劉云柯，周云橫，衛(wèi)亞紅,b,c

(西北農(nóng)林科技大學(xué)a生命科學(xué)學(xué)院，b旱區(qū)生物質(zhì)能研究中心，c旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌 712100)

當(dāng)今環(huán)保形勢(shì)愈發(fā)嚴(yán)峻，生物可降解材料越來越受到人們的青睞。聚乙烯醇(PVA)作為一種具有獨(dú)特良好性能且可生物降解的高分子材料更是受到格外關(guān)注，被認(rèn)為是最富前景的化工原料之一[1-2]。PVA因具有耐磨性、強(qiáng)韌性、強(qiáng)力粘結(jié)性和皮膜柔韌性等良好性能，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、紡織、醫(yī)療、食品、建筑和高分子化工等行業(yè)，在全球范圍內(nèi)的產(chǎn)量和消費(fèi)需求都在迅猛增加。大量使用勢(shì)必會(huì)導(dǎo)致大量廢棄，廢棄PVA雖然本身無毒性，但其具有較大的表面活性，能在水中形成大量泡沫，導(dǎo)致水體富氧，從而抑制甚至破壞水生生物的呼吸活動(dòng)，改變水體的生態(tài)平衡[3]。本研究在總結(jié)相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)PVA降解微生物、菌群應(yīng)用模式、降解機(jī)理進(jìn)行重點(diǎn)介紹和討論，并分析PVA生物降解研究的發(fā)展趨勢(shì)，以期為PVA的科學(xué)利用及降解提供參考。

1 PVA降解菌研究現(xiàn)狀

據(jù)統(tǒng)計(jì)，PVA的產(chǎn)量較其他任何水溶性的人工合成聚合物都要多。近年來，在世界經(jīng)濟(jì)復(fù)蘇乏力、國(guó)內(nèi)經(jīng)濟(jì)增速放緩、原油價(jià)格持續(xù)下滑、化工產(chǎn)品價(jià)格大幅下跌的大背景下，我國(guó)PVA產(chǎn)量及其增長(zhǎng)率依然有所提高。2014-2015年我國(guó)PVA工業(yè)主要產(chǎn)品產(chǎn)量、銷量情況見表1[4]。

表1 2014-2015年我國(guó)PVA工業(yè)主要產(chǎn)品產(chǎn)量、銷量及其增減情況Table 1 Production,and sale and growth of main PVA products in China from 2014 to 2015

PVA在自然條件下不易被降解，采用物理化學(xué)等處理方法可能存在成本高和二次污染等問題[5]。相比之下，生物降解PVA顯得更加經(jīng)濟(jì)和高效。有關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，PVA的基本鏈?zhǔn)浇Y(jié)構(gòu)中含有可被微生物降解的糖類或脂肪酸支鏈[6]，因此，篩選具有高效降解能力的微生物,優(yōu)化其降解方式，對(duì)于減少PVA廢棄物對(duì)環(huán)境的污染具有重要意義。

自20世紀(jì)30年代以來，研究者從環(huán)境中分離出了許多可降解PVA的單一微生物或共生種群，如PseudomonasO-3[7]、P.vesicularisPD[8]、P.putida[9]、Bacillusmagaterium[10]、Acinetiobactorsp.[11]、Xanthamonassp.[12]和SB68+SB69[13]。

目前，大部分降解研究體系中PVA的含量遠(yuǎn)低于工業(yè)生產(chǎn)排放廢水中的PVA含量，因此還不能滿足實(shí)際應(yīng)用的需要[14]。PVA降解微生物的篩選和應(yīng)用研究顯得更加重要和緊迫。

2 PVA降解菌的應(yīng)用模式

PVA降解微生物的存在與應(yīng)用模式較為多樣，目前可分為單菌模式、共生雙菌模式和混合菌群模式3種。

現(xiàn)階段，研究人員篩選到的PVA降解菌一般來自含有PVA殘留物的土壤、污泥、堆肥和廢水等[15]，分離物主要是能夠降解PVA的單株菌種，包括細(xì)菌、真菌和放線菌，其中細(xì)菌類以假單胞菌屬最多[16]。Suzuki[17]1973年從土壤中分離篩選到第1株P(guān)VA降解細(xì)菌PseudomonasO-3。郭樂樂等[18]從含有塑料的垃圾堆和覆膜農(nóng)田土壤中分離得到PVA降解菌1-21。Mori等[10]篩選到的共生類PVA降解菌BX1，以及Qian等[19]所篩選到的可降解PVA的真菌Penicilliumsp.WSH02-21，均分離自紡織廠的活性污泥。Maiti等[20]則從好氧堆肥中篩選獲得了15 d內(nèi)能夠完全降解PVA的子囊菌類Penicilliumdaleae。Matsumura等[21]從日本河水中分離得到能降解PVA的糞產(chǎn)堿菌AlcaligenesfaecalisKK314。Chung等[22]從紡織廠的廢水中分離篩選到2株P(guān)VA降解細(xì)菌KCCM 10507和KCCM 10508。除此以外，國(guó)內(nèi)外科研人員還獲得了具有高效降解能力的單株菌種包括PseudomonasborealisO-3、Pseudomonassp.VM15C(PseudomonasputidaVM15A)、GeotrichumfermentansWF9101和Penicillliumsp.WSH02-21等[17,23-28]。然而有報(bào)道稱，單一微生物降解PVA的周期較長(zhǎng)，酶產(chǎn)量低且不能徹底降解PVA[28-29]。

近年來，很多研究團(tuán)隊(duì)開始側(cè)重于混合菌的PVA降解研究。Shimao等[30]首次提出PVA的生物降解可由共生細(xì)菌同化完成，并分離出Pseudomonassp.VM15C和PseudomonasputidaVM15A 2種細(xì)菌。Vaclavkova等[31]從廢水處理廠中分離出1對(duì)共生PVA降解細(xì)菌Shingomansasp.OT3和Rhodocococcuserythropolis，其中前者能為后者提供所需生長(zhǎng)因子。但總體來看，有關(guān)混合菌的研究報(bào)道仍然較少。

采用混合菌群模式降解PVA，雖可提高降解率或提高降解酶的產(chǎn)量，但菌種之間并不一定是共生關(guān)系[32]。目前，關(guān)于混合菌群模式降解PVA的研究較為活躍。張潔等[33]從垃圾填埋場(chǎng)篩選出的混合菌群，可完全降解初始質(zhì)量濃度2 g/L的PVA；Chiellini等[34]從造紙廠污水處理系統(tǒng)的污泥中得到1個(gè)混合細(xì)菌體系，馴化后該混合菌系適合降解一些低分子量的PVA，但未分離出能夠單獨(dú)徹底降解PVA的純菌株。陳朝瓊[35]將PVA降解中間產(chǎn)物羥基酮的高效降解菌S-1和 β-雙酮降解菌T-4及PVA降解菌紅球菌P-2和共生菌B1、B2，制成復(fù)合微生物菌劑進(jìn)行廢水處理，發(fā)現(xiàn)其對(duì)PVA的降解效果優(yōu)于活性污泥。郭雅妮等[36-37]研究發(fā)現(xiàn)，其所分離得到的混合菌系對(duì)PVA的降解效率遠(yuǎn)大于單菌株，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步分析了PVA降解菌的復(fù)配組合及誘變處理效果。張潔等[33]和鞠喜等[38]還研究了混合菌系產(chǎn)PVA降解酶的條件，提高了混合菌系的產(chǎn)酶能力。

但無論采取哪種微生物降解模式，都存在諸多限制因素，如作用環(huán)境和工藝對(duì)PVA降解菌生理代謝的影響等。目前對(duì)此也已開展了很多研究，如陳朝瓊等[39]和惠小雙等[40]研究了PVA降解菌采用固定化工藝處理PVA廢水的效果，發(fā)現(xiàn)酶經(jīng)固定化后降解系統(tǒng)更加穩(wěn)定且酶活力更持久。Chiellini等[41]試圖采用堆肥方式對(duì)PVA廢棄物進(jìn)行生物降解處理，但發(fā)現(xiàn)高溫堆肥不利于PVA的生物降解，相同時(shí)間內(nèi)降解程度變差。王志剛等[42]利用水解酸化-好氧工藝研究PVA等物質(zhì)的降解狀況，發(fā)現(xiàn)混合菌系能將大分子物質(zhì)很好地分解成小分子物質(zhì)。Shi等[43]將醬渣、檸檬酸發(fā)酵渣添加到PVA中制作農(nóng)用覆蓋薄膜，有效提高了保水性能和薄膜的生物降解性能。

3 PVA降解菌的降解機(jī)理

微生物能夠降解PVA的根本原因是菌種體內(nèi)降解酶的降解作用。Kawagoshi等[44]從Pseudomonasvesicularisvar.povalolyticusPH的發(fā)酵液中純化出了PVA氧化酶，并詳細(xì)研究了該酶對(duì)醇類物質(zhì)的氧化性。Morita[8]從另一株P(guān)VA降解菌Pseudomonas的發(fā)酵液中也分離到 PVA 氧化酶，每個(gè)酶分子含1個(gè)原子非血紅素鐵，PVA酶活受到Hg2+、Pb2+、Zn2+、鄰菲啰啉和EDTA的輕微抑制。Hatanaka等[45]報(bào)道，Pseudomonassp.113P3能夠單獨(dú)生長(zhǎng)在有吡咯喹啉醌(PQQ)存在的PVA培養(yǎng)基中，但該菌產(chǎn)生的PVA脫氫酶不能以伯醇、仲醇和其他二元醇為底物。

為了進(jìn)一步確定PVA降解酶的作用機(jī)制和分泌機(jī)制，Shimao等[9]克隆出了pvaA和pvaB基因，2種基因編碼的蛋白質(zhì)氨基酸順序與脂蛋白的信號(hào)順序較為相近，表明PVA降解酶可能主要附著于細(xì)胞膜上，而這種酶的分泌對(duì)聚合大分子的降解是必需的；PVA仲醇氧化酶可能的功能是優(yōu)先氧化聚乙烯醇分子中兩兩相鄰的羥基基團(tuán)，PVA 氧化型產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)很不穩(wěn)定，容易自發(fā)水解，而PVA水解酶可加速該水解反應(yīng)。

目前研究較為深入的降解酶是聚乙烯醇氧化酶(仲醇氧化酶)、聚乙烯醇脫氫酶和氧化型聚乙烯醇水解酶(β-雙酮水解酶)3種降解酶。由于被研究菌種不同，PVA降解酶的組合也不同，主要的組合是聚乙烯醇氧化酶與氧化型聚乙烯醇水解酶組合及聚乙烯醇脫氫酶與氧化型聚乙烯醇水解酶組合，且不同組合的降解機(jī)理不盡相同。目前對(duì)于降解酶作用機(jī)理較為一致的觀點(diǎn)是：PVA降解酶的降解作用主要分兩步進(jìn)行。第一步是聚乙烯醇氧化酶(仲醇氧化酶)在氧氣存在條件下，或聚乙烯醇脫氫酶在PQQ存在條件下，將聚乙烯醇氧化脫氫成酮基化合物。關(guān)于第二步反應(yīng)，一種觀點(diǎn)認(rèn)為，聚乙烯醇羥基被聚乙烯醇氧化酶(仲醇氧化酶)催化氧化為酮基，再被聚乙烯醇水解酶催化裂解；而另一種觀點(diǎn)則認(rèn)為，由于酮基型PVA分子結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，其會(huì)自發(fā)進(jìn)行水解反應(yīng)，聚乙烯醇水解酶可能加速了氧化型PVA的裂解反應(yīng)[46-48]。綜上可知，從不同降解菌中分離出來的PVA降解酶性質(zhì)不同，PVA降解途徑多樣，尤其是細(xì)菌和真菌的作用方式差別更大，因此需要對(duì)PVA降解酶的作用機(jī)理進(jìn)行更加深入的研究[49]。筆者所在課題組從分子生物學(xué)角度對(duì)1株具PVA降解功能的解淀粉芽孢桿菌進(jìn)行了研究，對(duì)其進(jìn)行全基因組測(cè)序，與可能的降解酶基因序列進(jìn)行比對(duì)，并構(gòu)建了目的基因的敲除菌株與體外表達(dá)工程菌(相關(guān)結(jié)果尚未發(fā)表)。

4 存在問題與展望

采用生物降解PVA為減少環(huán)境中PVA污染的首選，PVA降解微生物的重要作用更是毋庸置疑。因此，為了環(huán)境的可持續(xù)發(fā)展，需要對(duì)降解微生物進(jìn)行多方面研究。相比PVA降解菌劑，降解酶制劑更加方便有效[50]，PVA降解菌的產(chǎn)酶能力和性能也一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)，但其發(fā)酵周期長(zhǎng)，產(chǎn)酶水平低，酶活不穩(wěn)定，且純化提取比較困難。因此，PVA生物降解酶的產(chǎn)業(yè)化仍存在諸多困難。

對(duì)于PVA降解微生物的研究，筆者認(rèn)為今后可以注重以下幾個(gè)方面：(1)進(jìn)一步篩選高效PVA降解菌株，對(duì)菌株基因進(jìn)行改造修飾，構(gòu)建高表達(dá)菌株；(2)研究各降解菌之間的配伍作用，研制組配降解率高的混合菌菌劑；(3)全面研究PVA的降解途徑、降解酶的作用機(jī)理及合適的降解工藝；(4)研究PVA降解酶基因及其調(diào)控機(jī)理，構(gòu)建基因工程菌以提高產(chǎn)酶水平；(5)研制PVA降解酶的純化提取工藝，與酶工程技術(shù)緊密結(jié)合，使降解酶的酶解性能可以更好發(fā)揮，以實(shí)現(xiàn)降解酶制劑的工業(yè)化生產(chǎn)。