朱雅婧，周亞麗，劉骕骦，魏家萍，劉小林，沈英姿，趙海紅，麻浩

（南京農業(yè)大學作物遺傳與種質創(chuàng)新國家重點實驗室，南京 210095）

0 引言

【研究意義】大豆（Glycine max[L.] Merrill）是世界上重要的經濟和糧食作物之一，也是中國的戰(zhàn)略性物資。高溫高濕、重金屬等非生物脅迫是制約大豆生產，影響種子發(fā)育及品質的重要因子。中國南方春大豆在種子生理成熟期（R6期—R7期），常處于高溫、多雨的季節(jié)，極易發(fā)生田間劣變，導致種子活力下降，嚴重制約了春大豆的生產[1-2]。另外，重金屬污染也是當前不容忽視的污染問題之一，中國受重金屬污染的耕地面積達 2.0×107hm2，約占全國耕地總面積的20%，造成糧食減產1.0×107t[3]。重金屬污染不僅嚴重影響作物生長發(fā)育，而且能夠通過食物鏈危害人體健康[4]。Cu、Cd是當今污染較為嚴重與普遍的重金屬，其對作物產生傷害的臨界濃度普遍較低，即使較低濃度的脅迫也會影響作物生長發(fā)育，進而降低產量、影響品質[5]。而大豆是對Cu、Cd較為敏感的作物，Cu、Cd脅迫會影響大豆根系活力和植株形態(tài)，最終造成大豆減產[3,6]。因此，選育高活力的逆境耐受性大豆新品種尤為迫切?！厩叭搜芯窟M展】種子活力是衡量種子質量的一個綜合指標，其與田間出苗率關系緊密，直接影響作物的產量和品質。一般情況下，當種子處于生理成熟期時，種子活力達到最大，隨后由于老化或者受到環(huán)境因素等的影響，會出現(xiàn)不可逆轉的質量下降變化，即種子劣變[7]。種子劣變后會導致種子貯藏力和種子質量下降，萌發(fā)及生長緩慢，發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和整齊率降低，嚴重時會導致生活力喪失，進而對生產造成嚴重損失[8-9]。高溫高濕脅迫是導致春大豆種子田間劣變發(fā)生的重要因素之一[10]。然而，目前有關種子田間劣變的分子機制研究尚不夠深入。本研究團隊在大豆種子田間劣變抗性的機制研究方面取得了一定進展，WANG等[11]從92份春大豆地方品種和推廣品種中篩選到了種子田間劣變抗性品種湘豆3號和不抗品種寧鎮(zhèn)1號，并通過差異蛋白質組學技術發(fā)現(xiàn)GmSBH1經高溫高濕脅迫后，在寧鎮(zhèn)1號中顯著上調表達；SHU等[12]研究表明，GmSBH1能夠響應高溫高濕脅迫，并參與種子活力形成；陶源[13]進一步以GmSBH1為誘餌蛋白，通過對大豆高溫高濕酵母雙雜交cDNA文庫進行篩選，得到一個可能與之互作的大豆重金屬相關域包含蛋白（Glycine maxheavy-metalassociated domain-containing protein，GmHMADP）。目前，重金屬域包含蛋白研究較多的主要是重金屬ATP 酶（heavy metal transporting ATPases，HMAs）與重金屬相關異戊二烯植物蛋白（heavy metalassociated isoprenylated plant proteins，HIPPs）。研究表明，HMAs不僅能夠轉運一些必需金屬離子（Cu+、Zn2+和Co2+），而且能夠運輸重金屬離子（Cu2+、Cd2+和Pb2+）[14-20]。HIPPs是含有金屬結合結構域（HMA）和 C–端異戊二烯基序（CaaX）的金屬伴侶。大量研究表明，HIPPs能夠參與重金屬的代謝和解毒、生物和非生物脅迫以及花和種子的發(fā)育[21-23]?！颈狙芯壳腥朦c】目前，有關重金屬域包含蛋白的研究主要集中在擬南芥和水稻等模式作物，在大豆中的研究較少?！緮M解決的關鍵問題】本研究克隆大豆GmHMADP，對其編碼的蛋白進行亞細胞定位，研究其在重金屬Cu、Cd以及高溫高濕脅迫下的表達水平及功能，以期為利用基因工程手段培育新的高活力的大豆抗性品種提供理論依據(jù)和實踐基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2015年9月至2017年12月進行。供試大豆材料為南京農業(yè)大學作物遺傳與種植創(chuàng)新國家重點實驗室麻浩教授課題組通過溫箱蝕化法對 92份南方春大豆地方品種和推廣品種篩選得到的種子田間劣變抗性品種湘豆3號與不抗品種寧鎮(zhèn)1號。試驗所需大腸桿菌 DH5α感受態(tài)細胞購自南京博爾迪生物技術公司；EHA105擬南芥遺傳轉化菌株由南京農業(yè)大學作物遺傳與種質創(chuàng)新國家重點實驗室保存；pMD19-T載體購自TaKaRa公司；植物瞬時表達載體pA7-GFP以及植物表達載體pBI121-GUS由南京農業(yè)大學作物遺傳與種質創(chuàng)新國家重點實驗室保存。

1.2 總DNA和RNA的提取及cDNA的合成

以2周苗齡的大豆幼葉為材料，采用CTAB法提取基因組總DNA；參照新型植物總RNA提取試劑盒說明書提取大豆材料的 RNA，并采用 TaKaRa公司RTase M-MLV試劑盒合成第一鏈cDNA，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 大豆GmHMADP的分離與氨基酸序列分析

根據(jù)NCBI公布的GmHMADP序列（GenBank登錄號XM_006580986.1），利用Primer Premier 5.0軟件設計引物（表1），分別以寧鎮(zhèn)1號和湘豆3號幼葉的DNA和cDNA為模板，對應引物進行擴增。PCR體系及反應程序參照LIU等[24]方法進行。PCR產物經1.5%的瓊脂糖電泳凝膠檢測后回收，并與 pMD19-T simple vector載體連接，轉化大腸桿菌DH5α，挑取陽性克隆送至南京鉑尚生物技術公司測序，并將正確的克隆命名為T-GmHMAD。并通過NCBI網站BLAST對同源性氨基酸序列進行搜索，并用DNAMAN軟件分析不同來源氨基酸序列的相似性。

表1 本研究所用引物序列Table 1 Sequences of primers used in this study

1.4 GmHMADP的表達分析

大豆種子用次氯酸鈉進行消毒，置于培養(yǎng)皿，25℃催芽2—3 d，隨后將萌動的種子播種于裝有營養(yǎng)土的花盆，置于室外自然條件下生長。生長至一節(jié)期（V1）時采集大豆植株的子葉、根、莖及葉；盛花期（R2）取花；盛莢期（R4）取幼莢和幼嫩的豆粒；完熟期（R8）取成熟的莢和成熟的豆粒，用于組織特異性表達分析。植株生長至種子生理成熟期（R7期）時，將植株轉移至光照培養(yǎng)箱中進行高溫高濕處理。處理：白天40℃、RH 100%、10 h/黑夜30℃、RH 70 %、14 h；對照：白天30℃、RH 75 %、10 h/黑夜20℃、RH 70 %、14 h。分別收獲處理及對照組0、6、12、24、48、96和168 h的種子，用于高溫高濕脅迫下的表達模式分析。大豆種子消毒后，播種于1/2 MS固體培養(yǎng)基于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，將發(fā)芽的種子轉移至水培營養(yǎng)液中固定生長，培養(yǎng)7 d后，將長勢一致的幼苗分別移至含有 0（空白對照）、50、100 和 200 μmol·L-1的CuSO4與CdCl2的水培營養(yǎng)液中，培養(yǎng)處理24 h。每個處理各選取10棵大豆幼苗的根系用于Cu、Cd脅迫下的表達模式分析。

所有樣品迅速用液氮冷凍5 min，于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。qRT-PCR參照WANG等[10]方法進行，所有試驗均設置3次獨立的生物學重復。

1.5 GmHMADP蛋白的亞細胞定位

以T-GmHMAD為模板擴增回收目的片段，用限制性內切酶XhoⅠ和SalⅠ酶切載體pA7-GFP，采用同源重組法將目的基因構建到pA7-GFP表達載體上，獲得35S::GmHMAD-GFP融合蛋白表達載體。取新鮮幼嫩的煙草葉片平鋪在MS培養(yǎng)基上，22℃培養(yǎng)3—4 h。采用PDS-1000/He基因槍（Bio-Rad）轉化煙草葉片的葉肉細胞，黑暗條件下23℃培養(yǎng)12—16 h，于激光共聚焦顯微鏡下觀察GFP蛋白表達信號。

1.6 擬南芥轉化及轉基因純合植株的獲得

用限制性內切酶XbaⅠ和BamHⅠ酶切植物表達載體 pBI121-GUS，通過同源重組法獲得 pBI121-GmHMADP::GUS重組質粒，并采用農桿菌介導法轉化野生型擬南芥（WT）。經篩選鑒定得到 3個GmHMADP過表達陽性株系 HMADP-1、HMADP-3和HMADP-6，分別收獲純合的T3代轉基因種子進行功能分析試驗。

1.7 GmHMADP轉基因純合 T3擬南芥的脅迫處理及表型分析

將純合的GmHMADP過表達株系HMADP-1、HMADP-3和 HMADP-6以及野生型擬南芥種子播種于MS培養(yǎng)基，生長14 d后移至含有營養(yǎng)土和蛭石的花盆中，待黃熟期置于高溫高濕下處理2 d，以正常生長條件下的植株作對照。待種子收獲后，處理組和對照組的擬南芥種子分別取 100粒點播于MS培養(yǎng)基上，播種后第 1天至第7天，每天記錄種子的發(fā)芽數(shù)，統(tǒng)計種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)及平均發(fā)芽天數(shù)。此外，將野生型擬南芥種子和GmHMADP過表達株系 T3代種子分別播種于含有 1 μmol·L-1CuSO4、CdCl2的 MS 培養(yǎng)基上，生長6 d后，將部分幼苗分別轉移至含有50 μmol·L-1CuSO4、CdCl2的MS培養(yǎng)基上，繼續(xù)培養(yǎng)生長10 d，觀察植株的表型，并統(tǒng)計分析幼苗的主根長以及干重，根長與干重均以30株計算。所有試驗均設置3次重復。

1.8 數(shù)據(jù)處理

利用軟件DPS進行方差（ANOVA）分析，檢測差異顯著性。

2 結果

2.1 GmHMADP的分離與氨基酸序列分析

分別以湘豆3號和寧鎮(zhèn)1號的cDNA為模板，利用特異性引物（表1）進行PCR擴增，得到1條996 bp的條帶，經測序發(fā)現(xiàn)該基因的cDNA序列在2個品種間沒有差異。進一步分別以湘豆3號和不抗品種寧鎮(zhèn)1號葉片DNA為模板進行PCR擴增，得到1814 bp的GmHMADP的DNA序列，將測序得到的cDNA與DNA序列進行比對，發(fā)現(xiàn)GmHMADP由4個外顯子和3個內含子組成（圖 1-A）。通過NCBI網站對GmHMADP進行BLASTP搜索，并將與其相似性高的大豆（Glycine max，KRH54159.1）、赤豆（Vigna angularis，XP_017420608.1）、綠豆（Vigna radiata，XP_014500166.1）和狹葉羽扇豆（Lupinus angustifolius，XP_019464718.1）進行比對，發(fā)現(xiàn)僅有大豆（Glycine max，KRH54159.1）的氨基酸序列相似性最高，達99%。同時，這些蛋白均含有HMA結構域，并且具有2個金屬離子結合位點特征序列CXXC（圖1-B）。

2.2 GmHMADP的亞細胞定位

利用基因槍介導法將構建的融合表達載體 35S::GmHMADP-GFP和 35S::GFP分別轉入煙草葉肉細胞，并對煙草葉肉細胞中的GFP蛋白信號進行觀察，發(fā)現(xiàn)35S::GmHMADP-GFP融合蛋白信號分布在細胞核與細胞膜上，且分別與核Marker蛋白mCherry和膜Marker蛋白pm-ck CD3-1001信號重合（圖2）。結果表明，GmHMADP編碼的產物定位于細胞核與細胞膜上。

圖1 GmHMADP結構示意圖及GmHMADP與其他物種氨基酸序列多重比對Fig. 1 Schematic representation of the gene structures GmHMADP and multiple alignment of the GmHMADP amino acid sequences and other plants

2.3 GmHMADP的組織表達分析

為了解GmHMADP在大豆不同組織器官中的表達特性，分別調查GmHMADP在湘豆 3號和寧鎮(zhèn) 1號2個品種中根、莖、葉、花、子葉、發(fā)育中的莢、成熟的莢、發(fā)育中的種子以及成熟的種子中的表達情況。qRT-PCR結果表明，GmHMADP在2個品種的各組織器官中均有表達，且在發(fā)育中的種子和成熟的種子中表達量較高（圖3）。

2.4 大豆種子發(fā)育過程中GmHMADP的表達特性

組織表達研究表明，GmHMADP在種子中表達量較高，因此進一步對GmHMADP在湘豆3號和寧鎮(zhèn)1號的種子發(fā)育過程中的表達水平進行了檢測。結果表明，在2個品種的種子發(fā)育過程中，GmHMADP總體呈先上升后下降的表達趨勢，且在花后40 d表達量達到最高（圖4）。以上結果表明，GmHMADP可能參與了種子發(fā)育過程。

2.5 高溫高濕脅迫下GmHMADP的表達特性

大豆植株在種子生理成熟期經高溫高濕脅迫處理后，在不抗品種寧鎮(zhèn)1號種子中，GmHMADP在脅迫處理48、96和168 h時表達量顯著（P＜0.01）上升（圖5-A），

而在抗性品種湘豆3號中，該基因在處理24、48、96和168 h時表達量顯著（P＜0.01）上升（圖5-B）。以上結果表明，GmHMADP響應了高溫高濕脅迫，并推測其可能參與了春大豆種子田間劣變抗性過程。

圖2 GmHMADP在煙草葉肉細胞中的亞細胞定位Fig. 2 Subcellular localization of GmHMADP protein in N.benthamiana mesophyll cells

圖3 大豆不同組織器官中GmHMADP的相對表達量Fig. 3 The relative expression of GmHMADP gene in different soybean organs

圖4 大豆種子發(fā)育過程中GmHMADP的相對表達量Fig. 4 The relative expression of GmHMADP gene in developing soybean seed

圖5 高溫高濕脅迫下的大豆種子中的GmHMADP的相對表達量Fig. 5 The relative expression of GmHMADP gene in soybean seeds under HTH stress

2.6 Cu、Cd脅迫下GmHMADP的表達特性

為了進一步研究GmHMADP對重金屬脅迫的響應特征，通過qRT-PCR技術對不同濃度CuSO4、CdCl2處理24 h的大豆幼苗中的GmHMADP進行表達模式分析。在寧鎮(zhèn)1號幼苗的根中，50 μmol·L-1CuSO4和200 μmol·L-1CdCl2脅迫下GmHMADP表達量顯著（P＜0.01）高于對照；在抗性品種湘豆3號中，不同濃度CuSO4、CdCl2脅迫處理后，GmHMADP表達量均顯著（P＜0.01）上調（圖 6-A 與圖 6-B）。表明GmHMADP受Cu2+和Cd2+的誘導表達，推測其可能參與重金屬Cu和Cd的脅迫。

2.7 高溫高濕脅迫下 GmHMADP過表達擬南芥種子的活力分析

研究表明，正常生長條件下收獲的 WT和GmHMADP過表達植株的種子在第 7天的發(fā)芽率均能達到90%以上，且均能正常生長成為幼苗，而在高溫高濕環(huán)境下收獲的各個株系種子的發(fā)芽率均有所下降，但GmHMADP過表達擬南芥株系的下降幅度最小，情況優(yōu)于WT（圖7-A）；表2顯示，在高溫高濕環(huán)境中收獲的WT和GmHMADP過表達植株種子發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)以及活力指數(shù)均明顯低于在正常生長環(huán)境中收獲的種子，但GmHMADP過表達株系種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均顯著（P＜0.01）優(yōu)于WT；而且脅迫后GmHMADP過表達植株種子的平均發(fā)芽天數(shù)明顯（P＜0.01）較WT種子短。結果表明，GmHMADP過表達株系的種子活力顯著高于野生型。

圖6 不同濃度CuSO4和CdCl2處理下的大豆幼苗根中的GmHMADP的相對表達量Fig. 6 The relative expression of GmHMADP gene under different concentration of CuSO4 and CdCl2 stress in soybean seedling roots

表2 高溫高濕處理對擬南芥種子萌發(fā)特性的影響Table 2 The Effect of HTH stress on germination of Arabidopsis seeds

2.8 Cu、Cd脅迫下GmHMADP過表達擬南芥的耐性分析

研究表明，經過 1 μmol·L-1CuSO4處理后，GmHMADP過表達擬南芥株系幼苗的根長均長于WT，且過表達株系HMADP-2和HMADP-3達到顯著水平（P＜0.05）；50 μmol·L-1CuSO4處理下GmHMADP過表達擬南芥株系的根長均顯著（P＜0.01）長于WT（圖8-A、圖8-C和圖8-E）；經過1和50 μmol·L-1CdCl2處理后，GmHMADP過表達株系的根長均顯著（P＜0.01）長于WT（圖8-B、圖8-D和圖8-F）。通過對GmHMADP過表達擬南芥株系以及WT植株幼苗的干重進行測定，結果表明，低濃度與高濃度的CuSO4和CdCl2脅迫下，GmHMADP過表達擬南芥株系的干重均顯著（P＜0.05）高于WT（圖8-G和圖8-H）。以上結果表明，GmHMADP在擬南芥中過表達能夠提高對Cu、Cd脅迫的抗性。

圖7 高溫高濕脅迫對擬南芥種子發(fā)芽率的影響Fig. 7 Effect on germination percentage of Arabidopsis seeds under HTH stress

3 討論

本研究分離了大豆重金屬相關域包含蛋白基因GmHMADP，并通過氨基酸多重序列比對發(fā)現(xiàn)其含有HMA保守結構域，而且具有2個金屬離子結合位點特征序列 CXXC。含有重金屬相關結構域（heavymetal-associated domain，HMA）的蛋白能夠通過與細胞內各種酶和輔因子結合完成金屬離子的時空運輸，從而對重金屬轉運、解毒起重要作用[25]。表明GmHMADP可能與含有HMA結構域的基因在植物生命活動中發(fā)揮相似的功能。已有研究表明，含有HMA結構域的HMAs家族蛋白多定位于細胞膜與液泡膜，參與重金屬的轉運[26-28]；HIPPs家族蛋白多定位于細胞核，參與冷害、鹽害和干旱等非生物脅迫[21-23,29]。此外，南京農業(yè)大學作物遺傳與種質創(chuàng)新國家重點實驗室前期研究表明，可能與 GmHMADP發(fā)生互作的GmSBH1蛋白定位于細胞核[12-13]。本研究亞細胞定位結果顯示GmHMADP編碼的蛋白定位于細胞核與細胞膜上，由此推測，GmHMADP與GmSBH1可能在細胞核上發(fā)生互作，并在重金屬轉運及非生物脅迫響應等方面發(fā)揮著作用，但需進一步研究驗證。

目前，關于含有HMA結構域基因的組織特異性表達分析表明，大麥HvHMA1在籽粒中的表達量較高，其參與谷物萌發(fā)期和灌漿期糊粉層細胞中 Cu2+和Zn2+的運輸[15]。水稻OsHMA2不僅在根尖成熟區(qū)表達[30-31]，同時也在花序、花藥、雌蕊、子房和胚芽中表達，能夠參與花序形成過程中及種子成熟階段Zn2+的運輸[32]。也有研究發(fā)現(xiàn)擬南芥AtHIPP3參與生物脅迫以及花和種子的發(fā)育[23]。本研究基因組織特異性表達結果顯示GmHMADP在種子中大量表達，表明GmHMADP可能參與種子發(fā)育。此外，本研究通過對高溫高濕脅迫下該基因在大豆種子中的表達模式進行分析，發(fā)現(xiàn)GmHMADP在轉錄水平上響應高溫高濕脅迫，與SHU等[12]研究中的可能與GmHMADP互作的GmSBH1蛋白在高溫高濕脅迫下的表達趨勢基本一致，由此推測GmHMADP可能通過與GmSBH1的互作協(xié)同響應高溫高濕脅迫。另外，本研究中高溫高濕脅迫處理后收獲的GmHMADP過表達擬南芥植株種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)以及活力指數(shù)均明顯優(yōu)于野生型擬南芥，且過表達株系種子的平均發(fā)芽天數(shù)明顯縮短，表明GmHMADP過表達可提高擬南芥的種子活力。

鎘的移動性強、毒性高，其位居“五毒重金屬”（汞、鎘、鉛、鉻、砷）第二位[33]。植物受到鎘脅迫，呼吸和光合作用受到影響，植株生長發(fā)育受到抑制，導致植株生物量下降，干質量減輕[34]。研究發(fā)現(xiàn)，鎘脅迫能夠抑制大豆、綠豆等豆科作物種子的萌發(fā)[35-36]。而銅是中國第四大農田重金屬污染源[37]，過量時能夠增強活性氧的產生，造成細胞損傷，影響植株生長，尤其是對根的生長有明顯的抑制作用，最終造成產量下降[6,38]。KULIKOVA等[6]研究表明，隨著銅濃度的增高，銅對大豆根生長的抑制率逐漸升高，當銅含量達到50 μmol·L-1時，根部生長完全停止。因此，對大豆抗銅、鎘脅迫分子機制的研究尤為重要。由于土壤中的Cu和Cd通常以離子態(tài)或絡合態(tài)進入植物體內，從而對植物產生毒害[3]，因此本研究以含有CuSO4和CdCl2的水培營養(yǎng)液對大豆幼苗處理 24 h，qRT-PCR結果表明，在不同濃度的 Cu2+、Cd2+處理下，湘豆 3號幼苗根中GmHMADP的表達量均顯著增加；而寧鎮(zhèn)1 號品種中，僅在 50 μmol·L-1CuSO4和 200 μmol·L-1CdCl2處理下GmHMADP表達量顯著增加。以上試驗結果表明GmHMADP在轉錄水平上能夠響應Cu和Cd脅迫。同時，本研究發(fā)現(xiàn)GmHMADP的cDNA序列在2個品種間并沒有差異，但經Cu、Cd處理后在寧鎮(zhèn)1號和湘豆3號2個品種中該基因表達存在明顯差異，那么這種現(xiàn)象究竟是由什么原因造成的呢？前人研究表明，啟動子序列差異影響下游基因表達[39-40]。因此，推測該結果可能是由于該基因上游啟動子序列在2個品種間存在一定差異，這仍需進一步研究驗證。另外，VERRET等[33]研究發(fā)現(xiàn)，在Zn、Cd和Co的毒害下，AtHMA4過表達促進了擬南芥根系的生長，增強了植株對重金屬脅迫的抗性。本研究通過對CuSO4、CdCl2處理下GmHMADP過表達擬南芥植株的根長以及干重的研究，發(fā)現(xiàn) CuSO4、CdCl2處理下轉基因擬南芥植株的根長以及干重均顯著高于野生型，表明GmHMADP可提高植株對Cu、Cd脅迫的耐受性。

圖8 不同濃度CuSO4、CdCl2對擬南芥幼苗的根長與干重的影響Fig. 8 Effect on root length and dry weight(DW) of Arabidopsis seedlings under different concentration of CuSO4 and CdCl2

4 結論

克隆獲得GmHMADP，其cDNA全長996 bp，由4個外顯子和3個內含子組成。GmHMADP蛋白定位于細胞核與細胞膜。GmHMADP的表達具有較高的組織特異性，在種子中表達量最高；同時，該基因的表達受高溫高濕和Cu、Cd脅迫的影響。GmHMADP能夠提高擬南芥的種子活力以及對Cu、Cd脅迫的耐性。