羅玉瑩，王 艷*，李艷萍

（銀川大學(xué)石油化工學(xué)院，寧夏銀川 750105）

泰樂菌素（tylosin）是從弗氏鏈霉菌的培養(yǎng)液中獲得的一種抗生素，稱為大環(huán)內(nèi)酯類抗生素[1]。作為飼料添加劑，長期過量使用或使用不當(dāng)?shù)慕o禽畜使用抗生素，就會間接對人類的健康構(gòu)成嚴(yán)重的危害，嚴(yán)重者可造成過敏性休克，甚至?xí)＜暗缴?006年歐盟成員國就全面禁止使用抗生素作為促生長劑[2]。目前，大環(huán)內(nèi)酯類獸藥的檢測方法主要有：微生物法[3，4]、氣質(zhì)聯(lián)用法（GC/MS）[5]、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLCMS/MS）[6]、高效液相色譜法（HPLC）[7]。泰樂菌素對分離樣品的要求極高，而高效液相色譜法不僅能實(shí)現(xiàn)很好地分離，準(zhǔn)確進(jìn)行定性和定量分析，還大大降低了分析成本[8]。在牛奶、廢水等介質(zhì)中泰樂菌素檢測都有研究，但有關(guān)雞肉中泰樂菌素的檢測，目前鮮見報(bào)道，所以本文利用高效液相色譜法，作為研究雞肉中的泰樂菌素的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料

1.1.1 供試樣品與標(biāo)樣 泰樂菌素標(biāo)準(zhǔn)品：購自山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司，純度95%。

本實(shí)驗(yàn)研究所用雞肉采集于超市。

1.1.2 儀器與試劑 高效液相色譜儀（LC-20AT日本島津公司）；超聲波清洗儀（KQ-100昆山市超聲儀器有限公司）；臺式離心機(jī)（TDL80-2B上海安亭科技儀器廠制造）；電子天平（FA1104N上海精密科學(xué)儀器有限公司）；紫外-可見分光光度計(jì)（UV-1800蘇州市萊頓科學(xué)儀器有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸干儀（RE-3000A上海越眾儀器設(shè)備有限公司）。

甲醇（色譜純）；乙腈（色譜純）；正己烷（分析純）；乙酸乙酯（分析純）；磷酸二氫鉀（分析純）。

1.2 實(shí)驗(yàn)部分

1.2.1 色譜條件 色譜柱：C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；檢測波長：283.5 nm；流速：1 mL/min；流動(dòng)相是甲醇：（0.04 mol/mL，pH=2.5），磷酸二氫鉀（v：v）=55：45；進(jìn)樣量 20 μL。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)儲備液和混合標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制 準(zhǔn)確稱取10 mg泰樂菌素標(biāo)準(zhǔn)品于干凈的100 mL的容量瓶中，用甲醇溶解定容，配制成濃度100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，4℃避光保存。根據(jù)需要用甲醇逐級稀釋配成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

圖1 流動(dòng)相選擇色譜圖

1.2.3 樣品處理 將超市采集的健康雞肉絞成肉泥，置于冰箱保存。使用時(shí)自然解凍，稱取5.0 g樣品置于50 mL具塞離心管中，加入20 mL甲醇于離心管，超聲10 min，以3 000 r/min離心10 min，收集上清液。向沉淀物再加入20 mL提取劑，重復(fù)前面的操作2～3次，合并上清液。向上清液中加入30 mL正己烷脫脂，振蕩5 min，靜置分層，棄去上層正己烷。在40℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸干，加入甲醇定容至5 mL，0.45 μm濾膜過濾，待測。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取標(biāo)準(zhǔn)工作液，用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度分別為 2 μg/mL、4 μg/mL、8 μg/mL、12 μg/mL 和16 μg/mL溶液。按照1.2.3項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測定，以峰面積與質(zhì)量濃度做線性回歸。

1.2.5 方法的加標(biāo)回收率 本實(shí)驗(yàn)樣品在2.0 μg/mL，3.0 μg/mL，4.0 μg/mL3 個(gè)添加水平下，按 1.2.3 項(xiàng)所描述進(jìn)行樣品處理后HPLC測定，計(jì)算回收率。

1.2.6 方法的精密度 對雞肉樣品提取液重復(fù)進(jìn)樣6次，每次20 μL，記錄每次檢測的峰面積，計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動(dòng)相的優(yōu)化

2.1.1 流動(dòng)相的選擇 研究相同體積比的乙腈：超純水、甲醇：超純水、乙腈：磷酸二氫鉀（0.04 mol/mL，pH=2.5）、甲醇：磷酸二氫鉀（0.04 mol/mL，pH=2.5）4 種流動(dòng)相的色譜分離效果。結(jié)果表明：甲醇：磷酸二氫鉀（0.04 mol/mL，pH=2.5）作為流動(dòng)相峰型對稱、且峰值高。因此采用甲醇：磷酸二氫鉀（0.04 mol/mL，pH=2.5）作為流動(dòng)相（見圖1）。

2.1.2 流動(dòng)相的配比 流動(dòng)相的配比優(yōu)化中，選擇了體積比為 70：30；60：40；55：45；50：50 的甲醇：磷酸二氫鉀（0.04 mol/mL，pH=2.5）作為流動(dòng)相，在選擇體積比為55：45有較好峰型（見圖2）。

圖2 流動(dòng)相不同體積下較優(yōu)色譜圖

2.2 樣品前處理的優(yōu)化

2.2.1 樣品提取劑的優(yōu)化 本實(shí)驗(yàn)分別對比考察了甲醇，乙腈，乙酸乙酯3種溶劑對雞肉樣品中泰樂菌素的提取效果，結(jié)果表明，甲醇提取時(shí)可以得到滿意的回收率，所含雜質(zhì)也較少（見圖3）。

圖3 不同提取劑對泰樂菌素的影響

2.2.2 提取劑體積的優(yōu)化 通過分別比較甲醇體積為10 mL，15 mL，20 mL，25 mL 時(shí)的分離效果，研究表明，甲醇體積為20 mL時(shí)提取效果較好（見圖4）。

圖4 不同體積的提取劑對泰樂菌素的影響

2.3 線性關(guān)系

研究表明：線性范圍為 2 μg/mL～16 μg/mL 時(shí)，以峰面積為縱坐標(biāo)，以泰樂菌素的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，溶液濃度與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性方程為y=6 366.3x-629.49，相關(guān)系數(shù)為 R2=0.999 7（見圖 5）。

圖5 泰樂菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液線性方程和相關(guān)系數(shù)

2.4 加標(biāo)回收率及精密度

在空白的雞肉樣品中進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，回收率在96.33%～101.73%的范圍。在6次進(jìn)樣所得峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于5%（見表1）。

表1 加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

2.5 雞肉樣品的測定

本實(shí)驗(yàn)最終檢測雞肉樣品中泰樂菌素含量為0.029 6 mg/kg，低于我國動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留量標(biāo)準(zhǔn)（0.1 mg/kg）。

3 總結(jié)

高效液相色譜法檢測雞肉中泰樂菌素殘留量的研究，結(jié)果表明，此方法靈敏度較好，對待測樣品的處理要求簡單，實(shí)驗(yàn)的精密度、回收率為較高。本實(shí)驗(yàn)所測泰樂菌素含量為0.029 6 mg/kg，低于最高殘留量符合殘留檢測分析要求。此方法為檢測雞肉中泰樂菌素含量時(shí)，提供了有效的定量分析。