杜晶 汪珊

摘要 目的：正交試驗(yàn)篩選胰蛋白酶提取魚(yú)腥草多糖的最佳工藝。方法：對(duì)胰蛋白酶添加量、溫度、時(shí)間等因素采用L9（34）正交試驗(yàn)法，尋求最佳提取工藝。結(jié)果：最佳提取工藝為溫度45℃，pH=7，酶加入比例2%），提取時(shí)間2.5h。結(jié)論：正交試驗(yàn)法可用于魚(yú)腥草多糖胰蛋白酶提取工藝的優(yōu)選。

關(guān)鍵詞 魚(yú)腥草多糖；胰蛋白酶；正交試驗(yàn)；最佳工藝

鮮魚(yú)腥草屬于蕺菜，以多糖得率、多糖含量為指標(biāo)[1-4]，我們利用正交試驗(yàn)法對(duì)胰蛋白酶提取魚(yú)腥草多糖的最佳工藝進(jìn)行尋找，報(bào)告如下。

資料與方法

儀器和試劑：干品魚(yú)腥草購(gòu)于廣州清平市場(chǎng)，經(jīng)廣東藥學(xué)院中藥鑒定教研室姬生國(guó)博士鑒定為三白草科蕺菜屬植物Houttuvnia cordata Thunb的全草；胰蛋白酶（250 N.F.U/mg）；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品；苯酚、濃硫酸、氨水、95%乙醇均為分析純；苯酚試液（自配）[5]。UV1800紫外一可見(jiàn)分光光度汁；電熱恒溫水浴鍋。SHB3循環(huán)水真空泵，GZX-9240MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱，AY120電子天平。

方法：魚(yú)腥草多糖含量測(cè)定方法的建立。①對(duì)照品溶液的制備：精稱已恒重的葡糖糖對(duì)照品0.0982g，加水溶解并定容至100 mL，再取1 mL，定容至10 mL容量瓶中，得濃度0.0982mg/mL對(duì)照品溶液。②供試液溶液的制備：稱取魚(yú)腥草5.0g，按正交設(shè)計(jì)表提取，得粗多糖。精稱已恒重的粗多糖0.1000g，加水定容至50mL，再移取1mL，定容至10mL，搖勻即得。③標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：精密移取對(duì)照品0.0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，置10 mL容量瓶水定容，于489 nm對(duì)吸收度A進(jìn)行測(cè)定，以吸收度A對(duì)含量C進(jìn)行回歸，得回歸方程：Y=8.428 6X-0.025 8，γ（相關(guān)系數(shù)）=0.995 9。結(jié)果表明良好的線性關(guān)系出現(xiàn)在葡萄糖0.0196-0.0588mg/mL的范圍內(nèi)。④重現(xiàn)性試驗(yàn)：對(duì)50℃干燥至恒重的魚(yú)腥草粗多糖6份進(jìn)行精密稱取，分別置于100mL的容量瓶中復(fù)溶，再取2mL定容至10mL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下的方法操作，測(cè)定吸光度，RSD=0.3%，表明用苯酚一硫酸法進(jìn)行魚(yú)腥草多糖的含量分析，重現(xiàn)性好，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。⑤樣品多糖含量測(cè)定方法：取供試品溶液1mL，置于試管中，加1mL苯酚，5mL濃硫酸，振搖均勻，顯色>40min。置UV1800型分光光度計(jì)中，于489nm測(cè)定吸收度。根據(jù)回歸方程計(jì)算多糖含量。⑥樣品多糖提取的得率：稱取魚(yú)腥草藥材5.0g，按照正交設(shè)計(jì)表進(jìn)行提取，得粗多糖。多糖得率=100%×（粗多糖的量/藥材的量）。魚(yú)腥草多糖的提取方法：精稱魚(yú)腥草藥材5.0g，提取時(shí)按正交設(shè)汁表進(jìn)行，提取液濃縮至原料重：溶液體積1：4，80%乙醇醇沉，靜置>2h，抽濾，將濾餅取出，50℃烘箱烘干，得粗多糖。正交試驗(yàn)法優(yōu)化胰蛋白酶提取魚(yú)腥草多糖工藝：制定因素水平表，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上pH=7，以酶添加量、溫度、時(shí)間為考察因素采用L9（34）正交試驗(yàn)法，衡量提取效率的客觀指標(biāo)選取多糖得率及含量，優(yōu)選最佳提取工藝。

采用加權(quán)評(píng)分法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，把多糖得率、多糖含量與該列最大數(shù)值相比，再×100，即得該項(xiàng)得分。根據(jù)多糖得率（x）和多糖含量（y）的作用，確定兩者的權(quán)重系數(shù)分別為0.4、0.6，加權(quán)求和兩項(xiàng)指標(biāo)得分，通過(guò)公式得到綜合評(píng)分w=0.4x+0.6y。

結(jié)果

由表1得胰蛋白酶提取多糖的影響因素大小順序：A>B>C，其中A、B因素各水平之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。最佳提取條件為AIBIC2，即pH=7.0加入胰蛋白酶2%，溫度45℃，浸提時(shí)間2.5 h。胰蛋白酶酶法提取魚(yú)腥草多糖L9（34）正交試驗(yàn)方案及結(jié)果，見(jiàn)表1。

討論

本試驗(yàn)對(duì)胰蛋白酶提取魚(yú)腥草多糖的工藝進(jìn)行正交試驗(yàn)，用測(cè)量多糖的率和多糖含量為指標(biāo)，綜合各因素的影響，得最佳提取工藝：胰蛋白酶2%，40倍體積的pH=7，45℃溫度下浸提2.5 h。該工藝既保證了得率，又提高了多糖含量，為魚(yú)腥草多糖進(jìn)一步研究提供了理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

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