張艷榮，高宇航，劉婷婷，宋云禹，陳丙宇，王大為*

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118）

白靈菇（Pleurotus nebrodensis），又名白靈側(cè)耳，隸屬于擔(dān)子菌門，傘菌目，側(cè)耳科，側(cè)耳屬，是阿魏菇的白色變種。白靈菇子實(shí)體色澤潔白，碩大肥厚，子實(shí)體形狀有掌狀、馬蹄狀、棒狀等，是我國(guó)唯一具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)及明確原產(chǎn)地的食用菌品種資源[1]。目前，國(guó)內(nèi)白靈菇主要來(lái)源于工廠化栽培，產(chǎn)地集中在北京、河南、河北、江蘇等地，產(chǎn)量逐年遞增，據(jù)2014年統(tǒng)計(jì)全國(guó)白靈菇年產(chǎn)量已突破30.80萬(wàn) t。白靈菇營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量豐富，干品白靈菇子實(shí)體中蛋白質(zhì)為14.70%，碳水化合物為43.30%，脂肪為4.31%，纖維為15.40%，氨基酸總量為10.70%，17 種氨基酸中有8 種必需氨基酸，占氨基酸總量的35%[2]。白靈菇以其細(xì)膩脆韌的口感和鮮香的風(fēng)味走俏國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)，隨著栽培技術(shù)的逐步成熟以及優(yōu)良種質(zhì)資源持續(xù)開(kāi)發(fā)，未來(lái)白靈菇產(chǎn)業(yè)定會(huì)得到長(zhǎng)足發(fā)展。

目前國(guó)內(nèi)對(duì)白靈菇的加工應(yīng)用較多是以開(kāi)發(fā)高附加值產(chǎn)品為主的工藝研究和以白靈菇多糖為主的功能成分基礎(chǔ)研究，而忽略了對(duì)白靈菇蛋白質(zhì)（white oyster mushroom protein，WOMP）資源的開(kāi)發(fā)利用。李志濤等[3]對(duì)白靈菇多糖的提取及免疫活性進(jìn)行了研究。王耀輝等[4]對(duì)白靈菇多糖的抗氧化活性進(jìn)行了探討。楊國(guó)偉等[5]研究結(jié)果表明，以1 000 mL為100%，添加35%白靈菇漿料（自制）、60%麥芽汁、加糖量6%，經(jīng)過(guò)36 h發(fā)酵，制作的白靈菇乳酸飲料品質(zhì)最佳。李鳳林等[6]對(duì)白靈菇山楂復(fù)合飲料研究結(jié)果表明，利用白靈菇菌絲發(fā)酵液為原料開(kāi)發(fā)白靈菇飲料，白靈菇發(fā)酵液培養(yǎng)條件為：裝液量80 mL/瓶、接種量為15%、調(diào)pH值為6.5、180 r/min振蕩、25 ℃培養(yǎng)8～9 d。復(fù)合白靈菇飲料最佳配方為：發(fā)酵液20%、山楂漿15%、蔗糖10%、總酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4%。

一般植物蛋白具有良好的溶解性、持水性、乳化性等功能性質(zhì)，在面制品、乳制品等食品工業(yè)中有廣泛的應(yīng)用前景。目前對(duì)WOMP的制備、功能性質(zhì)和結(jié)構(gòu)較為系統(tǒng)的研究鮮見(jiàn)報(bào)道，因此為了進(jìn)一步開(kāi)發(fā)白靈菇潛在的營(yíng)養(yǎng)和應(yīng)用價(jià)值，本研究采用超聲波-微波復(fù)合輔助堿法提取WOMP并對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，同時(shí)對(duì)WOMP功能特性和結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，為白靈菇的高附加值利用提供相關(guān)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白靈菇 實(shí)驗(yàn)室馴化栽培優(yōu)良菌株（編號(hào)AJ01）栽培；無(wú)水乙醇、氫氧化鈉、溴化鉀（均為分析純）北京化工廠；彩虹245廣譜蛋白Marker 北京索萊寶科技有限公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium doecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）試劑盒（包括30%聚丙烯酰胺、pH 8.8 Tris/SDS分離膠緩沖液、pH 6.8 Tris/SDS分離膠緩沖液、過(guò)硫酸銨干粉、上樣緩沖液、四甲基乙二胺溶液） 北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司；AccQ-Tag熒光衍生試劑盒（包括熒光衍生試劑、硼酸鹽緩沖液、AccQ-Tag流動(dòng)相A和AccQ-Tag流動(dòng)相B、17 種混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液） 美國(guó)Waters公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UWave-1000型微波-紫外-超聲波三位一體合成萃取反應(yīng)儀 上海新儀微波化學(xué)科技有限公司；HR2168型攪拌器 飛利浦（中國(guó)）投資有限公司；CT15RT臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 上海天美科學(xué)儀器有限公司；UV-2300紫外分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司；Acquity UPLCH-Class型超高效液相色譜系統(tǒng) 美國(guó)Waters公司；冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Ghrist公司；MOS-450型圓二色光譜儀 法國(guó)Bio-Logic公司；IR Prestige型傅里葉紅外光譜儀 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 WOMP等電點(diǎn)測(cè)定

將10.0 g脫脂白靈菇在溫度45 ℃、微波功率24 W、超聲波功率400 W、NaOH溶液濃度0.08 mol/L、料液比1∶25（g/mL）條件下提取1.0 h，將提取液pH值分別調(diào)到2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5。于3 800 r/min離心15 min，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定上清液中蛋白質(zhì)含量[7]。

1.3.2 WOMP的提取

1.3.2.1 工藝流程

鮮品白靈菇→45 ℃熱風(fēng)干燥、粉碎（過(guò)40 目孔徑篩）→脫脂處理→超聲波-微波輔助堿法提蛋白（750 r/min，提取1 h）→離心（3 800 r/min，15 min）→上清液→酸沉（1 mol/L的HCl溶液調(diào)pH值至3.5）→離心（3 800 r/min，30 min）→蛋白沉淀→真空冷凍干燥→WOMP。

1.3.2.2 WOMP提取的單因素試驗(yàn)

各組試驗(yàn)中稱取脫脂后白靈菇子實(shí)體粉末（過(guò)40 目孔徑篩）10.0 g和微波功率24 W保持不變，在單因素試驗(yàn)中考察提取溫度、超聲波功率、NaOH溶液濃度、料液比和提取時(shí)間對(duì)蛋白得率的影響。設(shè)定提取溫度50 ℃、超聲波功率500 W、NaOH溶液濃度0.08 mol/L、料液比1∶30（g/mL）、提取時(shí)間1.0 h。單因素試驗(yàn)為固定其他因素研究某因素對(duì)蛋白得率的影響。各因素水平：提取溫度分別為30、35、40、45、50、55、60 ℃；超聲波功率分別為200、300、400、500、600、700 W；NaOH溶液濃度分別為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12 mol/L；提取時(shí)間分別為0.1、0.4、0.7、1.0、1.3、1.6 h；料液比分別為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35（g/mL）。

1.3.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以提取溫度、超聲波功率、NaOH溶液濃度、料液比、提取時(shí)間為考察因素，以蛋白質(zhì)得率為考察指標(biāo)，進(jìn)行L16（45）正交試驗(yàn)，每組試驗(yàn)3 次平行，并應(yīng)用SPSS 18.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，優(yōu)化出最佳的WOMP提取工藝，正交試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table1 Variables and levels used in orthogonal array design

1.3.4 蛋白得率的計(jì)算

參考趙玉紅等[8]方法，脫脂白靈菇輔助堿法提取、酸沉后離心，收集上清液，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定上清液中蛋白質(zhì)含量，取1.0 mL上清液放入試管中，加入5.0 mL考馬斯亮藍(lán)溶液混勻靜置3 min，測(cè)定吸光度，蛋白得率按公式（1）計(jì)算：

式中：m為標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得的蛋白質(zhì)質(zhì)量/μg；M1為樣品白靈菇質(zhì)量/g；V1為離心得上清液總體積/mL；V2為測(cè)定吸光度所用上清液體積/mL。

1.3.5 WOMP功能性質(zhì)測(cè)定

對(duì)WOMP的溶解性、持水性、持油性、起泡性和泡沫穩(wěn)定性、乳化性和乳化穩(wěn)定性測(cè)定參考劉婷婷等[9]的方法。

1.3.5.1 WOMP溶解性測(cè)定

配制10.0 mg/mL樣品溶液17 份；將9 份調(diào)節(jié)不同pH值至2.5、3.5、6.0、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、10.0，室溫條件下攪拌20 min，另外8 份分別于30、40、50、60、70、80、90、100 ℃條件下水浴攪拌20 min，離心測(cè)上清液中蛋白質(zhì)含量；WOMP溶解度按公式（2）計(jì)算：

1.3.5.2 WOMP持水性和持油性測(cè)定

準(zhǔn)確稱取1.00 g WOMP樣品12 份于離心管中，其中6 份加入30 mL蒸餾水，6 份加入10 mL大豆油，分別在30、40、50、60、70、80 ℃條件下水浴振蕩1.5 h，靜置30 min，3 800 r/min離心40 min，棄去上清液，測(cè)殘留物的質(zhì)量，持水性和持油性按公式（3）計(jì)算：

1.3.5.3 WOMP起泡性和泡沫穩(wěn)定性測(cè)定

配制10.0、15.0、20.0、25.0、30.0、35.0 mg/mL的WOMP溶液各100 mL，高速攪打10 min，用量筒測(cè)量泡沫體積及液體體積。室溫靜置60 min后再記錄泡沫體積，WOMP起泡性和泡沫穩(wěn)定性按公式（4）、（5）計(jì)算：

1.3.5.4 WOMP乳化性和乳化穩(wěn)定性測(cè)定

配制10.0、15.0、20.0、25.0、30.0、35.0 mg/mL的WOMP溶液各100 mL，加入100 mL玉米油，高速勻漿10 min，3 800 r/min離心15 min，測(cè)乳化層體積，所得混合液于100 ℃條件下保溫60 min，冷卻至室溫后再次離心，再測(cè)乳化層體積，WOMP乳化性和乳化穩(wěn)定性測(cè)定按公式（6）、（7）計(jì)算：

1.3.6 WOMP結(jié)構(gòu)測(cè)定

1.3.6.1 WOMP氨基酸組成分析

超高效液相色譜分析WOMP氨基酸組成及含量，方法參考文獻(xiàn)[10-11]，準(zhǔn)確稱取WOMP樣品50.0 mg于100 ℃條件下水解20 h，取1 mL水解液蒸干，用超純水定容到10 mL備用。將17 種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋，備用。取樣品10 μL，加70 μL硼酸鹽緩沖溶液渦旋混合，再加20 μL衍生劑充分混合，放置5 min，封口，移入55 ℃烘箱中加熱10 min；測(cè)定條件：ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），紫外波長(zhǎng)266 nm，柱溫49 ℃，樣品溫度20 ℃；根據(jù)測(cè)定的必需氨基酸含量按公式（8）、（9）計(jì)算WOMP氨基酸評(píng)分、氨基酸化學(xué)評(píng)分：

1.3.6.2 WOMP的分子質(zhì)量測(cè)定

參考孔毅等[12]方法，使用SDS-PAGE凝膠試劑盒配制分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%，電壓100 V；濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%，80 V電壓；上樣量15 μL；常溫固定、染色、脫色。

1.3.6.3 WOMP的二級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定

參考韓宇鵬等[13]方法，配制1 mg/mL WOMP中性溶液，選擇遠(yuǎn)紫外光區(qū)波長(zhǎng)范圍190～260 nm；比色池為0.1 cm；光譜帶寬1 nm；分辨率0.2 nm；響應(yīng)時(shí)間0.25 s；掃描速率10 nm/min；圓二色光譜分辨率20 mdeg；室溫條件下測(cè)定蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)并計(jì)算相對(duì)含量。

1.3.6.4 WOMP的官能團(tuán)結(jié)構(gòu)分析

參考魏春光等[14]方法，準(zhǔn)確稱取2 mg干燥WOMP和200 mg干燥KBr粉末，充分研磨混勻后壓片。以KBr為背景，在500～4 000 cm-1波數(shù)下對(duì)WOMP進(jìn)行紅外光譜分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 WOMP等電點(diǎn)測(cè)定結(jié)果

圖1 WOMP等電點(diǎn)Fig.1 Isoelectric point of WOMP

由圖1可以看出，WOMP提取液pH值在2.0～5.5范圍內(nèi)變化時(shí)，蛋白提取液經(jīng)過(guò)酸沉、離心后測(cè)得上清液中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度逐漸降低，pH值為3.5時(shí)最低，pH值大于3.5之后，蛋白質(zhì)量濃度上升趨勢(shì)明顯，因此蛋白等電點(diǎn)為3.5。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

圖2 各因素對(duì)蛋白得率的影響Fig.2 Individual effects of factors on protein yield

由圖2A可知，隨著提取溫度升高，蛋白得率呈先上升后下降的趨勢(shì)，在提取溫度為45 ℃時(shí)得率最高。當(dāng)提取溫度低于45 ℃，升高溫度使蛋白質(zhì)分子空間構(gòu)象改變，立體結(jié)構(gòu)適當(dāng)伸展，加強(qiáng)了水分子和蛋白分子之間的相互作用，蛋白質(zhì)溶解度增加，得率增加；提取溫度大于45 ℃，升高溫度分子間運(yùn)動(dòng)加劇使維持蛋白質(zhì)空間構(gòu)象和立體結(jié)構(gòu)的弱作用力消失，一些非極性的基團(tuán)暴露在分子表面[15]，影響蛋白質(zhì)和水分子之間的相互作用，蛋白質(zhì)溶解度降低，蛋白得率降低。

由圖2B可知，隨著超聲波功率的增加蛋白得率呈先上升后趨于平緩的趨勢(shì)。超聲波的空化效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)破壞蛋白質(zhì)四級(jí)結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)小分子的亞基釋放[16]，一些極性氨基酸殘基向蛋白質(zhì)分子外部遷移，增強(qiáng)蛋白與水分子的相互作用，使溶解度增加[17]；超聲波能阻止蛋白質(zhì)中自由氨基群和臨近羧基群之間的靜電作用而提高蛋白的溶解度[18]，當(dāng)超聲波功率大于400 W時(shí)反應(yīng)體系中的蛋白質(zhì)已經(jīng)最大程度溶出，因此蛋白得率會(huì)趨于平穩(wěn)[19]。

由圖2C可知，蛋白得率隨NaOH溶液濃度的增加呈先上升后下降的趨勢(shì)，在NaOH溶液濃度為0.08 mol/L時(shí)得率最高為6.25%，隨著NaOH溶液濃度的增加，反應(yīng)體系中蛋白質(zhì)分子攜帶的同種符號(hào)的凈電荷增加，同種電荷相互排斥阻止了單個(gè)分子的聚集，因此溶解度增大[20]；而過(guò)高的NaOH溶液濃度會(huì)使蛋白質(zhì)水解變性，使蛋白溶解度降低，同時(shí)加速其美拉德反應(yīng)生成黑褐色物質(zhì)，降低蛋白質(zhì)純度[21]；過(guò)高的NaOH溶液濃度會(huì)改變蛋白的營(yíng)養(yǎng)特性，生成賴氨酰丙氨酸，降低蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[22]。

由圖2D可知，提取時(shí)間大于1 h后蛋白得率隨時(shí)間的延長(zhǎng)變化不大，這與李桂菊等[23]報(bào)道的時(shí)間對(duì)蛋白提取率的影響結(jié)果一致，原因是在提取1 h后白靈菇中大部分的蛋白已經(jīng)溶解在體系中。

由圖2E可知，蛋白得率在料液比為1∶25（g/mL）時(shí)達(dá)到最高，為6.43%，隨料液比增加得率稍有下降后趨于平緩。原因是隨著溶劑體積的增加，溶質(zhì)的分散程度增加，溶質(zhì)與溶劑之間的接觸更充分，加速了蛋白質(zhì)溶出，當(dāng)料液比增加到一定量時(shí)，兩相體系接觸程度最大化，因此得率變化趨于平緩。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

表2 L16（45）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table2 Orthogonal array design L16 (45) with range analysis of experimental results

表3 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table3 Analysis of variance for the eff ects of five factors on protein yield

由表2可知，各因素對(duì)蛋白得率的影響程度大小依次為提取溫度＞料液比和超聲波功率＞提取時(shí)間＞NaOH溶液濃度。由表3可知，除NaOH溶液濃度外其他因素都達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），而NaOH溶液濃度對(duì)蛋白得率的影響不顯著（P＞0.05），這一結(jié)果與極差分析結(jié)果相符。正交分析得到的最優(yōu)組合為A4B3C4D4E1，該組合不在16組正交試驗(yàn)中，對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果得率為（10.28±0.62）%，大于16 組試驗(yàn)中的最優(yōu)組第15組，故最終確定WOMP最佳提取條件為：提取溫度50 ℃、超聲波功率500 W、NaOH溶液濃度0.09 mol/L、料液比1∶30（g/mL）、提取時(shí)間0.8 h。

2.4 WOMP功能特性

2.4.1 溶解性測(cè)定結(jié)果

圖3 溫度（A）和pH值（B）對(duì)蛋白質(zhì)溶解度的影響Fig.3 Effect of pH on solubility of the protein

由圖3A可知，pH 7條件下WOMP的溶解度隨溫度的升高呈先增加后趨于平緩最后降低的趨勢(shì)，在70 ℃條件下蛋白溶解度最高為53.61%，表明溫度對(duì)蛋白的溶解度有較大影響[24]，適當(dāng)?shù)纳郎赜兄诘鞍踪|(zhì)分子的溶解，而溫度過(guò)高則會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性使溶解度降低，根據(jù)張波等[25]報(bào)道，紅小豆分離蛋白在55 ℃時(shí)溶解度最高，與其相比WOMP在較高溫度時(shí)有較高的溶解度，說(shuō)明WOMP有較好的耐熱性。由圖3B可知，當(dāng)pH值在等電點(diǎn)附近時(shí)，溶解性很低，當(dāng)pH值偏離等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)溶解性增加，pH 8.5時(shí)蛋白質(zhì)溶解度最高為54.31%，當(dāng)pH繼續(xù)增加時(shí)蛋白溶解度有緩慢下降的趨勢(shì)，WOMP在堿性條件下比酸性條件下的溶解性好。

2.4.2 持水性和持油性測(cè)定結(jié)果

圖4 溫度對(duì)蛋白持水性（A）和持油性（B）的影響Fig.4 Effect of temperature on water-holding (A) and oil-holding (B) of the protein

由圖4A可知，溫度對(duì)WOMP持水性的影響呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，在60 ℃時(shí)達(dá)到最大為325.27%，蛋白分子在低于變性溫度的環(huán)境中隨著溫度的升高，蛋白分子進(jìn)行適當(dāng)?shù)纳煺筟26]，一些親水性基團(tuán)充分的與水分子結(jié)合[27]，當(dāng)溫度高于變性溫度后，蛋白質(zhì)變性使非極性基團(tuán)大量暴露，與水分子之間相互作用減弱，持水性降低[28]；由圖4B可知，當(dāng)溫度在50 ℃時(shí)蛋白持油性達(dá)到最大為189.60%，之后持油性逐漸降低，原因是隨著溫度的升高，蛋白質(zhì)的變性，分子間的相互作用減弱，使其持油性降低。據(jù)文獻(xiàn)[9]報(bào)道，紅小豆分離蛋白和大豆分離蛋白的持油性分別為202%和231%，均高于WOMP。

2.4.3 起泡性和泡沫穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果

圖5 蛋白質(zhì)量濃度對(duì)蛋白起泡性（A）和泡沫穩(wěn)定性（B）的影響Fig.5 Effect of protein concentration on foaming capacity (A) and foam stability (B) of the protein

蛋白質(zhì)起泡性的本質(zhì)是蛋白質(zhì)分子在一定條件下與水分子和空氣形成一種特殊形態(tài)混合物的能力，泡沫穩(wěn)定性是衡量泡沫穩(wěn)定能力的指標(biāo)，在食品加工中可以利用蛋白質(zhì)的起泡性和泡沫穩(wěn)定性使產(chǎn)品達(dá)到特殊的組織狀態(tài)和口感[29]。由圖5可知，在考察的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，WOMP的起泡性和泡沫穩(wěn)定性都隨著蛋白質(zhì)量濃度的增加而增加，這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)分子濃度增加，高速攪打時(shí)分子間的相互作用增強(qiáng)，表面張力進(jìn)一步降低進(jìn)而結(jié)合更多氣體，形成穩(wěn)定的氣泡。當(dāng)WOMP質(zhì)量濃度為35 mg/mL時(shí)，WOMP起泡性為237.5%，與大豆分離蛋白123%和紅小豆分離蛋白127.5%的起泡性相比[25]，WOMP具有較好的起泡性，可以較好地運(yùn)用到焙烤食品等需要產(chǎn)生并保持氣泡的食品中。

2.4.4 乳化性和乳化穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果

圖6 蛋白質(zhì)量濃度對(duì)乳化性（A）和乳化穩(wěn)定性（B）的影響Fig.6 Effect of protein concentration on emulsifying capacity (A) and emulsion stability (B) of the protein

蛋白質(zhì)作為一種表面活性物質(zhì)，既含有親水性基團(tuán)又含有親油性基團(tuán)，具有降低水-油界面表面張力的作用，同時(shí)其降低水和空氣表面張力的能力表現(xiàn)為乳化穩(wěn)定性[30]，在食品加工中應(yīng)用蛋白質(zhì)的表面活性，使產(chǎn)品具有乳化穩(wěn)定狀態(tài)進(jìn)而可以延長(zhǎng)產(chǎn)品貨架期[31]。由圖6可知，WOMP的乳化性隨蛋白質(zhì)量濃度的增加呈緩慢上升的趨勢(shì)，而乳化穩(wěn)定性隨蛋白質(zhì)量濃度增加變化不大，說(shuō)明在不同的蛋白濃度條件下，WOMP有良好的乳化穩(wěn)定性。當(dāng)WOMP質(zhì)量濃度為35 mg/mL時(shí)，WOMP乳化性為58.3%明顯高于大豆分離蛋白47%和紅小豆分離蛋白46%[25]，說(shuō)明WOMP可以作為良好乳化劑應(yīng)用到食品中。

2.5 WOMP結(jié)構(gòu)測(cè)定結(jié)果

2.5.1 氨基酸組成結(jié)果

表4 WOMP的氨基酸組分Table4 Amino acid composition of WOMP

由表4可以看出，WOMP含有17 種氨基酸，組氨酸是第1限制性氨基酸，其中必需氨基酸含量為322.86 mg/g，非必需氨基酸含量為487.54 mg/g，必需氨基酸占總氨基酸的比例為39.84%，必需氨基酸和非必需氨基酸的比值為0.66，接近WHO/FAO標(biāo)準(zhǔn)值，表明氨基酸組成合理。

表5 氨基酸評(píng)分Table5 Amino acid scores

由表5可知，WOMP的異亮氨酸和亮氨酸評(píng)分與大豆蛋白這2 種氨基酸的氨基酸評(píng)分接近，蘇氨酸評(píng)分高于大豆蛋白，其他氨基酸評(píng)分低于大豆蛋白；白靈菇必需氨基酸含量與人體所需要量接近。

表6 化學(xué)評(píng)分Table6 Chemical scores

由表6可知，除纈氨酸和苯丙氨酸+酪氨酸化學(xué)評(píng)分略低于大豆和雞蛋蛋白評(píng)分外，WOMP氨基酸的化學(xué)評(píng)分與大豆、雞蛋等蛋白基本相近，說(shuō)明其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高，有非常大的開(kāi)發(fā)潛力。

2.5.2 二級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定結(jié)果

圖7 WOMP的圓二色光圖譜Fig.7 Far-UV CD spectrum of WOMP

圓二色性是指光學(xué)活性物質(zhì)對(duì)左旋（R）和右旋（L）2 種圓偏振光吸收程度不同的現(xiàn)象，它的存在使通過(guò)具有光學(xué)活性物質(zhì)的圓偏振光變?yōu)闄E圓偏振光，且在特定吸收波長(zhǎng)處出現(xiàn)。根據(jù)這一原理設(shè)計(jì)的圓二色光譜儀可以測(cè)定光學(xué)活性物質(zhì)的圓二色光譜，通過(guò)圓二色光譜圖可以進(jìn)一步研究光學(xué)活性物質(zhì)的立體構(gòu)型[32]，蛋白質(zhì)的肽鍵檢測(cè)波長(zhǎng)在190～250 nm之間，該區(qū)間內(nèi)有圓二色性，因此可以通過(guò)圓二色光譜圖反映蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)[33-34]。對(duì)WOMP進(jìn)行圓二色光譜掃描結(jié)果見(jiàn)表7和圖7，通過(guò)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析軟件CD-Pro計(jì)算得WOMP二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋相對(duì)含量最高為53%，其次是無(wú)規(guī)卷曲相對(duì)含量為23%，然后是β-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量為14%，最后是β-折疊相對(duì)含量為11%。

2.5.3 WOMP分子質(zhì)量測(cè)定結(jié)果

圖8 WOMP分子質(zhì)量電泳圖Fig.8 SDS-PAGE profile of WOMP

由圖8可以看出，WOMP在48～63、25～35、11～20 kDa以及小于11 kDa范圍內(nèi)有條帶，在48～63 kDa之間條帶染色程度很深，說(shuō)明該分子質(zhì)量的蛋白含量較高[35]。WOMP的亞基分布主要在10～35 kDa之間，占亞基總數(shù)的75%，可見(jiàn)WOMP以小分子結(jié)構(gòu)蛋白居多。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白的遷移距離計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)蛋白的相對(duì)遷移率，以標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，相對(duì)遷移率為橫坐標(biāo)，得回歸方程為：y=-0.606 2x+2.351 8，R2為0.984 6，線性范圍為0.51～2.09。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出WOMP分子質(zhì)量為48.9、26.3、16.4、10.9 kDa。

2.5.4 WOMP紅外光譜分析結(jié)果

圖 9 WOMP紅外光譜圖Fig. 9 Infrared spectrum of WOMP

對(duì)于蛋白質(zhì)而言，傅里變換葉紅外光譜能夠提供蛋白質(zhì)分子中的氨基基團(tuán)、酰胺I帶（或H—O—H彎曲振動(dòng)和C＝O伸縮振動(dòng)）、酰胺II帶（N—H彎曲）、酰胺III帶（或C—O和C—O—C振動(dòng)）、蛋白質(zhì)環(huán)狀結(jié)構(gòu)中的C—C振動(dòng)，以及C—O—O糖苷鍵振動(dòng)波段信息[36]。由圖9可知，在3 022.45、2 924.09、1 681.93、1 539.20、1 244.09、1 076.27 cm-1處出現(xiàn)了蛋白質(zhì)特征吸收峰，分別是：烯烴類—C—H—伸縮振蕩吸收峰，烷烴類的—C—H—反對(duì)稱的伸縮振蕩吸收峰，酰胺I帶的C＝O伸縮振蕩產(chǎn)生的特征吸收峰，酰胺II帶中NH2的面內(nèi)變形振蕩吸收峰，仲酰胺中C—N的伸縮振蕩和NH彎曲振蕩吸收峰，NH面內(nèi)彎曲振蕩吸收峰[37]。而且蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)信息重疊在酰胺I帶里[38]，可以利用波段縮小技術(shù)將WOMP紅外光譜中的酰胺I帶細(xì)分，進(jìn)一步得到WOMP二級(jí)結(jié)構(gòu)的信息。

3 結(jié) 論

通過(guò)超聲波-微波輔助NaOH溶液法提取WOMP，結(jié)合單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化出WOMP最佳提取工藝為：提取溫度50 ℃、微波功率24 W、超聲波功率500 W、NaOH溶液濃度0.09 mol/L、料液比1∶3 0（g/m L）、提取時(shí)間0.8 h，蛋白得率為（10.28±0.62）%。溫度和pH值均對(duì)WOMP溶解度、持水性、持油性、起泡性和起泡穩(wěn)定性以及乳化性和乳化穩(wěn)定性有影響，探究溫度和pH值對(duì)WOMP的影響為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)WOMP相關(guān)產(chǎn)品提供了理論基礎(chǔ)。探明WOMP中含有17 種氨基酸，而且必需氨基酸占總氨基酸的比例為39.84%，必需氨基酸和非必需氨基酸的比值為0.66，WOMP的氨基酸組成合理，可以作為氨基酸補(bǔ)充劑的原料來(lái)源。WOMP的二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋相對(duì)含量為53%，β-折疊相對(duì)含量為11%，β-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量為14%，無(wú)規(guī)卷曲相對(duì)含量為23%，分子質(zhì)量分布為48.9、26.3、16.4、10.9 kDa，探明WOMP的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)為進(jìn)一步的研究提供相應(yīng)的理論支持。

系統(tǒng)全面的研究WOMP的提取工藝、功能性質(zhì)和結(jié)構(gòu)，可以為WOMP開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)，同時(shí)也為白靈菇的精深加工提供新的思路，為白靈菇產(chǎn)業(yè)的發(fā)展帶來(lái)新的契機(jī)。