文景芝，張　斌，田　苗,2，揭　巖，趙鈺琦，高新穎，宮麗娟，顧　鑫，丁俊杰，陳宇飛

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱　150030；2.黑龍江省農(nóng)墾科學(xué)院農(nóng)畜產(chǎn)品綜合利用研究所，黑龍江　佳木斯　154007；3.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院佳木斯分院，黑龍江　佳木斯　154007）

由大豆疫霉（Phytophthora sojae Kaufmann&Gerdemann）侵染引起的大豆疫霉根腐?。≒hytophthora root and stem rot，PRR）于1948年在美國首次發(fā)現(xiàn)[1]，隨后日本、巴西、加拿大和阿根廷等國相繼出現(xiàn)[2-3]。蘇彥純等在我國東北地區(qū)分離到大豆疫霉[4]。近年來，PRR在黑龍江省普遍發(fā)生[5]。

簡單重復(fù)序列（Simple Sequence Repeat，SSR）分子標(biāo)記具有多態(tài)性及重復(fù)性好、操作簡便、所需DNA量少和穩(wěn)定快速等特點[6]，廣泛應(yīng)用于植物病原菌遺傳多樣性研究。Cooke等在愛爾蘭馬鈴薯晚疫病菌遺傳多樣性研究中發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯晚疫病菌[Phytophthora infestans（Mont.）de Bary]最早可能由英國傳入[7]；Banniza等利用SSR標(biāo)記法分析科特迪瓦黃瓜立枯病菌（Rhizoctonia solani Kühn）遺傳多樣性，認(rèn)為同一地理來源黃瓜立枯病菌具有顯著遺傳多樣性[8]；黨悅嘉等利用SSR分子標(biāo)記分析黃瓜霜霉病菌（Pseudoperonospora cubensis(Berk.et Curt.)Rostov）遺傳多樣性，表明中國江蘇省、廣東省和湖北省黃瓜霜霉菌遺傳分化較大，群體遺傳多樣性豐富，SSR遺傳多樣性與菌株地理來源存在相關(guān)性[9]。Mohammadi等對伊朗大豆疫霉遺傳多樣性作SSR分析時發(fā)現(xiàn)，即使同一省份大豆疫霉群體也存在較大變異[10]；徐靜靜等利用18對SSR引物分析黑龍江省、福建省和美國大豆疫霉遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)黑龍江省和福建省大豆疫霉遺傳距離最近，美國和福建省大豆疫霉遺傳距離最遠(yuǎn)[11]；范勇利用SSR標(biāo)記分析福建省和黑龍江省大豆疫霉遺傳多樣性，結(jié)果表明黑龍江省群體遺傳變異最小[12]；王子迎等在黑龍江省和安徽省大豆疫霉遺傳多樣性分析中發(fā)現(xiàn)，安徽省群體與黑龍江省群體間遺傳相似性較低，但來源不確定[13]；黑龍江省與湖北省大豆疫霉群體遺傳距離較大[14]。

病原菌遺傳多樣性變化規(guī)律對培育抗病品種至關(guān)重要，培育抗病品種是防治大豆疫霉根腐病最經(jīng)濟有效方法。目前，黑龍江大豆疫霉遺傳多樣性報道較多，但多為單一地塊或某一年不同地區(qū)大豆疫霉遺傳多樣性分析，難以揭示遺傳多樣性規(guī)律。

本試驗連續(xù)4年在大豆疫霉根腐病重病區(qū)黑龍江省東部試驗田和生產(chǎn)田定點采集土壤樣品并分離大豆疫霉，利用SSR分子標(biāo)記方法分析大豆疫霉遺傳多樣性，以闡明黑龍江省東部大豆疫霉群體遺傳多樣性隨時間和空間變化規(guī)律，為利用抗病品種防治大豆疫霉根腐病提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　供試菌株

于2014～2017年，從黑龍江省東部發(fā)病較嚴(yán)重兩塊試驗田和生產(chǎn)田采集土壤樣品。試驗田（SY）分別位于黑龍江省農(nóng)墾科學(xué)院和黑龍江省農(nóng)科院佳木斯分院，生產(chǎn)田（SC）分別位于佳木斯市樺南縣土龍山鎮(zhèn)和佳木斯市樺南縣曙光農(nóng)場一隊。參考王子迎等葉蝶誘捕法分離土壤中大豆疫霉[15]。參考郝中娜等方法作單游動孢子分離培養(yǎng)[16]。參考劉春來等方法作大豆疫霉分子鑒定[17]。參考Tian等和文景芝等方法測定致病性[18-19]。547個菌株經(jīng)形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)及致病性鑒定為大豆疫霉，為本試驗供試菌株（見表1）。

表1　黑龍江省東部大豆疫霉菌株及采集地點Table 1　Phytophthora sojae isolates in eastern Heilongjiang Province and collection sites

1.2　試驗方法

參照Frankham CTAB法提取供試菌株DNA[20]，提取DNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，-20℃保存?zhèn)溆?。采用徐靜靜等方法篩選8對SSR引物（見表2）[11]，由上海生工生物工程有限公司合成。20 μL PCR擴增體系：10 μL Taq PCR Master Mix（購自上海生工生物工程有限公司），上、下游引物各1 μL，模板DNA 1 μL，無菌去離子水7 μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性4 min，94℃變性30 s，40～65℃退火30 s，72℃延伸5 min，40個循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

SSR引物擴增與銀染檢測參照楊喆等方法[21]。記錄電泳譜帶，在電泳圖譜上清晰且可重復(fù)出現(xiàn)條帶記為“1”，相同位置無條帶記為“0”，生成“0”和“1”組成原始矩陣。用DPS 7.05中非加權(quán)平均法（UPGMA）作聚類分析并建立系統(tǒng)分析樹狀圖。用Population Genetic Analysis 1.3.2分析各SSR標(biāo)記在各群體內(nèi)基因頻率、有效等位基因數(shù)、基因多樣性頻率及香農(nóng)信息指數(shù)。

2　結(jié)果與分析

2.1　大豆疫霉群體遺傳多樣性分析

2.1.1SSR擴增

8對SSR引物均擴增出多態(tài)性條帶，多態(tài)性比例最高為94.74%，等位基因變異范圍11～19。8對引物共擴增出123個條帶，其中110個為多態(tài)性條帶，占比89.43%，表明黑龍江省東部大豆疫霉群體具有豐富遺傳多樣性。引物PSG172多態(tài)性最佳，多態(tài)性條帶比例為94.74%，引物PSG113多態(tài)性較差，多態(tài)性條帶比例為78.57%。

表2　8對引物擴增多態(tài)性條帶Table 2　Polymorphic bands amplified by eight pairs of primers

2.1.2遺傳多樣性分析

547個供試菌株基因多態(tài)性位點主要分布在700、450和350 bp，其中450 bp基因位點最多，基因頻率為0.5265，其次為700 bp和350 bp，基因頻率為0.4497；在150～100 bp、＜100 bp和100 bp分布基因頻率較低，分別為0.1371、0.1517和0.1536（見表3）。

547個供試菌株在450 bp處基因多樣性復(fù)雜，有效等位基因數(shù)為1.9944，基因多樣性頻率為0.4986，Shannon信息指數(shù)為0.6917，其次為700和350 bp，有效等位基因數(shù)為1.9800，基因多樣性頻率分別為0.4949，Shannon信息指數(shù)為0.6881。在150～100 bp處基因多樣性程度最小，有效等位基因數(shù)為1.3100，基因多樣性頻率為0.2366，Shannon信息指數(shù)為0.3997，其次為＜100和100 bp，有效等位基因數(shù)為1.3476和1.3513，基因多樣性頻率為0.2574和0.2600，Shannon信息指數(shù)為0.4257和0.4288（見表4）。

表3　大豆疫霉群體基因頻率Table 3　Gene frequency of Phytophthora sojae populations

表4　供試菌株遺傳多樣性參數(shù)分析Table 4　Nei's analysis of genetic diversity in subdivided populations

2.2　大豆疫霉群體遺傳多樣性時間動態(tài)

2.2.1遺傳多樣性時間動態(tài)

大豆疫霉群體基因在2014～2015年分布較均勻，僅700～650 bp處基因頻率大于0.5，為0.5095。但2016～2017年基因分布分散，在250、450、300、700和350 bp處基因頻率均大于0.5，其中250 bp基因頻率最高為0.6361，其余基因頻率分別為0.5646、0.5476、0.5374和0.5170，波動幅度較大（見表5）。由此可見2016～2017年大豆疫霉群體基因變異程度較大。

表5　2014～2015年和2016～2017年大豆疫霉群體部分位點基因頻率Table 5　Gene frequency of partial Phytophthora sojae populations in 2014～2015 and 2016～2017

與2014～2015年相比，2016～2017年有效等位基因數(shù)上升0.1604，基因多樣性頻率上升0.0749，香農(nóng)信息指數(shù)上升0.0921（見表4）。由表4可知，隨時間推移，黑龍江省東部大豆疫霉群體內(nèi)基因變異極顯著，遺傳多樣性更豐富，基因變異頻率提高，說明大豆疫霉群體發(fā)生明顯進(jìn)化。

2.2.2聚類分析

當(dāng)遺傳距離為0.8時，聚類分析可將供試菌株劃分為5個群組（見表6）。A、B、C和D組中均包含所有年份菌株，E組中僅包含2016～2017年菌株，說明2016～2017年菌株遺傳變異程度較高。

2.3　大豆疫霉群體遺傳多樣性空間動態(tài)

2.3.1遺傳多樣性空間動態(tài)

大豆疫霉群體基因在生產(chǎn)田分布較均勻，僅450 bp處基因頻率大于0.5，為0.5037，但試驗田中600和450 bp處基因頻率均大于0.5，其中600 bp基因頻率最高為0.5663，450 bp處基因頻率為0.5484（見表7）?？梢娫囼炋锎蠖挂呙谷后w基因變異程度較大。

與生產(chǎn)田相比，試驗田群體有效等位基因數(shù)上升0.0427，基因多樣性頻率上升0.0110，香農(nóng)信息指數(shù)上升0.0101（見表4）。表明黑龍江省東部不同地塊間大豆疫霉群體基因發(fā)生變化，試驗田大豆疫霉群體遺傳多樣性較豐富，基因變異頻率略高于生產(chǎn)田。

2.3.2聚類分析

當(dāng)遺傳距離為0.84時，聚類分析可將供試菌株劃分為6個群組，A、B、C、D和E組中均包含試驗田和生產(chǎn)田菌株，可見不同地塊間大豆疫霉群體可能存在基因交流。F組僅包含8個試驗田菌株，說明試驗田群體遺傳多樣性略高于生產(chǎn)田群體（見表8）。

表6　2014～2015年和2016～2017年大豆疫霉群體UPGMA聚類分析結(jié)果Table 6　Results of UPGMA Cluster analysis of Phytophthora sojae populations in 2014～2015 and 2016～2017

表7　生產(chǎn)田和試驗田大豆疫霉群體部分位點基因頻率Table 7　Gene frequency of partial Phytophthora sojae populations in production and experimental fields

表8　生產(chǎn)田和試驗田大豆疫霉群體UPGMA聚類分析結(jié)果Table 8　Results of UPGMA cluster analysis of Phytophthora sojae populations in production and experimental fields

3　討論與結(jié)論

病原菌豐富遺傳多樣性是病害系統(tǒng)中寄主與病原物相互作用結(jié)果。更換寄主品種增大對病原物選擇壓力，病原物種群發(fā)生變異，再通過基因交流、有性雜交及基因突變等形式導(dǎo)致種群及遺傳結(jié)構(gòu)改變，產(chǎn)生遺傳多樣性。遺傳多樣性是評價病原物種群進(jìn)化潛能及抵御生存壓力能力重要指標(biāo)[20,25]。

為避免大豆品種基因型對土壤中大豆疫霉基因型的選擇性偏差，本試驗直接從土壤而非病株中分離大豆疫霉。SSR分子標(biāo)記廣泛應(yīng)用于植物病原菌遺傳多樣性研究，其分子標(biāo)記結(jié)果反映基因型差異，不受空間和時間限制，可精確揭示群體間遺傳多樣性。本試驗采用8對SSR引物對大豆疫霉均可擴增出多態(tài)性條帶，多態(tài)性比例較高，表明SSR標(biāo)記引物選擇恰當(dāng)，適用于大豆疫霉遺傳多樣性研究[11]。

本文首次用SSR分子標(biāo)記分析大豆疫霉群體時間和空間變化規(guī)律，結(jié)果顯示隨時間推移，黑龍江省東部大豆疫霉群體遺傳多樣性更復(fù)雜。Gally等阿根廷大豆疫霉群體RAPD分析結(jié)果認(rèn)為是大豆疫霉群體與寄主長期互作結(jié)果[26]。試驗田群體遺傳多樣性略高于生產(chǎn)田群體，但增幅小，說明不同地塊間大豆疫霉遺傳多樣性差異不明顯，與殷麗華報道黑龍江省東部不同地區(qū)間大豆疫霉群體遺傳多樣性變化較小結(jié)論一致，但本試驗采集菌株數(shù)更多，結(jié)果可信度更高[27]。根據(jù)本試驗結(jié)果推測，未來幾年黑龍江東部大豆疫霉群體遺傳多樣性更加復(fù)雜，基因變異頻率相應(yīng)提高。中國不同地區(qū)大豆疫霉群體存在廣泛遺傳變異[28]，我國福建省、美國大豆疫霉群體與黑龍江省大豆疫霉群體遺傳相似性較低，表明不同地區(qū)間大豆疫霉遺傳多樣性差異較大[29]。本試驗發(fā)現(xiàn)不同試驗田和生產(chǎn)田群體遺傳多樣性差異不顯著，原因可能是供試菌株雖來自不同地塊，但整體上仍屬于同一地理區(qū)域，符合生物進(jìn)化規(guī)律。

本試驗采用8對SSR引物分析547株大豆疫霉群體遺傳多樣性，結(jié)果表明，黑龍江省東部大豆疫霉群體具有豐富遺傳多樣性。隨時間推移，大豆疫霉群體發(fā)生明顯進(jìn)化，表現(xiàn)在群體內(nèi)基因發(fā)生顯著變異，基因變異頻率相應(yīng)提高，遺傳多樣性更加豐富；試驗田大豆疫霉菌群體遺傳多樣性較豐富，基因變異頻率略高于生產(chǎn)田。由于本試驗供試大豆疫霉菌株均采自發(fā)病嚴(yán)重的黑龍江省東部地區(qū)，存在區(qū)域局限性，后續(xù)應(yīng)擴大樣品采集范圍，對各省市大豆疫霉群體作深入研究，監(jiān)測各地區(qū)大豆疫霉群體遺傳多樣性動態(tài)變化，為科學(xué)合理使用抗病品種提供依據(jù)。