胡 菲 湯 婷 張 佳 劉燕燕 蔣愛民 蔣 卓

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642)

高壓脈沖電場(chǎng)(PEF)是近年來(lái)研究最多的非熱殺菌技術(shù)之一[1]，是一種新型的食品綠色加工技術(shù)[2]，相比熱加工方法殺菌，脈沖電場(chǎng)處理能更大限度保持食品的品質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)和風(fēng)味[3]。PEF較早用于水果的預(yù)處理以達(dá)到提高果汁提取率的目的，現(xiàn)在已實(shí)現(xiàn)商業(yè)規(guī)模[4]。近年來(lái)，高壓脈沖電場(chǎng)在食品殺菌、鈍酶、物質(zhì)提取[5]、酒類催陳[6]、農(nóng)藥殘留降解[7]等加工領(lǐng)域的應(yīng)用十分廣泛[8]，在經(jīng)皮給藥[9]39-40、基因轉(zhuǎn)染[10]、腫瘤治療[11]等生物醫(yī)學(xué)效應(yīng)及其治療作用上的應(yīng)用也逐漸被關(guān)注。

在食品工業(yè)，PEF的研究主要集中于食品殺菌、鈍酶、提取、改性等方面[12]。在食品殺菌中，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為其殺菌是高壓脈沖電場(chǎng)對(duì)細(xì)胞膜的作用，“電穿孔”和“點(diǎn)崩潰”是目前被廣泛接受的2種學(xué)說[13]。針對(duì)PEF鈍酶作用，多數(shù)學(xué)者[12,14]認(rèn)為，其鈍酶的機(jī)理為影響酶的結(jié)構(gòu)。Wang等[15]通過研究PEF對(duì)辣根過氧化物的影響發(fā)現(xiàn)其二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)均會(huì)發(fā)生變化；張若兵等[4]對(duì)PEF處理后的過氧化酶和果膠甲基酯酶進(jìn)行圓二色譜和熒光光譜分析，發(fā)現(xiàn)其二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。Perez等[16]借助透射電子顯微鏡觀察PEF處理后的蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)脈沖電場(chǎng)會(huì)引起蛋白質(zhì)顆粒聚集，導(dǎo)致蛋白質(zhì)粒徑增大，從而提出PEF會(huì)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化，會(huì)對(duì)食品蛋白質(zhì)組分的結(jié)構(gòu)與功能產(chǎn)生影響；具體表現(xiàn)為：在PEF處理?xiàng)l件下，蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)中自由電子、離子和其他帶電荷離子發(fā)生移動(dòng)和極化，分子偶極距方向的改變?cè)黾樱鸬鞍踪|(zhì)介電常數(shù)的改變，而進(jìn)一步影響到蛋白質(zhì)分子的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，但不會(huì)影響其一級(jí)結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)分子的展開會(huì)使分子內(nèi)疏水基團(tuán)和巰基暴露，從而引起蛋白質(zhì)活性位點(diǎn)的改變和其功能特性的改變。蛋白質(zhì)分子的展開導(dǎo)致水分子進(jìn)入其中，使得蛋白質(zhì)分子間的氫鍵相互作用增強(qiáng)，形成蛋白質(zhì)分子聚集[17]。蛋白質(zhì)分子聚集分為蛋白質(zhì)聚集(aggregation)和蛋白質(zhì)自組裝(self-assembly) 2種，其中蛋白質(zhì)自組裝會(huì)形成蛋白質(zhì)納米纖維或生成蛋白質(zhì)納米管。

天然存在的蛋白質(zhì)納米管，如煙草花病毒，具有特殊的生物學(xué)功能[11]。通過蛋白質(zhì)自組裝形成的蛋白質(zhì)納米管，其功能和物理性質(zhì)都有很大提高，是先進(jìn)功能材料的基礎(chǔ)材料，在生物治療領(lǐng)域，可作為細(xì)胞的發(fā)動(dòng)機(jī)、泵和模擬自然系統(tǒng)的人造纖維支架，具有很大的應(yīng)用前景[18]。近年來(lái)，不少學(xué)者在研究蛋白質(zhì)納米管的形成及其機(jī)理。劉燕燕等[19] 14 [20]探究了在金屬離子存在條件下，經(jīng)PEF處理，卵清蛋白會(huì)形成蛋白質(zhì)納米管。Niu[9]39用原子力顯微鏡觀察和分析蛋白質(zhì)納米管，并預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)納米管可以用來(lái)作為藥物載體和組織工程。Graveland-Bikker[21]在制備水解的-乳清蛋白納米管時(shí)發(fā)現(xiàn)金屬離子的存在是乳清蛋白納米管形成的另一個(gè)先決條件。劉燕燕[19]14-19的研究表明，卵清蛋白納米管的形成與添加的金屬離子的價(jià)態(tài)有關(guān)，一價(jià)金屬離子(Na+)和三價(jià)金屬離子(Fe3+)對(duì)蛋白質(zhì)納米管的形成作用不大，二價(jià)金屬離子中：Ca2+、Ba2+、Mn2+和Cu2+更易形成結(jié)構(gòu)清晰的蛋白質(zhì)納米管。為了更清晰地研究二價(jià)金屬離子對(duì)蛋白質(zhì)納米管形成的影響機(jī)理，在前人研究的基礎(chǔ)上，探究其形成機(jī)理，以彌補(bǔ)此方面研究的空白；本試驗(yàn)在卵清蛋白溶液里，添加金屬離子Ca2+、Ba2+、Mn2+和Cu2+以改變蛋白質(zhì)溶液的電化學(xué)環(huán)境，通過測(cè)定溶液的氧化還原電位，zeta電位以及電導(dǎo)率的變化尋求脈沖電場(chǎng)和蛋白質(zhì)納米管形成之間的規(guī)律，探究金屬離子和PEF協(xié)同對(duì)蛋白質(zhì)電化學(xué)性質(zhì)的影響機(jī)制，為脈沖電場(chǎng)的應(yīng)用及蛋白質(zhì)的利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

卵清蛋白：美國(guó)Sigma公司；

脈沖電場(chǎng)處理裝置：SY-Z-500型，華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院自行研制；

旋片真空泵：2XZ-2型，浙江臺(tái)州求精真空泵有限公司；

冷卻裝置：DLSB-30000 型，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；

電導(dǎo)率儀：DDS-11A型，上海雷磁·創(chuàng)益儀器儀表有限公司；

zeta電位分析儀：Nano-zs&MPT-2型，上海思百吉儀器系統(tǒng)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)流程

卵清蛋白制備→透析→加金屬離子→脫氣→脈沖電場(chǎng)處理→測(cè)定指標(biāo)

1.2.2 卵清蛋白處理流程 卵清蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為45 000，按照卵清蛋白樣品質(zhì)量(一般以20 g為準(zhǔn))配制0.000 44 mol蛋白質(zhì)溶液樣品，Mn2+、Cu2+、Ca2+、Ba2+與卵清蛋白摩爾比分別為6∶1，4∶1，4∶1，4∶1，攪勻待用。

1.2.3 脈沖電場(chǎng)處理 對(duì)加入不同金屬離子的卵清蛋白進(jìn)行單個(gè)和多個(gè)脈沖處理。處理前，保證樣品中沒有氣泡。處理過程中采用4 ℃的恒溫冷卻水對(duì)處理后的樣品進(jìn)行及時(shí)冷卻，確保樣品通過電場(chǎng)的溫度一致。采用電子恒流泵，控制樣品的流速為25 mL/min。脈沖波寬度設(shè)置為20 μs，電場(chǎng)強(qiáng)度分別設(shè)置為14，20 kV/cm，分多次操作。當(dāng)樣品經(jīng)脈沖電場(chǎng)處理1，2，3，4次時(shí)，其對(duì)應(yīng)處理時(shí)間分別為565，1 130，1 695，2 230 μs，脈沖頻率1 000 Hz，處理前電導(dǎo)率為139 μS/cm。

1.2.4 zeta電位檢測(cè) 根據(jù)文獻(xiàn)[22]修改如下：溫度設(shè)定為25 ℃，由zeta電位分析儀直接測(cè)定。

1.2.5 電導(dǎo)率檢測(cè) 根據(jù)文獻(xiàn)[23]修改如下：溫度設(shè)定為20 ℃，啟動(dòng)電導(dǎo)率分析儀，檢測(cè)3次，取平均值。

1.2.6 氧化還原電位檢測(cè) 根據(jù)文獻(xiàn)[24]，采用差分脈沖伏安法和三電極的工作方式測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 PEF和不同金屬離子協(xié)同作用對(duì)蛋白質(zhì)溶液zeta電位的影響

由圖1可以看出，金屬離子的添加均增加了卵清蛋白的zeta電位，不同金屬離子和PEF協(xié)同處理對(duì)卵清蛋白溶液zeta電位的影響不同。

Ba2+協(xié)同PEF導(dǎo)致卵清蛋白zeta值呈遞減趨勢(shì)，其原因有可能是卵清蛋白分子與Ba2+形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的電位絕對(duì)值隨著脈沖電場(chǎng)輸入能量的增大而增大，脈沖電場(chǎng)對(duì)蛋白質(zhì)分子極化程度增加。Cu2+協(xié)同PEF處理后的卵清蛋白zeta電位呈現(xiàn)減小趨勢(shì)。Mn2+和PEF協(xié)同處理的卵清蛋白zeta電位呈現(xiàn)先增大后減小趨勢(shì)，對(duì)比未經(jīng)PEF處理的蛋白樣品，脈沖處理時(shí)間為565，1 130，1 695 μs時(shí)，zeta電位都呈現(xiàn)不同程度的增加，當(dāng)脈沖處理時(shí)間為2 260 μs時(shí)，zeta電位下降，說明蛋白質(zhì)分子可能發(fā)生了聚集。Ca2+和PEF協(xié)同作用對(duì)卵清蛋白zeta電位的影響有相似的規(guī)律，呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，在脈沖處理時(shí)間為1 130 μs時(shí)，zeta電位最大，說明蛋白質(zhì)分子展開程度增加，Ca2+在蛋白質(zhì)分子間搭橋作用明顯，蛋白質(zhì)分子和Ca2+之間最大程度網(wǎng)絡(luò)化；隨著脈沖處理時(shí)間繼續(xù)增大到1 650，2 260 μs時(shí)，zeta電位下降，說明蛋白質(zhì)分子可能發(fā)生聚集。

2.2 PEF和不同金屬離子協(xié)同作用對(duì)蛋白質(zhì)溶液電導(dǎo)率的影響

由圖2可以看出，PEF單獨(dú)作用對(duì)蛋白質(zhì)溶液電導(dǎo)率的影響不大。

由圖3可以看出，隨著脈沖處理時(shí)間的延長(zhǎng)，添加了4種金屬離子的蛋白質(zhì)溶液的電導(dǎo)率均呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，其中Ca2+離子的添加對(duì)蛋白溶液的電導(dǎo)率影響最大。與未添加金屬離子的對(duì)照組對(duì)比，不同金屬離子對(duì)未經(jīng)PEF處理的蛋白質(zhì)溶液電導(dǎo)率有明顯差別，說明不同金屬離子和蛋白質(zhì)分子的螯合作用不同。Ca2+的添加對(duì)卵清蛋白溶液電導(dǎo)率影響最大，說明Ca2+與蛋白質(zhì)分子之間形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)最明顯。當(dāng)脈沖處理時(shí)間為565 μs時(shí)，添加Ba2+和Ca2+的蛋白質(zhì)溶液電導(dǎo)率達(dá)到最大，當(dāng)脈沖處理時(shí)間為1 650 μs時(shí)，添加Cu2+的蛋白質(zhì)溶液電導(dǎo)率達(dá)到最大值。之后隨著脈沖時(shí)間的延長(zhǎng)，電導(dǎo)率都有明顯的下降，說明蛋白質(zhì)分子發(fā)生聚集，金屬離子分布在蛋白質(zhì)分子聚集體內(nèi)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶液電導(dǎo)率下降。

圖1 PEF協(xié)同不同金屬離子對(duì)蛋白質(zhì)溶液zeta電位的影響Figure 1 The effect of PEF and different metal ions on the zeta potential of protein solution

場(chǎng)強(qiáng)為20 kV/cm，脈寬20 μs圖2 PEF對(duì)蛋白質(zhì)溶液電導(dǎo)率的影響Figure 2 Effect of PEF on conductivity of protein solution

2.3 不同場(chǎng)強(qiáng)PEF和Ca2+協(xié)同作用對(duì)蛋白質(zhì)溶液電導(dǎo)率的影響

根據(jù)上述研究，發(fā)現(xiàn)Ca2+對(duì)zeta電位和電導(dǎo)率影響較大。為研究場(chǎng)強(qiáng)對(duì)溶液電化學(xué)性質(zhì)的影響，選取Ca2+與PEF協(xié)同作用，觀察不同場(chǎng)強(qiáng)對(duì)溶液電導(dǎo)率的影響。試驗(yàn)時(shí)，Ca2+濃度不變，改變電場(chǎng)場(chǎng)強(qiáng)及脈沖時(shí)間，蛋白質(zhì)溶液的電導(dǎo)率見圖4。未添加Ca2+金屬離子未經(jīng)PEF處理的蛋白質(zhì)溶液電導(dǎo)率為0.299 mS/cm，添加Ca2+但未經(jīng)PEF處理的蛋白質(zhì)溶液電導(dǎo)率有明顯差別，呈顯著提高，說明Ca2+和蛋白質(zhì)分子之間存在較強(qiáng)的締合作用。當(dāng)脈沖場(chǎng)強(qiáng)為14 kV/cm，添加Ca2+的蛋白質(zhì)溶液的電導(dǎo)率隨著脈沖處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)減小的趨勢(shì)，其原因是蛋白質(zhì)分子有可能發(fā)生聚集，Ca2+分布在蛋白質(zhì)分子聚集體內(nèi)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶液電導(dǎo)率下降。當(dāng)脈沖場(chǎng)強(qiáng)為20 kV/cm時(shí)，添加Ca2+的蛋白質(zhì)溶液呈現(xiàn)先減小后增大的趨勢(shì)。二者相比，高場(chǎng)強(qiáng)的脈沖電場(chǎng)處理后，蛋白質(zhì)溶液的電導(dǎo)率比經(jīng)過低場(chǎng)強(qiáng)處理的蛋白質(zhì)溶液高。其原因可能是高場(chǎng)強(qiáng)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)分子正極化，低場(chǎng)強(qiáng)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)分子負(fù)極化，高場(chǎng)強(qiáng)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)溶液內(nèi)游離離子增加。

2.4 PEF和不同金屬離子協(xié)同作用對(duì)蛋白質(zhì)溶液氧化還原電位的影響

除上述指標(biāo)外，還研究了PEF和不同金屬離子協(xié)同作用對(duì)蛋白質(zhì)溶液氧化還原電位的影響。在卵清蛋白溶液中分別按比例加入確定質(zhì)量的Ca2+、Ba2+、Cu2+和Mn2+，采用差分脈沖伏安法和三電極的工作方式，利用電化學(xué)工作站，生成伏安圖像，分析PEF和不同金屬離子協(xié)同作用對(duì)蛋白質(zhì)溶液氧化還原電位的影響。PEF和不同金屬離子協(xié)同作用后，蛋白質(zhì)溶液氧化還原電位見圖5～8。

如圖5所示，隨著處理次數(shù)的增加，電流曲線增幅下降，Ca2+樣品的電活性下降，且未呈現(xiàn)明顯的峰電流。從Ca2+伏安圖中也可以看出，控制樣品(未添加鈣離子且未經(jīng)過電場(chǎng)處理)的電活性最強(qiáng)，可知經(jīng)過低場(chǎng)強(qiáng)脈沖電場(chǎng)處理后樣品電活性下降，可導(dǎo)電物質(zhì)能力和數(shù)量減少。

場(chǎng)強(qiáng)為20 kV/cm，脈寬20 μs圖3 PEF協(xié)同不同金屬離子對(duì)蛋白質(zhì)溶液電導(dǎo)率的影響Figure 3 Effect of PEF cooperating with different metal ions on conductivity of protein solution

圖4 不同場(chǎng)強(qiáng)PEF協(xié)同Ca2+對(duì)蛋白質(zhì)溶液電導(dǎo)率的影響

Figure 4 Effects of different field strengths of PEF and Ca2+on the conductivity of protein solution

如圖6所示，隨著處理次數(shù)的增加，電流曲線下降，Ba2+樣品的電活性下降，且未呈現(xiàn)明顯的峰電流，曲線之間呈現(xiàn)遞減規(guī)律。從Ba2+伏安圖中也可以看出，控制樣品(未添加離子且未經(jīng)過電場(chǎng)處理)的電活性最強(qiáng)，因此也可以斷定脈沖電場(chǎng)處理后樣品電活性下降，可導(dǎo)電物質(zhì)能力和數(shù)量減少。

如圖7所示，蛋白質(zhì)溶液空白樣電流小，Cu2+的添加增加了卵清蛋白溶液的峰電流。隨著脈沖電場(chǎng)處理時(shí)間的增加，出現(xiàn)峰電流，未添加金屬離子的控制樣品和添加金屬離子后均沒有峰電流值。當(dāng)脈沖處理時(shí)間為565，1 130，1 695，2 260 μs，峰電流值分別為1.59E-07(0.78 V)，1.69E-07(0.7 V)，1.82E-07(0.68 V)，1.86E-07(0.66 V)A，呈現(xiàn)遞增規(guī)律。說明脈沖電場(chǎng)和金屬Cu2+協(xié)同增加了蛋白質(zhì)分子的電活性，Cu2+在蛋白質(zhì)分子間搭橋作用明顯，蛋白質(zhì)分子間相互作用增強(qiáng)，形成了電活性比較穩(wěn)定的自組裝結(jié)構(gòu)。隨著脈沖電場(chǎng)輸入能量持續(xù)增加，脈沖電場(chǎng)對(duì)蛋白質(zhì)分子極化程度增加。

圖5 PEF協(xié)同Ca2+對(duì)氧化還原電位的影響Figure 5 Effect of PEF and Ca2+ on Redox Potential

圖6 PEF協(xié)同Ba2+對(duì)氧化還原電位的影響Figure 6 Effect of PEF and Ba2+ on Redox Potential

圖7 PEF協(xié)同Cu2+對(duì)氧化還原電位的影響Figure 7 Effect of PEF and Cu2+ on Redox Potential

圖8 PEF協(xié)同Mn2+氧化還原電位的影響Figure 8 Effect of PEF and Mn2+ on Redox Potential

如圖8所示，蛋白質(zhì)溶液空白樣電流小，Mn2+的添加增加了卵清蛋白溶液的峰電流。隨著脈沖電場(chǎng)處理時(shí)間的延長(zhǎng)，出現(xiàn)峰電流，未添加金屬離子的控制樣品峰電流值為9.67E-08 A(0.732 V)，添加金屬離子后峰電流值為1.24E-06 A(0.824 V)。當(dāng)脈沖處理時(shí)間為565，1 130，1 695，2 260 μs時(shí)，峰電流值分別為5.57E-06(0.76 V)，6.99E-06(0.74 V)，7.53E-06(0.74 V)，7.56E-06(0.74 V) A，呈現(xiàn)遞增規(guī)律。說明脈沖電場(chǎng)和金屬M(fèi)n2+協(xié)同增加了蛋白質(zhì)分子的電活性，誘導(dǎo)蛋白質(zhì)分子和金屬離子締合，形成較大顆粒網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)分子間通過Mn2+相互作用，形成了電活性比較穩(wěn)定的自組裝結(jié)構(gòu)。當(dāng)脈沖處理時(shí)間為1 130 μs時(shí)，脈沖電場(chǎng)和金屬離子協(xié)同作用誘使蛋白質(zhì)生成粒度較大的納米材料。

綜上，添加Ca2+和Ba2+的蛋白質(zhì)溶液，隨著處理次數(shù)的增加電流下降，溶液內(nèi)可導(dǎo)電物質(zhì)以及導(dǎo)電能力下降，而添加了Cu2+和Mn2+的蛋白質(zhì)溶液，均出現(xiàn)峰電流，形成了較穩(wěn)定的自組裝結(jié)構(gòu)。

3 結(jié)論

金屬離子的加入都能影響PEF下蛋白質(zhì)納米管的形成，卵清蛋白與金屬離子間會(huì)發(fā)生螯合作用，Ca2+協(xié)同PEF處理時(shí)在蛋白質(zhì)分子間搭橋作用最明顯，分子間呈現(xiàn)最大程度網(wǎng)絡(luò)化，PEF處理1 130 μs時(shí)作用最明顯，之后蛋白質(zhì)分子發(fā)生聚集。且在高場(chǎng)強(qiáng)下誘導(dǎo)蛋白質(zhì)溶液內(nèi)游離離子增加，蛋白質(zhì)分子正極化，低場(chǎng)強(qiáng)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)分子負(fù)極化。Cu2+協(xié)同PEF處理也會(huì)使蛋白質(zhì)分子發(fā)生聚集，蛋白質(zhì)分子間相互作用增強(qiáng)，形成了電活性比較穩(wěn)定的自組裝結(jié)構(gòu)。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)脈沖電場(chǎng)對(duì)蛋白質(zhì)與金屬離子的螯合有加強(qiáng)作用，可進(jìn)一步探究脈沖電場(chǎng)在提高高蛋白飲料中礦物質(zhì)的結(jié)合率上的應(yīng)用，從而提供礦物元素的吸收，為脈沖電場(chǎng)的應(yīng)用開拓新領(lǐng)域。