單層薄膜；神經(jīng)纖維層從視網(wǎng)膜的四周伸向中央視盤，中間厚、邊緣??；神經(jīng)節(jié)細胞層分布密度不均，從中央到邊緣由稠密逐漸稀疏，胞核較大，核仁明顯；內(nèi)網(wǎng)狀層最厚，由雙極細胞的軸突、無長突細胞的樹突和節(jié)細胞的樹突組成；內(nèi)核層3～5層，胞核圓，分布有雙極細胞、水平細胞、無長突細胞、網(wǎng)間細胞和Müller細胞等；外網(wǎng)狀層主要是內(nèi)核層的纖維末梢與內(nèi)核層的水平細胞、雙極細胞的神經(jīng)突起接合的地方，也含有Müller細胞的纖維側(cè)枝；外核層由2層感光細胞核組成，核周質(zhì)較少，2層細胞核交錯排列，靠近外界膜一層的核較大，卵圓形，為視錐細胞核，靠近外網(wǎng)狀層一層的核較小，圓形，為視桿細胞核；外界膜由Müller細胞的外突以及視桿細胞和視錐細胞的連接復(fù)合體形成；視桿視椎層由視桿細胞和視錐細胞的內(nèi)、外節(jié)組成；色素上皮層位于視網(wǎng)膜最外側(cè)，細胞呈柱形，胞核偏于外側(cè)，胞質(zhì)內(nèi)密布黑色素顆粒，大量含有色素顆粒的突起向內(nèi)延伸至緊鄰的視桿視錐層的外節(jié)處，與脈絡(luò)膜交界。

2.2 不同年齡組視網(wǎng)膜各層厚度和胞核數(shù)的比較

不同年齡組秦嶺滑蜥視網(wǎng)膜的10層結(jié)構(gòu)均清晰易辨(圖版Ⅰ：1～3)。單因素方差分析結(jié)果顯示，亞成體和成體視網(wǎng)膜總厚度較幼體明顯增加(P<0.01)，但三者之間的神經(jīng)節(jié)細胞層、外界膜以及視桿視錐層厚度無明顯差異。從幼體經(jīng)亞成體到成體，神經(jīng)纖維層、內(nèi)網(wǎng)狀層、內(nèi)核層、外網(wǎng)狀層、外界膜逐漸增厚，而內(nèi)界膜、神經(jīng)節(jié)細胞層、外核層、色素上皮層、視桿視錐層先增厚再變薄。與幼體相比，亞成體視網(wǎng)膜中內(nèi)界膜和外核層厚度顯著增加，其他無明顯差異；成體視網(wǎng)膜中神經(jīng)纖維層、內(nèi)網(wǎng)狀層、內(nèi)核層、外網(wǎng)狀層、外核層和色素上皮層厚度顯著增加(表1)。

表1 不同年齡組秦嶺滑蜥視網(wǎng)膜各層厚度比較Table 1 The thickness of the retinal layers of Scincella tsinlingensis at different ages

注： 同行數(shù)據(jù)中， 標有完全不同的小寫字母表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)

Note： In the same column， difference is significant with the completely different lowercase letters (P<0.01)

秦嶺滑蜥個體發(fā)育過程中，視網(wǎng)膜細胞核層數(shù)變化不大。外核層和神經(jīng)節(jié)細胞層細胞核層數(shù)相當(dāng)，內(nèi)核層細胞核數(shù)目較多(表2)。

表2 不同年齡組秦嶺滑蜥視網(wǎng)膜細胞核層數(shù)Table 2 Layer number of nucleus in the retina of Scincella tsinlingensis at different ages

2.3 不同階段視網(wǎng)膜GFAP陽性表達變化

不同年齡組視網(wǎng)膜GFAP免疫陽性主要定位于內(nèi)界膜和神經(jīng)纖維層，且以神經(jīng)纖維層陽性最強。GFAP陽性表達呈現(xiàn)成體最強、幼體較強、亞成體最弱的年齡相關(guān)性(表3)。在亞成體階段，可觀察到視桿視錐層有少量GFAP陽性表達，視網(wǎng)膜其余各層均未見GFAP陽性表達(圖版Ⅰ：4～9)。

表3 不同年齡組秦嶺滑蜥視網(wǎng)膜膠質(zhì)纖維酸性蛋白表達灰度值比較Table 3 Comparison of the gray levels of retinal glial fibrillary acidic protein expression of Scincella tsinlingensis at different ages

注Note：*P<0.01

圖版Ⅰ 不同年齡組秦嶺滑蜥視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)及膠質(zhì)纖維酸性蛋白的陽性表達
PlateⅠ Microstructure and immunohistochemical localization of glial fibrillary acidic protein (GFAP) in the retina ofScincellatsinlingensisat different ages

1～3. 秦嶺滑蜥視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)(1. 幼體， 2. 亞成體， 3. 成體)， 4～9. 秦嶺滑蜥視網(wǎng)膜GFAP免疫組織化學(xué)定位， GFAP陽性細胞呈棕黃色(4、 7. 幼體， 5、 8. 亞成體， 6、 9. 成體)； RPE. 色素上皮層， RCL. 視桿視錐層， OLM. 外界膜， ONL. 外核層， OPL. 外網(wǎng)狀層， INL. 內(nèi)核層， IPL. 內(nèi)網(wǎng)狀層， GCL. 神經(jīng)節(jié)細胞層， NFL. 神經(jīng)纖維層， ILM. 內(nèi)界膜

1-3. the microstructure of the retinal layers (1. juvenile， 2. subadult， 3. adult)， 4-9. immunohistochemical localization of GFAP in the retina， GFAP positive cells are brown (4， 7. juvenile， 5， 8. subadult， 6， 9. adult)； RPE. retinal pigment epithelium， RCL. layer of rods and cones， OLM. outer limiting membrane， ONL. outer nuclear layer， OPL. outer plexiform layer， INL. inner nuclear layer， IPL. inner plexiform layer， GCL. ganglion cells layer， NFL. nerve filament layer， ILM. inner limiting membrane

3 討論

秦嶺滑蜥的視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)與大多數(shù)脊椎動物相似，從內(nèi)到外共分為10層。晝行性動物和夜行性動物視網(wǎng)膜的主要差異之一是感光細胞和神經(jīng)節(jié)細胞的數(shù)目之比不同。前者視網(wǎng)膜、外核層和神經(jīng)節(jié)細胞層的細胞數(shù)目相當(dāng)，且細胞核層數(shù)較少，內(nèi)核層細胞核數(shù)目較多，而后者視網(wǎng)膜外核層的細胞數(shù)目遠多于神經(jīng)節(jié)細胞層(鮑義恒，陳云俊，1979；王厚華等，1980；張育輝，劉家坤，1994；張育輝，賈林芝，2003)。秦嶺滑蜥視網(wǎng)膜的外核層和神經(jīng)節(jié)細胞層細胞數(shù)目之比均相當(dāng)，細胞核層數(shù)上，外核層1～2層，神經(jīng)節(jié)細胞層3～4層，而內(nèi)核層6～8層，符合晝行性動物視網(wǎng)膜的特征，故推測秦嶺滑蜥為晝行性動物。

秦嶺滑蜥、銅蜥Lygosomaindicum、北草蜥Takydromusseptentrionalis及麗斑麻蜥Eremiasargus均為晝行性動物，捕食主要依賴視覺，視網(wǎng)膜總厚度相近，各層厚度也較接近，其中，視桿視錐層和外核層細胞核層數(shù)均較少，相對較薄，且以視錐細胞的錐部為主，視錐細胞比視桿細胞粗短，細胞核較少但直徑較大；它們與夜行性或晨昏性活動的無蹼壁虎、耳疣壁虎Gekkoauriverrucosus視網(wǎng)膜總厚度相差較大，后者的視桿視錐層和外核層細胞核層數(shù)均較多，相對較厚，以視桿細胞為主，且比視錐細胞細長而密集，細胞核較多但直徑較小，這有助于增加吸收光線的面積，從而提高光敏度，有利于夜間活動(張育輝，賈林芝，2003)。秦嶺滑蜥亞成體和成體視網(wǎng)膜總厚度較幼體明顯增加，但三者神經(jīng)節(jié)細胞層、外界膜以及視桿視錐層厚度之間無明顯差異。幼體視桿視錐層較薄，其中視桿細胞較多而視錐細胞較少，與其活動性較弱相適應(yīng)。亞成體活動性逐漸增強，視網(wǎng)膜的視桿視錐層亦增厚，利于白天活動。成體視桿視錐層最薄，視桿視錐層結(jié)構(gòu)改變，主要由視錐細胞較為粗短的錐部組成。與幼體相比，亞成體和成體視網(wǎng)膜總厚度增加極顯著，亞成體視網(wǎng)膜中內(nèi)界膜和外核層厚度顯著增加，成體視網(wǎng)膜中神經(jīng)纖維層、內(nèi)網(wǎng)狀層、內(nèi)核層、外網(wǎng)狀層、外核層和色素上皮層厚度顯著增加。上述結(jié)果表明，秦嶺滑蜥視網(wǎng)膜各層厚度與年齡呈相關(guān)性，反映其視覺功能的發(fā)育特點。

GFAP是膠質(zhì)細胞特有的一種中間絲蛋白，用于標記分化的膠質(zhì)細胞(Sueishietal.，1996；孫慶艷等，2004)，參與細胞支架重組、髓鞘形成、細胞黏附和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等復(fù)雜過程(Biginietal.，2001；薛黎萍等，2010；鄧海波等，2012)。GFAP主要在秦嶺滑蜥視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層的Müller細胞中分布，與Sassoè等(1992)的報道一致：Müller細胞內(nèi)側(cè)端的胞體、突起和膨大的終足是GFAP陽性顆粒分布的主要區(qū)域。GFAP陽性表達呈現(xiàn)幼體較強，亞成體最弱，而成體最強的年齡相關(guān)性。秦嶺滑蜥幼體階段視網(wǎng)膜Müller細胞表達GFAP較強，這可能是由于Müller細胞膠質(zhì)化增生在視網(wǎng)膜早期階段具有修復(fù)作用(鄧海波等，2012)。Müller細胞中GFAP表達變化類似星形膠質(zhì)細胞損傷后的反應(yīng)，星形膠質(zhì)細胞GFAP表達增加表現(xiàn)為反應(yīng)性星形膠質(zhì)化，且GFAP在其細胞內(nèi)的分布對于星形膠質(zhì)細胞突起的形成和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定至關(guān)重要(柯技等，2007)。Müller細胞與吞噬細胞相似，能夠清除神經(jīng)元變性壞死產(chǎn)生的碎片及代謝產(chǎn)物，避免這些物質(zhì)對周圍存活神經(jīng)元產(chǎn)生毒性作用，并且活化的Müller細胞能夠合成和分泌多種細胞因子，如神經(jīng)生長因子(NGF)、堿性成纖維生長因子(bFGF)、細胞粘連分子(跨膜糖蛋白CIM)、層粘連蛋白、纖維粘連蛋白及其他細胞外基質(zhì)組成成分(Hottaetal.，1995)，對維持神經(jīng)元的生存、發(fā)育、再生和分化有重要作用(Schellinietal.，1995)。據(jù)此推測Müller細胞能夠維持秦嶺滑蜥視網(wǎng)膜穩(wěn)定，對視神經(jīng)增殖和生長發(fā)育也有一定的影響，為再生視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞提供豐富的黏著基質(zhì)，從而起支持作用(Romero-Alemánetal.，2004；王智超等，2008)。

綜上所述，秦嶺滑蜥視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)與其生活習(xí)性相適應(yīng)，GFAP陽性表達的年齡相關(guān)性變化反應(yīng)其視覺功能的發(fā)育特點，并可能與視網(wǎng)膜的生理功能調(diào)節(jié)相關(guān)。