楊向會(huì) 陳 晟 吳 敬

(1. 江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；2. 江南大學(xué)生物工程學(xué)院工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；3. 江南大學(xué)教育部食品安全國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122)

普魯蘭酶是一種脫支酶，能夠?qū)Ｒ坏厮庵ф湹矸?或普魯蘭多糖等相關(guān)聚合物)中α-1,6-糖苷鍵[1]，所以普魯蘭酶在淀粉加工工業(yè)得到了廣泛的應(yīng)用。普魯蘭酶與淀粉水解酶(α-淀粉酶、β-淀粉酶)復(fù)配使用時(shí)，淀粉質(zhì)原料的利用率明顯提高，對(duì)節(jié)約成本和提高產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率有重要意義，因此普魯蘭酶是淀粉加工中不可或缺的非大宗關(guān)鍵酶制劑[2-3]。

早期國(guó)內(nèi)外有關(guān)普魯蘭酶的研究主要集中在菌株的篩選上[4-6]，許多產(chǎn)普魯蘭酶的微生物被發(fā)現(xiàn)，但由于多數(shù)的野生菌株發(fā)酵產(chǎn)普魯蘭酶的酶活較低，限制了其在工業(yè)上的應(yīng)用。因此，對(duì)野生菌來(lái)源的普魯蘭酶在工程菌中進(jìn)行異源表達(dá)，以提高蛋白表達(dá)量，成為目前研究主流。至今已從多種微生物中克隆出普魯蘭酶基因并對(duì)其進(jìn)行異源表達(dá)[7-8]，但重組后的普魯蘭酶表達(dá)仍存在產(chǎn)量低或不能有效分泌的問(wèn)題。為解決此類(lèi)問(wèn)題，Duan等[9]通過(guò)分階段控制發(fā)酵溫度和添加甜菜堿的方法，使普魯蘭酶的可溶性表達(dá)量和胞外分泌得到顯著提高。Zou等[10]通過(guò)流加甘氨酸使普魯蘭酶的胞外酶活提高了22.6倍。來(lái)源于Bacillusacidopullulyticus的普魯蘭酶具有良好的酶學(xué)性質(zhì)(耐酸，耐熱)，最適溫度60 ℃，最適pH 5.0，可以和多種淀粉水解酶復(fù)配使用，能夠滿(mǎn)足淀粉工業(yè)應(yīng)用的要求。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有蛋白表達(dá)水平高、易于高密度發(fā)酵等眾多優(yōu)點(diǎn)[11]，已有多達(dá)60%的重組蛋白在大腸桿菌系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)[12]。

Chen等[13]在大腸桿菌中重組表達(dá)來(lái)源于Bacillusacidopullulyticus的普魯蘭酶，并在5 L發(fā)酵罐水平進(jìn)行發(fā)酵，在發(fā)酵溫度20 ℃條件下酶活達(dá)1 156 U/mL；其誘導(dǎo)溫度過(guò)低無(wú)法在工業(yè)上實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)；針對(duì)此問(wèn)題，本研究擬將Bacillusacidopullulyticus普魯蘭酶在大腸桿菌中進(jìn)行重組表達(dá)，并對(duì)重組菌進(jìn)行3 L發(fā)酵罐發(fā)酵優(yōu)化，在本研究中采用工業(yè)生產(chǎn)上可實(shí)現(xiàn)的發(fā)酵溫度25 ℃，大幅度提高了普魯蘭酶的表達(dá)量和胞外酶活，以期為普魯蘭酶的工業(yè)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌E.coliJM 109和BL21(DE3)：本實(shí)驗(yàn)室保藏；

帶有NcoⅠ和Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)的重組質(zhì)粒pET20b(+)-BapulA：由上海捷瑞公司合成，其中普魯蘭酶基因BapulA(GeneBank Accession No.Ax203843.1)來(lái)源于Bacillusacidopullulyticus。

1.1.2 培養(yǎng)基

搖瓶TB培養(yǎng)基：K2HPO4·3H2O 16.43 g/L，KH2PO42.31 g/L，酵母粉24 g/L，甘油5 g/L，蛋白胨12 g/L，甜菜堿2.4 g/L；

發(fā)酵罐基礎(chǔ)培養(yǎng)基：KH2PO413.5 g/L，MgSO4·7H2O 1.4 g/L，(NH4)2HPO44.0 g/L，C6H8O7·H2O 1.7 g/L，工業(yè)酵母粉2 g/L，工業(yè)蛋白胨1 g/L，甘油8 g/L，微量金屬液10 mL，甜菜堿5 g/L；

發(fā)酵罐補(bǔ)料培養(yǎng)基：MgSO4·7H2O 18.35 g/L，工業(yè)酵母粉4.8 g/L，甘油600 g/L，工業(yè)蛋白胨2.4 g/L。

1.1.3 主要試劑

NcoⅠ和Hind Ⅲ：分子級(jí)，寶生物工程(大連)有限公司；

普魯蘭多糖：分析純，東京化成工業(yè)株式會(huì)社；

甘氨酸：分析純，國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司。

1.1.4 主要儀器

發(fā)酵罐：BioFlo /celliGen115型，德國(guó)Eppendorf NBS公司；

高效液相色譜系統(tǒng)：安捷倫1200型，美國(guó)Agilent公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 搖瓶培養(yǎng) 將菌株從甘油管中接種于LB培養(yǎng)基中，在37 ℃，200 r/min下培養(yǎng)8 h。以5%的接種量轉(zhuǎn)接至50 mL TB培養(yǎng)基內(nèi)，在200 r/min，37 ℃下，OD600為1.0～1.2 時(shí)，加入0.05 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)，25 ℃培養(yǎng)48 h。

1.2.2 發(fā)酵罐培養(yǎng)

(1) 種子培養(yǎng)：將菌株從甘油管中接種至100 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min下培養(yǎng)8～9 h。

(2) 3 L發(fā)酵罐培養(yǎng)：將種子培養(yǎng)液按10%接種量接種至發(fā)酵罐中，加入終濃度為100 μg/mL的氨芐霉素，初始溫度設(shè)定為30 ℃或37 ℃，維持溶氧30%，通過(guò)補(bǔ)加氨水來(lái)維持pH為7.0。當(dāng)發(fā)酵罐中甘油耗盡，溶氧快速反彈時(shí)，開(kāi)始流加補(bǔ)料培養(yǎng)基。當(dāng)OD600分別達(dá)到25，50，75時(shí)，降溫至25 ℃，此時(shí)調(diào)節(jié)pH 到6.2，同時(shí)以一定流速流加乳糖進(jìn)行誘導(dǎo)，期間用20%的磷酸和氨水控制pH為6.2。在發(fā)酵過(guò)程中，當(dāng)OD600達(dá)到15，45，75，105時(shí)，根據(jù)試驗(yàn)需要補(bǔ)加一定量的甘氨酸。

1.3 分析方法

1.3.1 普魯蘭酶酶活力的測(cè)定 將0.1 mL稀釋一定倍數(shù)的普魯蘭酶液(空白加高溫滅活的普魯蘭酶)加入到1.9 mL的普魯蘭多糖溶液中，60 ℃反應(yīng)10 min，加入3 mL的DNS溶液終止反應(yīng)后，在沸水中反應(yīng)7 min，加去離子水補(bǔ)足15 mL。在540 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光值。普魯蘭酶酶活定義為：每分鐘生成1 μmol還原糖的酶量定義為一個(gè)酶活力單位。

1.3.2 甘氨酸含量的測(cè)定 將待測(cè)發(fā)酵液在12 000 r/min離心5 min，棄沉淀，在上清液中按1∶1的體積比加入100 g/L 的三氯乙酸。充分混勻后，在室溫下靜置2 h，12 000 r/min 下離心40 min，將離心后的上清液過(guò)濾，所得樣品即可用于高效液相(HPLC)檢測(cè)。

色譜條件：色譜柱Agilent Eclipse XDB-C18(250 mm × 4.6 mm)，柱溫40 ℃，流速0.8 mL/min，檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)338 nm，洗脫方式為梯度洗脫。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組菌株的構(gòu)建與發(fā)酵

將質(zhì)粒pET20b(+)-BapulA熱激轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)感受態(tài)，涂布于帶有氨芐霉素抗性的平板，挑選單菌落至10 mL LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)8 h提取質(zhì)粒，并用NcoⅠ和Hind Ⅲ進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，結(jié)果見(jiàn)圖1。從圖1(a)可知，電泳條帶與理論值一致，表明重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌成功，得到重組菌E.coliBL21(DE3)/pET20b(+)-BapulA。將該菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，培養(yǎng)48 h后取發(fā)酵液進(jìn)行離心、破壁。胞外上清和胞內(nèi)上清中的最高酶活分別為6.5，35.6 U/mL，最高總酶活為41.1 U/mL。將胞外上清、胞內(nèi)上清進(jìn)行蛋白電泳檢測(cè)[見(jiàn)圖1(b)]，條帶大小均與重組蛋白理論分子量(約102 kDa)一致，表明來(lái)源于Bacillusacidopullulyticus的普魯蘭酶在大腸桿菌中成功表達(dá)。

M. 蛋白Marker (200 kDa) 1. 胞外上清 2. 胞內(nèi)上清圖1 重組大腸桿菌的構(gòu)建和重組普魯蘭酶的SDS-PAGE

Figure 1 Construction of recombinantE.coliand SDS-PAGE analysis of recombinant pullulanase

2.2 生長(zhǎng)階段溫度對(duì)重組菌生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響

在3 L發(fā)酵罐高密度發(fā)酵生產(chǎn)重組普魯蘭酶的過(guò)程中，本研究對(duì)重組菌生長(zhǎng)階段分別采取不同的培養(yǎng)溫度以探究溫度對(duì)重組菌生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。重組菌生長(zhǎng)階段的溫度分別為30，37 ℃，誘導(dǎo)溫度均為25 ℃。與起始發(fā)酵溫度37 ℃相比，起始發(fā)酵溫度在30 ℃條件下最終菌體生物量(OD600)略低，見(jiàn)圖2(a)。從圖2(b)～(d)可知，與生長(zhǎng)階段溫度為37 ℃相比，在生長(zhǎng)階段溫度為30 ℃條件下更有利于產(chǎn)酶，該條件下普魯蘭酶的最高胞內(nèi)酶活和胞外酶活分別達(dá)684.1，240.1 U/mL，最高總酶活為890.6 U/mL。據(jù)報(bào)道，pET-20b(+)質(zhì)粒在表達(dá)外源蛋白時(shí)往往伴隨著目的蛋白的本底表達(dá)[11]，重組大腸桿菌在較低溫度下的生長(zhǎng)會(huì)通過(guò)減少形成無(wú)活性的包涵體來(lái)提高可溶性蛋白的比例[14]，而在較高的生長(zhǎng)溫度下目的蛋白的本底表達(dá)會(huì)引起宿主細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)，這種應(yīng)激反應(yīng)最終導(dǎo)致目的蛋白形成聚集體并在細(xì)胞內(nèi)積累，這對(duì)發(fā)酵后期菌體的產(chǎn)酶不利[11]。因此，在發(fā)酵過(guò)程中控制菌體的生長(zhǎng)階段溫度為30 ℃。

2.3 誘導(dǎo)階段pH對(duì)重組菌生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響

大腸桿菌生長(zhǎng)過(guò)程中，pH過(guò)高或者過(guò)低，都會(huì)導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)異常，需要控制pH范圍以保證菌體正常生長(zhǎng)和產(chǎn)酶。因此，本研究在分別控制誘導(dǎo)階段pH為6.2，7.0的條件下，考察了pH對(duì)重組菌生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

在重組菌的搖瓶發(fā)酵過(guò)程中，當(dāng)發(fā)酵液的pH>7.0時(shí)，普魯蘭酶的酶活力迅速下降，在48 h發(fā)酵結(jié)束后，酶活僅為3.2 U/mL[見(jiàn)圖3(a)]。若在發(fā)酵過(guò)程中，每隔一段時(shí)間，通過(guò)添加20%磷酸以維持發(fā)酵液的pH 在6.2～7.0，普魯蘭酶的活力會(huì)隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，普魯蘭酶的酶活最高達(dá)201.0 U/mL。重組普魯蘭酶的最適pH為5.0，當(dāng)pH過(guò)高時(shí)，重組酶酶活顯著下降[15]。從圖3(b)中可以看出，重組酶在室溫放置48 h后，pH 6.2下的該酶殘余酶活顯著高于pH 7.0的。綜上，發(fā)酵液pH維持在6.2最佳。

從搖瓶發(fā)酵結(jié)果可以看出，誘導(dǎo)階段發(fā)酵液的pH顯著影響重組菌產(chǎn)酶，因此在重組菌3 L發(fā)酵罐發(fā)酵過(guò)程中需對(duì)誘導(dǎo)階段的pH進(jìn)行優(yōu)化。與誘導(dǎo)階段發(fā)酵液pH為7.0時(shí)相比，pH為6.2，盡管菌體生物量有所降低[見(jiàn)圖3(c)]，但是在該條件下普魯蘭酶最高胞內(nèi)酶活[見(jiàn)圖3(d)]、胞外酶活[見(jiàn)圖3(e)]和總酶活[見(jiàn)圖3(f)]分別是pH 7.0 條件下的1.12，17.65，1.40倍。

2.4 乳糖流加速率對(duì)重組菌生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響

鑒于乳糖誘導(dǎo)強(qiáng)度對(duì)目的蛋白表達(dá)有重要影響，本研究對(duì)乳糖流加速率進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果見(jiàn)圖4。從圖4(a)可知，當(dāng)乳糖流加速度為0.2，0.4 g/(L·h)時(shí)，最高菌體濃度(OD600)分別為129，120；而當(dāng)乳糖流加速率為0.6 g/(L·h)時(shí)，菌體濃度(OD600)顯著降低，說(shuō)明低誘導(dǎo)強(qiáng)度對(duì)重組菌生長(zhǎng)影響較小，而較高的誘導(dǎo)強(qiáng)度則可能由于代謝壓力大而導(dǎo)致菌體濃度降低。由圖4(b)～(d)可以看出，乳糖的流加速率對(duì)重組菌產(chǎn)酶也有顯著影響，誘導(dǎo)強(qiáng)度過(guò)低或過(guò)高都不利于產(chǎn)酶，最佳的乳糖流加速率是0.4 g/(L·h)，在此條件下，普魯蘭酶的最高胞內(nèi)酶活和胞外酶活分別達(dá)到684.1，240.1 U/mL，總酶活達(dá)到890.6 U/mL。

圖3 pH對(duì)重組菌生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響以及室溫下重組普魯蘭酶的pH穩(wěn)定性Figure 3 Effect of pH on OD600 and pullulanase production in induction stage and pH stability of recombinant pullulanase at room temperature

2.5 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)重組菌生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響

誘導(dǎo)時(shí)間也是影響大腸桿菌表達(dá)重組蛋白的條件之一，合適的誘導(dǎo)時(shí)間既可使菌體高效生長(zhǎng)，又不影響目的蛋白的產(chǎn)量[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，盡管在菌體OD600為15時(shí)，向發(fā)酵液中加入7.5 g/L甘氨酸，但是胞外分泌效率依然較低。因此，分別在菌體濃度OD600達(dá)到25，50，75時(shí)開(kāi)始誘導(dǎo)，考察了誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)重組菌生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。

從圖5可知，當(dāng)誘導(dǎo)OD600為25，50時(shí)，重組菌最終生物量均較低，而當(dāng)誘導(dǎo)OD600為75時(shí)，菌體濃度顯著提高。在重組菌產(chǎn)酶過(guò)程中，誘導(dǎo)OD600為25時(shí)，菌體產(chǎn)酶最低，可能是菌體濃度較低時(shí)誘導(dǎo)易導(dǎo)致菌體過(guò)早產(chǎn)酶，因而不利于菌體的良好生長(zhǎng)，最終影響產(chǎn)酶，重組酶酶活偏低。當(dāng)誘導(dǎo)OD600為50時(shí)，重組普魯蘭酶的最高胞內(nèi)酶活和胞外酶活分別為684.1，240.1 U/mL，總酶活達(dá)到890.6 U/mL；在誘導(dǎo)OD600為75時(shí)，重組酶酶活下降，可能是在菌體濃度過(guò)高時(shí)誘導(dǎo)，菌體的細(xì)胞膜通透性變差，不利于目的蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)。綜合菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶情況，最佳誘導(dǎo)時(shí)間為OD600達(dá)到50時(shí)。

2.6 分批加入甘氨酸對(duì)重組菌生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響

雖然通過(guò)以上多個(gè)條件的優(yōu)化，普魯蘭酶的表達(dá)量得到了大幅度提高，但是大部分蛋白都位于周質(zhì)空間，并未分泌到胞外?？赡苁怯捎趐ET-20b(+)載體上的PelB信號(hào)肽主要用于外源蛋白在周質(zhì)空間的積累，難以到達(dá)胞外；或者所用條件不利于重組酶分泌[7]。為了提高胞外表達(dá)水平，需要研究增強(qiáng)胞外分泌的方法，本研究嘗試加入甘氨酸以提高胞外酶活。文獻(xiàn)[17]報(bào)道，在培養(yǎng)基中添加一定濃度甘氨酸有助于普魯蘭酶的胞外分泌，而高濃度(>5 g/L)的甘氨酸則會(huì)抑制菌體生長(zhǎng)。因此，通過(guò)分批加入適量的甘氨酸以維持發(fā)酵液中的甘氨酸濃度在1～5 g/L，可能達(dá)到既不影響菌體生長(zhǎng)，又能促進(jìn)目的蛋白胞外分泌的目的。甘氨酸優(yōu)化的具體策略如下：① 在菌體濃度OD600依次達(dá)到15，45，75時(shí)分別加入濃度為1.5 g/L的甘氨酸，菌體濃度OD600達(dá)到105時(shí)，再加入濃度為3 g/L的甘氨酸；② 在菌體濃度OD600依次達(dá)到15，45，75時(shí)分別加入濃度為2.5 g/L的甘氨酸，菌體濃度OD600達(dá)到105時(shí)，再加入濃度為5 g/L的甘氨酸；③ 在菌體濃度OD600依次達(dá)到15，45，75時(shí)分別加入濃度為4 g/L的甘氨酸，菌體濃度OD600達(dá)到105時(shí)，再加入濃度為8 g/L的甘氨酸，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖4 乳糖流加速度對(duì)重組菌生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響Figure 4 Effect of lactose flow rates on OD600 and pullulanase production

圖5 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)重組菌生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響Figure 5 Effect of induced point on OD600 and pullulanase production

從圖6 可知，與策略②和策略③相比，在策略①的條件下，菌體濃度和胞內(nèi)酶活、胞外酶活以及總酶活均為最高。在此策略下加入到發(fā)酵液中的甘氨酸濃度較低，在之后的短時(shí)間內(nèi)甘氨酸即被耗盡[見(jiàn)圖6(e)]，表明加入低濃度的甘氨酸可在不影響重組菌生長(zhǎng)的同時(shí)促進(jìn)重組酶的胞外分泌；最終最高胞外酶活和胞內(nèi)酶活分別達(dá)到659.0，1 331.2 U/mL，最高總酶活為1 910.1 U/mL。甘氨酸能使細(xì)胞膜的通透性增強(qiáng)，有效促進(jìn)目的蛋白分泌，但較高濃度的甘氨酸易導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)受到抑制，菌體濃度和產(chǎn)酶也隨之降低。研究結(jié)果表明，分批加入適宜濃度的甘氨酸可有效促進(jìn)普魯蘭酶的胞外分泌，從而提高普魯蘭酶的可溶性表達(dá)，因此，采用策略①來(lái)提高重組普魯蘭酶可溶性表達(dá)和胞外分泌是可行的。

3 結(jié)論

本研究的目的是在3 L發(fā)酵罐水平上提高重組菌E.coliBL 21(DE3)/ pET20b(+)-BapulA的普魯蘭酶的表達(dá)量和胞外分泌。重組蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)會(huì)受到多因素的影響，如發(fā)酵過(guò)程中的溫度、pH和誘導(dǎo)濃度等。經(jīng)過(guò)以上策略的優(yōu)化，重組普魯蘭酶的最高總酶活達(dá)到1 910.1 U/mL，與搖瓶最高總酶活相比，提高了9.5倍。在后續(xù)研究中，還可通過(guò)選擇其他表達(dá)載體，以減少重組酶本底表達(dá)；或者優(yōu)化信號(hào)肽，以期獲得高效的重組蛋白胞外分泌效率，為普魯蘭酶的工業(yè)應(yīng)用提供依據(jù)。

圖6 甘氨酸濃度對(duì)重組菌生長(zhǎng)產(chǎn)酶的影響以及發(fā)酵液中甘氨酸殘余濃度Figure 6 Effect of glycine concentration on OD600 and pullulanase production and glycine residues in fermentation broth