許巍，劉必林、2、3，陳新軍、2、3,桓夢(mèng)瑤

(1.上海海洋大學(xué) 海洋科學(xué)學(xué)院，上海 201306; 2.國(guó)家遠(yuǎn)洋漁業(yè)工程技術(shù)研究中心，上海 201306; 3.大洋漁業(yè)資源可持續(xù)開(kāi)發(fā)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306)

眼睛晶體是頭足類(lèi)重要視覺(jué)器官，由前后兩個(gè)半球組成，其功能與脊椎動(dòng)物的眼睛晶體相似[1]，主要用于輔助捕食和躲避敵害[2]，但是頭足類(lèi)與脊椎動(dòng)物眼睛晶體的生成原理和蛋白質(zhì)組差異明顯[3]。近年來(lái)，眼睛晶體越來(lái)越受到研究頭足類(lèi)的學(xué)者關(guān)注，被認(rèn)為是除耳石、角質(zhì)顎、內(nèi)殼之外，又一記錄頭足類(lèi)生活史信息的硬組織材料[4-7]，盡管它在年齡和生長(zhǎng)的研究上不如其他硬組織，但在微化學(xué)尤其個(gè)體發(fā)育期穩(wěn)定同位素的分析上比其他硬組織更有效、更可靠。為此，本研究中從眼睛晶體的尺寸、微結(jié)構(gòu)、微量元素和穩(wěn)定同位素等方面，回顧了其在頭足類(lèi)年齡、生長(zhǎng)、攝食、棲息和洄游等基礎(chǔ)生活史過(guò)程中的應(yīng)用，旨在為中國(guó)頭足類(lèi)基礎(chǔ)生物與生態(tài)學(xué)研究提供參考。

1 晶體結(jié)構(gòu)與組成

眼睛晶狀體(以下簡(jiǎn)稱(chēng)晶體)是眼球中重要的屈光裝置[8]，前后兩面交界處為赤道部，兩面的頂點(diǎn)分別為晶狀體前極、后極。頭足類(lèi)與脊椎動(dòng)物類(lèi)似，依靠晶狀體前后位置或曲度的變化，進(jìn)行視覺(jué)的調(diào)節(jié)。晶狀體由晶狀體囊和晶狀體纖維組成。晶狀體囊為一透明薄膜，完整地包圍在晶狀體外面。前囊下有一層上皮細(xì)胞，當(dāng)上皮細(xì)胞到達(dá)赤道部后，不斷伸長(zhǎng)、彎曲，移向晶狀體內(nèi)，成為晶狀體纖維。晶狀體纖維在一生中不斷生長(zhǎng)，并將舊的纖維擠向晶狀體的中心，并逐漸硬化而成為晶狀體核，晶狀體核外較新的纖維稱(chēng)為晶狀體皮質(zhì)[9]。

2 晶體尺寸

海洋生物眼睛晶體的大小一方面反映晶體自身的生長(zhǎng)，另一方面可反映生物個(gè)體本身的生長(zhǎng)。眼睛晶體的大小(直徑和質(zhì)量)已被嘗試用于魚(yú)類(lèi)的年齡和生長(zhǎng)的研究[10-12]。而對(duì)頭足類(lèi)眼睛晶體的相關(guān)研究開(kāi)展較少，有學(xué)者認(rèn)為，可通過(guò)建立眼睛晶體直徑與頭足類(lèi)胴長(zhǎng)的關(guān)系，或通過(guò)分析不同年齡頭足類(lèi)個(gè)體的眼睛晶體折射率的變化來(lái)研究頭足類(lèi)的生長(zhǎng)[13]。Hall[14]分析認(rèn)為，澳大利亞巨烏賊Sepiaapama眼睛晶體的直徑和濕質(zhì)量與雌、雄個(gè)體胴長(zhǎng)均呈線(xiàn)性關(guān)系。Northern[15]分析認(rèn)為，強(qiáng)壯桑椹烏賊Moroteuthisingen眼睛晶體的直徑和質(zhì)量與雌、雄個(gè)體胴長(zhǎng)及雄性個(gè)體的體質(zhì)量呈線(xiàn)性關(guān)系，而與雌性個(gè)體的體質(zhì)量呈指數(shù)關(guān)系，這是因?yàn)榇菩詡€(gè)體在性成熟后由于性腺的快速發(fā)育導(dǎo)致體質(zhì)量迅速增加，而此時(shí)眼睛晶體的生長(zhǎng)則非常緩慢。

3 晶體微結(jié)構(gòu)

3.1 晶體切片制作與觀察

Baqueiro-Cárdenas等[5]詳細(xì)介紹了頭足類(lèi)眼睛晶體切片的制作過(guò)程與觀察方法，Rodríguez-Domínguez等[6]在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)。切片的制作主要包括固定、脫鈣、脫水、沖洗、包埋等5個(gè)步驟：(1)固定，用中性福爾馬林或70%(體積分?jǐn)?shù)，下同)酒精浸泡晶體72 h；(2)脫鈣，用流水沖洗72 h，用脫鈣溶液(15%檸檬酸鈉和50%甲酸混合溶液)浸泡24 h后，更換脫鈣溶液繼續(xù)浸泡24 h，再用流水沖洗24 h；(3)脫水，在95%酒精溶液中浸泡1.5 h，然后每0.5 h更換1次酒精溶液，連續(xù)更換3次后改用100%酒精浸泡，每0.5 h更換一次酒精，連續(xù)更換3次；(4)沖洗，用超純水浸泡0.5 h后更換超純水再浸泡1 h；(5)包埋，在石蠟溶液中浸泡1 h后，更換溶液繼續(xù)浸泡1 h，最后再用新鮮的石蠟溶液繼續(xù)浸泡2 h。

切片染色主要包括失蠟、水化、染色、脫水、沖洗等5個(gè)步驟：(1)失蠟，超純水中浸泡20 min，每10 min換一次超純水；(2)水化，先用100%酒精浸泡5 min，再用95%酒精浸泡5 min，最后用蒸餾水浸泡10 min；(3)染色，在蘇木精溶液中浸泡4 min，然后流水沖洗5 min，并先后在1%磷鉬酸溶液和蒸餾水中浸2～3 s，再在伊紅溶液中浸泡1 min，然后先后分別在蒸餾水、1%磷鉬酸溶液和蒸餾水中浸2～3 s；(4)脫水，在95%酒精中浸泡2 min，再在100%酒精中浸泡4 min，每2 min換一次酒精；(5)沖洗，在超純水中浸泡10 min，每5 min更換一次超純水。

為了方便晶體微結(jié)構(gòu)的觀察，將制作好的晶體切片置于載玻片上，用膠頭滴管滴上清水；在連接有CCD的顯微鏡下(400×)對(duì)生長(zhǎng)紋進(jìn)行拍照，用圖像處理軟件對(duì)所拍圖片進(jìn)行拼圖處理。值得注意的是，在對(duì)晶體進(jìn)行連續(xù)拍照時(shí)，盡量在相鄰的兩個(gè)視野中至少保持有一個(gè)特殊標(biāo)記(圖1)，這樣可以確保后期圖片拼接的準(zhǔn)確性[5]。

3.2 晶體微結(jié)構(gòu)在年齡與生長(zhǎng)中的應(yīng)用

頭足類(lèi)眼睛晶體是除耳石、角質(zhì)顎和內(nèi)殼以外的少數(shù)硬組織之一，它由許多同心的纖維層組成[16]。Willekens等[17]和Clarke[18]先后在幾種頭足類(lèi)的眼睛晶體中發(fā)現(xiàn)這種同心生長(zhǎng)紋結(jié)構(gòu)，然而其形成的周期性主要存在三種不同觀點(diǎn)：第一種觀點(diǎn)認(rèn)為，晶體生長(zhǎng)紋與頭足類(lèi)實(shí)際日齡相符[5,19]，根據(jù)此假設(shè)，Agus等[20]估算地中海撒丁島海域的槍烏賊Loligovulgaris和福氏槍烏賊Loligoforbesii的壽命分別為17、18個(gè)月；第二種觀點(diǎn)認(rèn)為，晶體生長(zhǎng)紋與頭足類(lèi)實(shí)際日齡無(wú)關(guān)[14,21]，持這種觀點(diǎn)的學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在某些頭足類(lèi)當(dāng)中，其晶體生長(zhǎng)紋遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)實(shí)際日齡；第三種觀點(diǎn)認(rèn)為，晶體生長(zhǎng)紋的形成雖然具有周期性，但不是每日一紋，其沉積規(guī)律可能依種類(lèi)和生活環(huán)境的不同而變化[6]。

圖1 紅色腸腕蛸眼睛體圖片的拼接示意圖[5]Fig.1 Identifying marks in individual images to integrate a mosaic of eye lens in crystalline structure of octopus Enteroctopus megalocyathus [5]

4 晶體微量元素在棲息環(huán)境中的應(yīng)用

海洋生物的眼睛晶體與耳石、骨骼、鱗片等其他硬組織不同，它的鈣化程度為零，不太適合用作微量元素分析[22]。盡管如此，研究者們還是在魚(yú)類(lèi)眼睛晶體中探測(cè)到了Ba、Co、 Cu、Fe、Hg、Mn、Pb、Rb和Sr等微量元素[23]，它們與魚(yú)類(lèi)耳石、鱗片和鰭條中的微量元素種類(lèi)組成和含量不同[24-26]。Dove等[25]認(rèn)為，晶體中微量元素的富集與空間環(huán)境變化有關(guān)，Kingsford等[27]認(rèn)為，其與水深也存在關(guān)系。此外，研究中還發(fā)現(xiàn)，作為魚(yú)類(lèi)耳石中不容易檢出的Hg和Pb元素，在眼睛晶體中則易被檢出，這可以作為魚(yú)類(lèi)耳石微量元素研究的一個(gè)有力補(bǔ)充[25,27]。Gillanders[26]研究認(rèn)為，眼睛晶體微量元素可用作魚(yú)類(lèi)的種群判定。然而，至今未見(jiàn)到關(guān)于頭足類(lèi)眼睛晶體微量元素的研究報(bào)道。

5 晶體碳氮穩(wěn)定同位素

5.1 晶體斷面取樣方法

眼睛晶體蛋白質(zhì)含量可達(dá)50%[28]，故其比耳石更適合碳(δ13C)氮(δ15N)穩(wěn)定同位素的分析[29]。一般認(rèn)為，通過(guò)對(duì)眼睛晶體不同時(shí)間斷面碳氮穩(wěn)定同位素的分析，可以獲取頭足類(lèi)不同生活史階段的攝食生態(tài)信息，具體試驗(yàn)方法如下：(1)分離，取出晶體，移除晶體的遠(yuǎn)端，保留晶體的近端；(2)浸泡，用蒸餾水浸泡近端晶體5 min，使其充分吸水；(3)測(cè)量，用游標(biāo)卡尺測(cè)量浸泡處理過(guò)的近端晶體的直徑；(4)微取樣，在解剖鏡下，用無(wú)水酒精消毒過(guò)的寬頭鑷子，由晶體最外層向晶體核心剝?nèi)?.5 mm左右厚的晶體；(5)再測(cè)量，用游標(biāo)卡尺測(cè)量剝?nèi)【w后剩余晶體的直徑；(6)重復(fù)以上步驟(4)和(5)的過(guò)程，直至晶體核心部分直徑約為0.5 mm，依據(jù)晶體大小的不同可獲得若干個(gè)不同斷面的晶體樣品。

圖2 眼睛晶體取樣示意圖Fig.2 Schematic diagram of subsampling in eye lens

5.2 晶體碳氮穩(wěn)定同位素在攝食生態(tài)分析中的應(yīng)用

傳統(tǒng)的穩(wěn)定同位素法主要采用肌肉分析頭足類(lèi)的攝食生態(tài)[30-32]，由于肌肉自身新陳代謝的存在，它往往只能反映取樣前兩個(gè)月內(nèi)的攝食信息[33]。與魚(yú)類(lèi)的眼睛晶體相似，頭足類(lèi)的眼睛晶體缺少蛋白質(zhì)的合成和分解，因而幾乎不存在新陳代謝作用，即未有蛋白質(zhì)的更新[16]。因此，眼睛晶體各斷面層所包含的穩(wěn)定同位素信息反映了其形成時(shí)的攝食信息，通過(guò)對(duì)眼睛晶體不同斷面穩(wěn)定同位素的分析，可重建頭足類(lèi)個(gè)體發(fā)育期的攝食生態(tài)史。Parry[34]分析了14尾柔魚(yú)Ommastrephesbartramii和15尾鳶烏賊Sthenoteuthisoualaniensis的眼睛晶體不同斷面的δ15N，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著個(gè)體發(fā)育過(guò)程中胴長(zhǎng)的增加，δ15N不斷增加，這說(shuō)明柔魚(yú)和鳶烏賊捕食餌料的營(yíng)養(yǎng)級(jí)隨著個(gè)體發(fā)育不斷上升。Hunsicker[35]和Hunsikcer等[4]利用眼睛晶體的碳氮穩(wěn)定同位素分析了貝烏賊Berryteuthismagister不同生長(zhǎng)階段的攝食變化,以及在東白令海所處的生態(tài)地位。研究結(jié)果顯示，貝烏賊幼體到成體期營(yíng)養(yǎng)級(jí)上升1級(jí)，貝烏賊的食譜不是由餌料大小所決定，而是與該區(qū)域其他商業(yè)性捕撈魚(yú)類(lèi)享有共同的食譜范圍。

5.3 晶體碳氮穩(wěn)定同位素在棲息洄游分析中的應(yīng)用

近年來(lái)，基于角質(zhì)顎和內(nèi)殼碳氮穩(wěn)定同位素信息被廣泛用于頭足類(lèi)的棲息環(huán)境與洄游路線(xiàn)重建[33,36-41]。然而，關(guān)于眼睛晶體的相關(guān)研究目前僅有一篇報(bào)道[7]，該研究通過(guò)眼睛晶體的碳氮穩(wěn)定同位素分析了莖柔魚(yú)的起源及其洄游史策略，具體根據(jù)眼睛晶體δ13C和δ15N個(gè)體間的較大差異推斷莖柔魚(yú)的洄游路線(xiàn)比較復(fù)雜，并根據(jù)眼睛晶體核心層較低的δ13C推斷莖柔魚(yú)出生地在37°N以北。

6 展望

由于眼睛晶體生長(zhǎng)紋形成周期的不確定性，致使通過(guò)眼睛晶體微結(jié)構(gòu)直接研究頭足類(lèi)年齡和生長(zhǎng)受到了一定程度的限制，盡管如此，隨著基于眼睛晶體放射性同位素碳的年齡鑒定技術(shù)在魚(yú)類(lèi)中的應(yīng)用[42]，在頭足類(lèi)中的相關(guān)研究也值得期待。近年來(lái)，隨著分析手段不斷提升，頭足類(lèi)硬組織的微化學(xué)尤其碳氮穩(wěn)定同位素的分析被廣泛用于頭足類(lèi)基礎(chǔ)生態(tài)學(xué)研究。盡管角質(zhì)顎穩(wěn)定同位素均有一些報(bào)道[43-44]，但是新生的角質(zhì)顎無(wú)法與舊生的角質(zhì)顎分開(kāi)，故無(wú)法從時(shí)間序列上分析頭足類(lèi)的穩(wěn)定同位素。此外，角質(zhì)顎中存在的大量蛋白質(zhì)、角質(zhì)和色素也會(huì)影響同位素的測(cè)定結(jié)果[45]。內(nèi)殼的生長(zhǎng)不僅是長(zhǎng)度的生長(zhǎng)，而且其寬度也在生長(zhǎng)[46]，因此，從嚴(yán)格意義上來(lái)說(shuō)，沿長(zhǎng)度方向的截面不能完全反映頭足類(lèi)不同生長(zhǎng)階段的生態(tài)學(xué)信息[38-39]。頭足類(lèi)耳石主要成分為碳酸鹽(95%)，其蛋白質(zhì)含量較低[47-48]，且體積太小，因此，不適合用于碳氮穩(wěn)定同位素的分析，但適合用作微量元素分析[49-51]。頭足類(lèi)眼睛晶體與以上這幾種硬組織相比，在穩(wěn)定同位素的測(cè)定上有著明顯的優(yōu)勢(shì)。首先，眼睛晶體體積較大(直徑為10～20 mm)，能夠滿(mǎn)足穩(wěn)定同位素的測(cè)定；其次，眼睛晶體是一層一層的包裹式生長(zhǎng)，很容易剝落，因此，可以從時(shí)間序列上準(zhǔn)確的分析頭足類(lèi)的生活史信息。今后的研究中需要對(duì)比頭足類(lèi)耳石年齡，準(zhǔn)確掌握眼睛晶體各層斷面形成的確切時(shí)間，進(jìn)而重建頭足類(lèi)的棲息、洄游和攝食等生活史信息。