楊曈， 姜德純， 黨寧馨， 李家堂*

(1. 中國科學(xué)院成都生物研究所， 中國科學(xué)院山地生態(tài)恢復(fù)與生物資源利用重點(diǎn)實驗室，生態(tài)恢復(fù)與生物多樣性保育四川省重點(diǎn)實驗室， 成都610041； 2. 中國科學(xué)院大學(xué)，北京100049)

無尾目Anura是現(xiàn)存兩棲類中生物多樣性最豐富的類群，約占兩棲綱物種總數(shù)的88%，分布于森林、草地、河流、瀑布、沼澤、山地和沙漠等多種生態(tài)環(huán)境中(費(fèi)梁等，2009；Frost，2018)。樹棲性兩棲類廣泛分布于世界各地，但是分布在中國的僅有樹蛙科Rhacophoridae的部分物種和雨蛙科Hylidae雨蛙屬Hyla物種，雨蛙科物種在中國的種類較少，東亞地區(qū)是雨蛙科分布的北緣(費(fèi)梁等，2009；Frost，2018)。樹蛙科起源于非洲并向亞洲擴(kuò)散(Bossuyt & Milinkovitch，2000)，雨蛙科遍布于溫帶歐亞大陸的大部分地區(qū)(Smithetal.，2005)，雨蛙屬起源于北美，通過白令海峽的2次物種擴(kuò)散事件擴(kuò)散到歐亞大陸(Lietal.，2015)。雖然樹蛙科和雨蛙科有不同的生物地理學(xué)起源，但是它們相似的樹棲生活環(huán)境和生活方式使其具有相近的形態(tài)特征和行為模式(Lietal.，2013，2015)。

此前的研究表明，蛙類的形態(tài)學(xué)和棲息地之間有直接的聯(lián)系(Manzanoetal.，2008；Guimar?esetal.，2014)，但是這些研究大多集中在功能形態(tài)方面，例如，Gray等(1997)關(guān)于無尾目前肢進(jìn)化的研究提出，樹棲蛙類的前肢在捕食過程中具有復(fù)雜的移動模式，這些行為至少由3次獨(dú)立進(jìn)化而來；Manzano等(2008)研究了2種樹棲蛙類的前肢和手部肌肉組織的功能形態(tài)學(xué)。但是對蛙類運(yùn)動模式的研究并沒有明確涉及到樹棲環(huán)境或系統(tǒng)發(fā)育的影響(Nauwelaerts & Aerts，2006)。本研究填補(bǔ)了無尾目形態(tài)、棲息地與系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系三者之間研究的空白。

雖然一些研究采用了系統(tǒng)發(fā)育比較方法，但是有的只用了連續(xù)數(shù)據(jù)(Garlandetal.，1992)，有的只用了離散數(shù)據(jù)(Pagel，1994；Dangetal.，2017)。系統(tǒng)發(fā)育獨(dú)立差(phylogenetically independent contrasts，PIC)是用來研究遺傳自祖先特征相關(guān)進(jìn)化的方法(Garlandetal.，1992)，可以用來分析連續(xù)數(shù)據(jù)。例如，Guimar?es等(2014)利用PIC方法對Chironius屬的樹棲生境和心臟位置的形態(tài)適應(yīng)進(jìn)行了分析。

Dang等(2017)提出，蛙類手的長度增加可能在對樹棲環(huán)境的適應(yīng)中發(fā)揮作用，但這只是推測，需要更大的樣本量來驗證。為了完善這一推測，本研究利用連續(xù)形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)和離散的生境特征，并結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，使用PIC方法探究無尾兩棲類前肢形態(tài)和棲息地之間的關(guān)系，并探究不同的進(jìn)化動力是否在不同的性狀形成過程中起作用。

1 材料和方法

1.1 樣本選擇

本研究選取隸屬于無尾目7科31屬629號保存完好的浸泡標(biāo)本進(jìn)行形態(tài)學(xué)測量。樣品包括樹棲蛙類2科(樹蛙科和雨蛙科)，非樹棲蛙類5科(蟾蜍科Bufonidae、角蟾科Megophryidae、鈴蟾科Bombinatoridae、叉舌蛙科Dicroglossidae和姬蛙科Microhylidae)。根據(jù)形態(tài)學(xué)描述和分布地數(shù)據(jù)鑒定物種，棲息地類型來源于Zhao和Adler(1993)、費(fèi)梁等(2012)的研究結(jié)果。

1.2 樣本測量

使用精確度為0.1 mm的數(shù)顯游標(biāo)卡尺對標(biāo)本進(jìn)行測量(圖1)：1)吻肛長(snout-vent length，SVL)：吻端到泄殖腔孔后緣之間的長度，2)前臂長(橈尺骨長radio-ulna length，RL)：橈尺骨遠(yuǎn)端到近端之間的長度，3)手長(hand length，HL)：第三指的遠(yuǎn)端到近側(cè)腕骨近端之間的長度。雖然有研究指出某些蛙類具有附生拇指(Masayoshi & Noriko，2009；Iwai，2013)，但在本研究中，指的順序參考費(fèi)梁等(2009)(表1)。每號標(biāo)本測量3次取平均值以減少測量誤差。同時，為了減小個體差異的影響，將相對前臂長(RL/SVL)和相對手長(HL/SVL)加入原始數(shù)據(jù)集(Zhao & Adler，1993；費(fèi)梁等，2012)。

圖1 樣本測量方法Fig. 1 Samples measurement

HL. 手長hand length， RL. 前臂長radio-ulna length， SVL. 吻肛長snout-vent length

1.3 統(tǒng)計分析

主成分分析(principal component analysis，PCA)是一種從復(fù)雜的數(shù)據(jù)集中提取主要信息的常用方法。使用PCA方法分析測量得到的形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)以了解各部分?jǐn)?shù)據(jù)對整體數(shù)據(jù)的影響。然后利用Wilcoxon秩和檢驗探究前臂長、手長與生境之間的關(guān)系。用PIC方法將系統(tǒng)遺傳信息納入到連續(xù)性狀相關(guān)進(jìn)化的統(tǒng)計分析中，以此來評價在結(jié)合了系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系后，Wilcoxon秩和檢驗的結(jié)果能否更好地解釋數(shù)據(jù)。如果Wilcoxon秩和檢驗與PIC方法的結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義(顯著性水平設(shè)置為α=0.05)，那么假設(shè)數(shù)據(jù)相關(guān)性不受系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的影響(Guimar?esetal.，2014)。從GenBank下載了31個無尾目物種的3個線粒體片段：12SrRNA(部分)、tRNA-Val(完整)和16SrRNA(部分)(表2)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，為形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)提供拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。具體步驟如下：使用MEGA6(Tamuraetal.，2013)對所下載的3個線粒體序列在默認(rèn)參數(shù)下進(jìn)行比對，利用最大似然法(Maximum-Likelihood，ML)重建系統(tǒng)發(fā)育樹，利用RAxML GUI1.5b1(Silvestro & Michalak，2012)中的GTR+I模型重建ML樹，以隨機(jī)樹為起始樹進(jìn)行快速自舉分析(rapid bootstrap analysis)，設(shè)置自舉檢驗為1 000的非參數(shù)自舉檢驗(nonparametric bootstrap，BSP)并單獨(dú)運(yùn)行搜索最佳ML樹。對棲息地數(shù)據(jù)進(jìn)行反正弦平方根轉(zhuǎn)換(Zar，2007)。使用過原點(diǎn)線性回歸評估形態(tài)學(xué)、生境和系統(tǒng)發(fā)育之間的關(guān)系(Garlandetal.，1992)。利用R 3.4.1(R Core Team，2017)進(jìn)行PIC分析，使用“ape”(Paradisetal.，2004)、“phytools”(Revell，2012)和“geiger”(Harmonetal.，2008)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

本研究使用RL、HL、RL/SVL和HL/SVL做PCA分析，提取出2個虛擬變量(PC1和PC2)，其中PC1代表RL、HL和RL/SVL，PC2代表HL/SVL，這2個主成分共解釋了整個數(shù)據(jù)集77%的方差。這一步的主要目的是為了了解所選擇的特征值是否可以將蛙類的棲息地很好地分開，從分析結(jié)果來看，樹棲蛙類和非樹棲蛙類有明顯區(qū)分，同時也揭示了基于RL和HL的清晰分組。這說明了RL和HL對整體數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)的重要作用，以及這些變量在后續(xù)分析中的相關(guān)性(圖2)。

圖2 樣品主成分分析散點(diǎn)分布Fig. 2 Principal component analysis plot distribution of samples

A. 所有樣本在虛擬變量下的分布狀態(tài)， B. 解釋向量與變量(手長和前臂長)有關(guān)

A. Interpreting points of all samples， B. The interpreting vectors correlative to variables (hand length and radio-ulna length)

Wilcoxon秩和檢驗的結(jié)果顯示，RL、RL/SVL、HL/SVL與棲息地之間的關(guān)系均有統(tǒng)計學(xué)意義(RL：P=1.16e-14，RL/SVL：P=1.77e-05，HL/SVL：P<2.2e-16)，但是HL與棲息地之間的關(guān)系無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.850 9)(表1，圖3)。

表1 Wilcoxon秩和檢驗與系統(tǒng)發(fā)育獨(dú)立差結(jié)果Table 1 The results of Wilcoxon rank sum test and phylogenetically independent contrasts (PIC)

圖3 樹棲蛙類和非樹棲蛙類前臂長和手長、相對前臂長和相對手長的比較結(jié)果Fig. 3 Comparison of radio-ulna length (RL) and hand length (HL)， RL/snout-vent length (SVL) and HL/SVL between arboreal and non-arboreal species

ML系統(tǒng)樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與此前對無尾目(Zhangetal.，2013)的研究結(jié)果一致(圖4)，結(jié)果支持無尾目的單系結(jié)構(gòu)，鈴蟾科和角蟾科為早先分化的類群。蟾蜍科和雨蛙科為姐妹群關(guān)系(BSP=100)，叉舌蛙科和樹蛙科聚為一單系支(BSP=93)，該單系與姬蛙科形成姐妹群關(guān)系(BSP=98)。樹蛙科、叉舌蛙科和姬蛙科形成的單系支與蟾蜍科和雨蛙科一支為姐妹群關(guān)系?？梢?，基于目前取樣數(shù)據(jù)，本研究涉及的雨蛙科和樹蛙科的樹棲生活類型為獨(dú)立進(jìn)化而來。在校正了系統(tǒng)發(fā)育的影響后，只有棲息地與HL/SVL之間的關(guān)系有統(tǒng)計學(xué)意義(r2=0.465 8，P=2.34e-05)(表1)。

圖4 基于線粒體12S rRNA(部分)、tRNA-Val(完整)、16S rRNA(部分)基因序列構(gòu)建的31種無尾兩棲類的最大似然樹Fig. 4 Phylogenetic relationship (as shown by Maximum-Likelihood tree) of 31 anurans inferred from 12S rRNA (partial)， tRNA-Val (complete) and 16S rRNA (partial) of mitochondrial genes

3 討論

本研究將前肢分為前臂和手分開測量。在校正個體大小差異前，手長與棲息地之間的關(guān)系經(jīng)過Wilcoxon秩和檢驗和PIC檢驗均無統(tǒng)計學(xué)意義，這個結(jié)果反映了樹棲蛙類體型的廣泛變化(Frost，2018)。校正個體大小差異后，相對手長的PIC和Wilcoxon秩和檢驗的結(jié)果顯示差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，這表明在樹棲蛙類手長的進(jìn)化中，樹棲環(huán)境比系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系起更重要的作用。Wilcoxon秩和檢驗結(jié)果顯示，前臂長和相對前臂長與棲息地關(guān)系的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，但是使用PIC方法去除系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的影響后，其差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，這表明即使去除了系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，前臂長本身就具有強(qiáng)烈的遺傳信號，即前臂長主要受遺傳的影響，受棲息地影響較弱。

綜上所述，樹棲蛙類的前肢相對于非樹棲蛙類較長是一種對樹棲環(huán)境的適應(yīng)，這與Gray等(1997)和Manzano等(2008)的研究結(jié)果吻合，本研究在這一基礎(chǔ)上進(jìn)一步揭示了樹棲蛙類前肢的延長主要是手在環(huán)境作用下的延長，在樹棲環(huán)境下的蛙類使用手通過一系列復(fù)雜的動作進(jìn)食(Grayetal.，1997)，手部要做出復(fù)雜的動作，必然出現(xiàn)相應(yīng)的形態(tài)學(xué)特化。而前臂長主要受遺傳因素的影響，與生境的關(guān)系并不明顯。靈長類在樹枝間移動需要手的抓握能力來保持身體平衡(Isler，2005)，Kirk等(2008)提出與非樹棲哺乳類相比，樹棲哺乳類有較長的手指。盡管本研究只測量了前臂長和手長，未將手長分為手掌和手指分別測量，但是樹棲蛙類前肢相對較長主要是由于手部延長這一觀點(diǎn)仍然與這個結(jié)論一致。本研究結(jié)果將有助于更好地了解前肢形態(tài)的進(jìn)化與生境之間的關(guān)系，進(jìn)而為無尾目物種的環(huán)境適應(yīng)性進(jìn)化研究提供支持。