張敏瑩，徐東坡，方弟安，周彥鋒，劉凱

(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，農(nóng)業(yè)部長江下游漁業(yè)資源環(huán)境科學(xué)觀測實(shí)驗(yàn)站，江蘇 無錫 214081)

秀麗白蝦Exopalaemonmodestus隸屬于甲殼綱Crustacea、十足目Decapoda、長臂蝦科Palaemonidae、長臂蝦亞科Palaemoninae、白蝦屬Exopalaemon，在中國分布廣泛，是大中型淡水湖泊的蝦類優(yōu)勢種[1]。秀麗白蝦具有分布廣、產(chǎn)量高、殼薄味美、營養(yǎng)豐富、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高的特點(diǎn)，在中國淡水湖泊漁業(yè)中占有非常重要的地位。作為“太湖三寶”之一，秀麗白蝦在全太湖均有分布，年產(chǎn)量占太湖蝦類總產(chǎn)量的50%以上[2]。市場供應(yīng)的秀麗白蝦基本上來自野生資源，人工育苗和池塘養(yǎng)殖還處于試驗(yàn)探索階段[3-4]。關(guān)于秀麗白蝦的研究主要集中在食性[5]、生長[6]、耗氧率[7]、種群形態(tài)差異[8]、繁殖生物學(xué)[9]和資源變動(dòng)[10]等方面。而關(guān)于其分子生物學(xué)、代謝功能基因研究[11]，以及基于RAPD[12]、AFLP標(biāo)記[13]的遺傳多樣性分析較少，但有關(guān)不同地理種群秀麗白蝦線粒體DNA 16S rRNA基因序列的研究目前尚未見報(bào)道。

與核基因相比，動(dòng)物線粒體DNA為母系遺傳，且具有進(jìn)化速度快、不同基因片段核苷酸替代速率不同等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于物種鑒定、種群遺傳和系統(tǒng)發(fā)育等研究[14]。線粒體16S rRNA基因由于進(jìn)化速度適中，可用通用引物擴(kuò)增，當(dāng)前被廣泛應(yīng)用于魚、蝦、貝的種群差異及分化研究[15-17]。本研究中，以太湖、鄱陽湖和興凱湖3個(gè)地理種群秀麗白蝦作為研究對(duì)象，對(duì)其線粒體16S rRNA基因序列及種群遺傳分化進(jìn)行初步研究，旨在為秀麗白蝦種質(zhì)資源保護(hù)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用秀麗白蝦于2016年5—8月采集自太湖、鄱陽湖和興凱湖，每個(gè)種群采集約200尾個(gè)體。采樣網(wǎng)具為地龍網(wǎng)。樣品采集后立即用體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇固定，帶回實(shí)驗(yàn)室備用。

試驗(yàn)所用試劑購自大連寶生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 DNA抽提采用MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit(TaKaRa)，具體方法參照說明書。抽提所得DNA于-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR 擴(kuò)增、電泳與測序 用于擴(kuò)增的引物[16]分別為16SA：5′CGC CTG TTTAAC AAA AACAT 3′，16SB:5′CCG GTT GAA CTC AGA TCA3′。

引物由鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司合成。

PCR擴(kuò)增在ABI Veriti 96 Well Thermal Cycler多重控溫PCR儀上進(jìn)行。擴(kuò)增反應(yīng)體系(共20 μL)：Premix (TaKaRa TaqTMVersion 2.0 plus dye) 10 μL，16SA、16SB引物(20 mmol)各1 μL，模板DNA(20 ng/μL) 4 μL，ddH2O 4 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃下預(yù)變性3 min；94 ℃下變性40 s，53 ℃下退火40 s，72 ℃下延伸50 s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后在72 ℃下再延伸8 min。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)12 g/L瓊脂糖凝膠檢測，電泳緩沖液為1×TBE(pH 8.0)，電壓為5 V/cm，常溫下電泳，用E.B染色，相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)記為DL 2000 DNA Ladder Marker。PCR產(chǎn)物由鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司純化測序，測序引物與擴(kuò)增引物相同。共成功測序秀麗白蝦樣品129尾，其中，太湖種群(TH)54尾，鄱陽湖種群(PYH)42尾，興凱湖種群(XKH)33尾。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Clustal X1.81軟件對(duì)測得的序列進(jìn)行DNA Star、序列拼接、比對(duì)。采用MEGA 3.1軟件完成堿基組成、變異位點(diǎn)、轉(zhuǎn)換(si)與顛換(sv)比值(r=si/sv)、遺傳距離的分析。采用DNASP 5.10軟件分析單倍型。采用Arlequin 3.1軟件中的分子變異分析(Analysis of molecular variance，AMOVA)估算種群間和種群內(nèi)遺傳變異、遺傳分化系數(shù)(Gst)和基因流(Nm)。

2 結(jié)果與分析

2.1 秀麗白蝦mtDNA 16S rRNA基因

秀麗白蝦樣本經(jīng)PCR擴(kuò)增后得到單一清晰的16S rRNA基因片段，長度約580 bp(圖1)。

測序得到的序列經(jīng)Clustal X比對(duì)和人工校對(duì)后，經(jīng)NCBI中Blast比對(duì)，獲得486 bp的同源片斷，該片斷與秀麗白蝦線粒體16S rRNA部分序列(DQ 194971.1)一致性高達(dá)99%，確認(rèn)所測序列為秀麗白蝦線粒體16S rRNA的基因片斷。

注：M為DL2000 DNA Marker;1～10分別為10個(gè)秀麗白蝦樣本Note：M，DL2000 DNA Marker；1-10, 10 samples of Siberian prawn Exopalaemon modestus圖1 秀麗白蝦mtDNA16S rRNA基因片斷PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.1 PCR amplification electrophoresis of mtDNA 16S rRNA gene fragment of Siberian prawn Exopalaemon modestus

2.2 序列變異及單倍型分析

從129尾秀麗白蝦樣本中共檢出8種單倍型，單倍型Ⅰ序列見表1。

從所有樣本的486 bp序列中，共檢測到10個(gè)變異位點(diǎn)(占所測序列的2.06%)，分別位于第95、114、158、159、163、295、335、444、483和484位點(diǎn)上(表2)。其中，第484位為顛換位點(diǎn)(transversional pairs)，其余9個(gè)為轉(zhuǎn)換位點(diǎn)(transitional paris)。轉(zhuǎn)換位點(diǎn)個(gè)數(shù)和顛換位點(diǎn)個(gè)數(shù)的比值(r=si/sv)為9，與不同群體鲇Silurusasotus的16S rRNA基因序列的轉(zhuǎn)換、顛換位點(diǎn)數(shù)比值(r=9.14∶1)[15]接近。

表1 秀麗白蝦mtDNA 16S rRNA基因序列(單倍型Ι)Tab.1 HapⅠsequence of mtDNA 16S rRNA gene of Siberian prawn Exopalaemon modestus

表2 秀麗白蝦mtDNA 16S rRNA基因多態(tài)位點(diǎn)及單倍型Tab.2 Polymorphic loci and haplotypes in mtDNA 16S rRNA gene of Siberian prawn Exopalaemon modestus

注：·表示堿基相同

Note: · indicate the same base

從單倍型分布(表3)可見：太湖種群出現(xiàn)5種單倍型，鄱陽湖種群出現(xiàn)4種單倍型，興凱湖種群出現(xiàn)1種單倍型(Ⅳ)；其中，單倍型Ⅳ為第一優(yōu)勢單倍型，占樣本總數(shù)的41.86%，其次為單倍型Ⅰ，占樣本總數(shù)的37.20%；3個(gè)種群間未有共享單倍型，但2個(gè)種群間有共享單倍型，太湖和鄱陽湖種群共享單倍型Ⅰ，鄱陽湖和興凱湖種群共享單倍型Ⅳ。

表3 秀麗白蝦3個(gè)種群線粒體16S rRNA基因單倍型分布Tab.3 Distribution of haplotypes in mtDNA 16S rRNA gene of three populations of Siberian prawn Exopalaemon modestus

2.3 種群遺傳多樣性及中性檢驗(yàn)

狹義的遺傳多樣性是指生物種內(nèi)(包括同一種群內(nèi)及不同種群間)基因的變化。多態(tài)位點(diǎn)數(shù)(S)、單倍型多樣性(Hd)、核苷酸多樣性(Pi)和平均核苷酸差異數(shù)(K)常被用來度量種群遺傳多樣性，S、Hd、Pi和K值越大，表明種群的遺傳多樣性越豐富。3個(gè)種群秀麗白蝦的遺傳多樣性及中性檢驗(yàn)(Tajima’s D)結(jié)果表明(表4)：興凱湖種群只有一種單倍型，多態(tài)性參數(shù)(S、Hd、Pi和K)均為0；太湖種群的多態(tài)位點(diǎn)數(shù)S大于鄱陽湖種群，單倍型多樣性Hd略低于鄱陽湖種群，3個(gè)種群的核苷酸多樣性Pi均較低；太湖種群的平均核苷酸差異數(shù)K為1.366 01，鄱陽湖種群的K值為1.197 80；雖然太湖種群、鄱陽湖種群的Tajima’s D值均為負(fù)值，但在統(tǒng)計(jì)學(xué)上均未達(dá)到顯著偏離中性進(jìn)化的假說(P>0.1)。

表4 秀麗白蝦3個(gè)種群的遺傳多樣性及Tajima’s D檢驗(yàn)Tab.4 Genetic diversity index and Tajima’s D test of three populations of Siberian prawn Exopalaemon modestus

2.4 種群遺傳距離及AMOVA分析

基于Kimura 2-parameter的種群間和種群內(nèi)遺傳距離顯示，太湖種群和興凱湖種群間遺傳距離最小(0.001 62)，鄱陽湖種群內(nèi)的遺傳距離最大(0.002 83)(表5)。

將3個(gè)秀麗白蝦種群歸為一組進(jìn)行AMOVA分析，結(jié)果顯示，種群間的遺傳變異為29.58%，種群內(nèi)的遺傳變異為70.42%，遺傳分化系數(shù)Gst為0.295 8，基因流Nm為0.595 2。F0.01(2,126)=4.780，F(xiàn)=6.897>F0.01(2,126)，3個(gè)種群間遺傳存在極顯著性差異(P<0.01)(表6)。

表5秀麗白蝦3個(gè)種群16SrRNA基因遺傳距離

Tab.5Geneticdistanceamongthreepopulationsbasedon16SrRNAgeneofSiberianprawnExopalaemonmodestus

表6秀麗白蝦3個(gè)種群線粒體16SrRNA基因序列AMOVA分析

Tab.6Analysisofmolecularvariance(AMOVA)ofmtDNA16SrRNAgeneofthreepopulationsofSiberianprawnExopalaemonmodestus

差異來源source of variance自由度df方差平方和SS占總變異百分比/%percent of total variance均方差平方和average of SSF值F value 種群間 inter population26.44229.583.2216.897種群內(nèi) within apopulation12658.82670.420.467總和 sum12865.268

3 討論

3.1 基于16S rRNA基因的序列變異

動(dòng)物mtDNA僅編碼少量蛋白質(zhì)，結(jié)構(gòu)相對(duì)簡單。一方面，mtDNA呈母系遺傳，且進(jìn)化速度快，較快的進(jìn)化速率使種群間(及近緣種間)的遺傳變異更易被檢測；另一方面，mtDNA不同區(qū)域的變異率存在差異，即使是同一段基因片斷，不同的物種其遺傳變異解析能力也不同。因此，mtDNA序列分析已成為研究種群遺傳結(jié)構(gòu)及變異的一種有效方法[18]。

雖然在一些物種中，16S rRNA 序列被證明在屬水平上有相對(duì)較高的變異水平和較好的分辨能力，但絕大部分的研究均表明，16S rRNA序列保守性較COⅠ基因序列高，COⅠ基因比16S rRNA基因更適合于分析種群遺傳變異及物種鑒別[19-20]。本研究中，通過對(duì)3個(gè)群體129尾秀麗白蝦個(gè)體16S rRNA基因的序列測定，發(fā)現(xiàn)秀麗白蝦不同種群間基于16S rRNA基因的序列變異較小，486 bp 序列中共檢測到8種單倍型和10個(gè)變異位點(diǎn)(占所測序列的2.06%)，變異位點(diǎn)比例低于鲇的5個(gè)野生群體16S rRNA基因序列(變異位點(diǎn)占所測序列的4.40%)[15]。

目前，關(guān)于秀麗白蝦基于線粒體的種群遺傳多樣性研究報(bào)道較少，僅見陳杰[21]基于COⅠ基因?qū)碜?個(gè)種群的25個(gè)個(gè)體的秀麗白蝦進(jìn)行了初步研究，與其研究結(jié)果相比，本研究中的變異位點(diǎn)數(shù)和單倍型數(shù)均低于基于COⅠ基因的秀麗白蝦的遺傳變異,印證了16S rRNA基因比COⅠ基因更保守的結(jié)論。

3.2 秀麗白蝦單倍型多樣性和核苷酸多樣性

單倍型多樣性(Hd)與核苷酸多樣性(Pi)常被用來評(píng)估種群遺傳多樣性及推斷種群的進(jìn)化歷史，當(dāng)單倍型多樣性較高而核苷酸多樣性較低(Hd>0.5，Pi<5%)時(shí)，可能是由于受瓶頸效應(yīng)后種群數(shù)量的迅速擴(kuò)張導(dǎo)致[22]。高單倍型多樣性而低核苷酸多樣性的情況在魚類及蝦蟹類中較為常見，如基于線粒體Cytb基因序列的7個(gè)群體南海短尾大眼鯛Priacanthusmacracanthus的單倍型多樣性為0.813 0～0.901 2，核苷酸多樣性為0.004 0～0.005 3[23]；長吻鮠Leiocassislongirostris野生群體平均單倍型多樣性為0.973 6±0.007 0，平均核苷酸多樣性為0.008 7±0.001 5，而養(yǎng)殖群體的單倍型多樣性為0.886 7±0.001 3, 核苷酸多樣性為0.005 6±0.001 3[24]；中國南海野生斑節(jié)對(duì)蝦Penaeusmonodon5個(gè)野生群體的單倍型多樣性為0.521 1～0.721 1，核苷酸多樣性為0.0043 5～0.0116 8[25]；戴艷菊等[26]對(duì)三疣梭子蟹Portunustrituberculatus4個(gè)野生群體的研究表明，基于COⅠ基因片段的4個(gè)野生群體的平均單倍型多樣性為0.608，平均核苷酸多樣性為0.001 09。

本研究中，秀麗白蝦種群的單倍型多樣性為0.691 0，而其核苷酸多樣性僅為0.002 46，這說明本研究中的秀麗白蝦種群遺傳多樣性較高，該種群在進(jìn)化中可能經(jīng)歷了瓶頸效應(yīng)，是從一個(gè)有效種群數(shù)量較小的群體快速擴(kuò)張而來，種群單倍型多樣性較豐富, 但還未能積累足夠的核苷酸變異。

3.3 秀麗白蝦種群中性檢驗(yàn)及3種群間的遺傳分化

中性理論(neutral theory)，又稱中性突變與隨機(jī)漂移理論(neutral mutation and random genetic drift theory)，是分子進(jìn)化的重要理論之一。該理論認(rèn)為：大部分對(duì)種群的遺傳結(jié)構(gòu)與進(jìn)化有貢獻(xiàn)的分子突變?cè)谧匀贿x擇的意義上都是中性或近中性的，因而自然選擇對(duì)這些突變并不起作用；中性突變的進(jìn)化是隨機(jī)漂移的過程，或被固定在種群中，或消失。Tajima[27]設(shè)計(jì)了D值檢驗(yàn)(Tajima’s D)，通過統(tǒng)計(jì)學(xué)模型來驗(yàn)證中性突變假說。

應(yīng)用Tajima’s D值中性檢驗(yàn)推測種群曾經(jīng)歷的歷史時(shí)，如果Tajima’s D值為負(fù)，且在統(tǒng)計(jì)學(xué)上達(dá)到顯著標(biāo)準(zhǔn)，則說明群體中存在許多低頻率的等位基因(稀有等位基因)，可能預(yù)示著被研究種群曾經(jīng)經(jīng)歷過一個(gè)定向選擇和規(guī)模擴(kuò)張的歷史[27]。本研究中，太湖、鄱陽湖種群Tajima’s D值為負(fù)(表4)，若將包括興凱湖在內(nèi)的3個(gè)種群看作一個(gè)整體，則Tajima’s D值仍為負(fù)，但各種群在單獨(dú)進(jìn)行中性檢驗(yàn)時(shí)，并沒有達(dá)到顯著水平(P>0.1)，說明秀麗白蝦可能在歷史上發(fā)生過擴(kuò)張，但基于16S rRNA基因的秀麗白蝦種群并未有顯著偏離中性進(jìn)化模型。

遺傳分化系數(shù)是反映各亞群間遺傳分化的重要指標(biāo)。由種群AMOVA分析可知，3個(gè)種群間的遺傳分化系數(shù)為0.2958，基因流為0.595 2，檢驗(yàn)表明，3個(gè)種群間存在極顯著分化，這和基于AFLP分子標(biāo)記的秀麗白蝦3個(gè)野生群體間呈現(xiàn)中高度遺傳分化(遺傳分化系數(shù)為0.252)的結(jié)果基本一致[13]。另外，太湖種群和鄱陽湖種群分別發(fā)現(xiàn)5種和4種單倍型，興凱湖種群僅有一種單倍型Ⅳ，推測興凱湖種群在進(jìn)化過程中由于其獨(dú)特的生態(tài)環(huán)境(冷水性湖泊)導(dǎo)致某些稀有等位基因丟失，單倍型多樣性缺乏。

綜上，本研究結(jié)果初步揭示興凱湖秀麗白蝦種群與太湖、鄱陽湖種群間的基因交流較少，種群間已經(jīng)出現(xiàn)了極顯著分化。一個(gè)物種抵御不良環(huán)境的能力和進(jìn)化潛力有賴于種群的遺傳結(jié)構(gòu)，也取決于種群內(nèi)遺傳變異的大小[28]?？傮w來說，秀麗白蝦雖然為自由游泳生活，但個(gè)體較小，遷移活動(dòng)范圍有限，地理隔離較明顯，不同地理種群間分化程度較高。