荊凌華，劉松年，馬利敏，楊海平

（河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院 血液科，河南 洛陽 471023）

慢性粒細(xì)胞白血?。╟hronic myelocytic leukemia,CML）是一種起源于造血干細(xì)胞的惡性增殖性疾病，以t（9∶22）（q34∶q11）染色體易位形成的BCRABL融合基因?yàn)橹饕卣?，該基因編碼的BCR-ABL融合蛋白可以持續(xù)性活化酪氨酸激酶活性。酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor, TKI）伊馬替尼作為首個(gè)上市的分子靶向藥物，能夠抑制BCR-ABL蛋白激酶，在CML的靶向治療方面取得很好的效果。然而隨著臨床的廣泛應(yīng)用，部分患者出現(xiàn)耐藥性。伊馬替尼耐藥性是由多種機(jī)制引起的，其中BCR-ABL激酶的點(diǎn)突變是最常見的耐藥機(jī)制[1-2]。第2代TKIs尼洛替尼和達(dá)沙替尼等能夠克服大部分突變體產(chǎn)生的耐藥性，但對T315I突變型BCR-ABL激酶引起的耐藥無效，已有多項(xiàng)研究表明，尼洛替尼能夠安全有效地治療伊馬替尼耐藥或不耐受的CML患者，表現(xiàn)出很好的應(yīng)用前景[3-5]。本研究從基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omnibus, GEO）中下載尼洛替尼和伊馬替尼處理后CML細(xì)胞的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，篩選出因TKIs處理而改變的差異基因并進(jìn)行生物信息學(xué)挖掘，闡明TKIs對CML基因表達(dá)和功能的影響以及分子機(jī)制，為白血病的靶向治療提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

從在線GEO數(shù)據(jù)庫中下載GSE19567數(shù)據(jù)集，該數(shù)據(jù)集由Bruennert D和Neumann F提交，包含12個(gè)樣品的表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)（GSM487683-GSM487694）。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案為CML細(xì)胞系K562以0.05 μmol尼洛替尼或0.50 μmol伊馬替尼處理24 h，對照組以DMSO處理，分別提取處理后K562細(xì)胞的總RNA，采用GPL571檢測平臺，即Affymetrix Human Genome U133A 2.0 Array進(jìn)行芯片檢測，各有4個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2 方法

1.2.1 差異表達(dá)基因篩選 將下載的GSE19567數(shù)據(jù)集CEL文件輸入BRB-ArrayTools軟件，進(jìn)行基因芯片信號值的預(yù)處理、標(biāo)準(zhǔn)化和過濾，然后采用SAM方法統(tǒng)計(jì)各個(gè)樣品中每個(gè)基因的顯著水平P值和誤判率Q值，篩選差異表達(dá)基因（differentially expressed genes,DEGs）的標(biāo)準(zhǔn)為P＜0.05，Q＜0.05，差異倍數(shù)≥2倍。同時(shí)計(jì)算基因與樣本間的相關(guān)性，按照先基因、后樣本的順序?qū)EGs表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行層次聚類分析，連接方法為Average Link。

1.2.2 GO功能富集分析 基因本體（gene ontology,GO）是標(biāo)準(zhǔn)化的基因功能分類體系，包括細(xì)胞組分、分子功能和生物過程3個(gè)類別。本研究把篩選的DEGs向GO數(shù)據(jù)庫（http://www.geneontology.org/）映射，計(jì)算每個(gè)GO條目映射到的差異基因數(shù)目，采用Fisher檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)GO富集的概率值，并用Benjamini-Hochberg法進(jìn)行調(diào)整以控制錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate, FDR），顯著富集GO條目的標(biāo)準(zhǔn)為P＜0.05，F(xiàn)DR＜0.05。

1.2.3 KEGG通路富集分析 KEGG數(shù)據(jù)庫有助于把基因及其表達(dá)情況以整體網(wǎng)絡(luò)形式進(jìn)行全面研究，能夠從大規(guī)模分子水平信息注解生物系統(tǒng)的高級功能。本研究基于KEGG數(shù)據(jù)庫，采用Fisher精確檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)DEGs在Pathway中的富集程度，P＜0.05和FDR＜0.05的pathway定義為顯著富集的pathway。

1.2.4 互作網(wǎng)絡(luò)分析 基于KEGG數(shù)據(jù)庫中基因表達(dá)產(chǎn)物之間的相互作用，在Pathway數(shù)據(jù)庫內(nèi)搜索DEGs的正向和反向基因，再依據(jù)差異基因與其正反向作用關(guān)系描繪基因間的連接線，圓圈表示基因，線段表示相互作用，從而構(gòu)建基因互作網(wǎng)絡(luò)。以Pathway為單位，利用圖論的方法將顯著富集的Pathway根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫中的相互關(guān)系構(gòu)建pathway互作網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)而分析顯著性Pathway之間的傳導(dǎo)關(guān)系[6]。

2 結(jié)果

2.1 差異基因篩選結(jié)果

下載GEO數(shù)據(jù)庫中的GSE19567數(shù)據(jù)集，以DMSO處理的K562細(xì)胞為對照組，尼洛替尼或伊馬替尼處理的K562細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組，根據(jù)篩選標(biāo)準(zhǔn)，從尼洛替尼處理的CML細(xì)胞表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)中篩選出1 517個(gè)DEGs，包括上調(diào)基因328個(gè)，下調(diào)基因1 189個(gè)，層次聚類圖見圖1；從伊馬替尼處理的CML細(xì)胞表達(dá)譜數(shù)據(jù)中篩選出692個(gè)DEGs，包括上調(diào)基因250個(gè)，下調(diào)基因442個(gè)，層次聚類圖見圖2。取交集后共得到519個(gè)DGEs，包括上調(diào)基因177個(gè)，下調(diào)基因342個(gè)，部分差異基因見表1。

2.2 GO功能富集分析

圖1 尼洛替尼影響的差異基因聚類分析

圖2 伊馬替尼影響的差異基因聚類分析

表1 部分差異表達(dá)基因列表

將篩選出的DEGs進(jìn)行GO功能注釋后發(fā)現(xiàn)，顯著富集的生物過程類別共264個(gè)GO條目，主要涉及小分子代謝、血液凝固、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞增殖與凋亡調(diào)控等；顯著富集的分子功能類別共80個(gè)GO條目，主要集中在蛋白結(jié)合、蛋白二聚化活性、序列特異性DNA結(jié)合和ATP結(jié)合等。GO富集分析中生物過程類別和分子功能類別富集水平最顯著的前10個(gè)GO條目見表2、3。

2.3 KEGG通路富集分析

以KEGG數(shù)據(jù)庫中的Pathway為單位，將篩選出的DEGs向整個(gè)背景基因組映射，結(jié)果發(fā)現(xiàn)代謝通路、氨基酸合成、PI3K-Akt通路和Jak-STAT通路等60個(gè)Pathway顯著富集，其中富集水平最顯著的前10個(gè)Pathway見表4。

表2 差異基因GO富集分析（生物過程類別）

表3 差異基因GO富集分析（分子功能類別）

表4 差異基因pathway富集分析

2.4 互作網(wǎng)絡(luò)分析

根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫中蛋白質(zhì)之間的作用關(guān)系而構(gòu)建的基因互作網(wǎng)絡(luò)圖見圖3，圓點(diǎn)為差異基因，連線表示2個(gè)差異基因間的作用關(guān)系。圓點(diǎn)的大小代表betweenness值，圓點(diǎn)越大，表明該差異基因在互作網(wǎng)絡(luò)中越重要，網(wǎng)絡(luò)中的核心基因包括SHMT2（betweenness=142）、CBS（betweenness=108）、CTH（betweenness=108）、HK2（betweenness=64）。 基 于KEGG數(shù)據(jù)庫中信號通路的正反向關(guān)系，構(gòu)建pathway之間的互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖（見圖4），圓點(diǎn)表示通路，帶箭頭的實(shí)線表示兩個(gè)通路之間的上下游關(guān)系。圓點(diǎn)大小代表degree值，圓點(diǎn)越大，表明與之有正反向關(guān)系的通路數(shù)目越多，在網(wǎng)絡(luò)中的作用也越重要，核心pathway包括MAPK信號通路（degree=18）、細(xì)胞凋亡（degree=15）、細(xì)胞周期（degree=14）和腫瘤通路（degree=14），其中腫瘤通路是上游調(diào)控通路，MAPK信號通路、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期主要作為反向效應(yīng)通路。

圖3 差異基因相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

圖4 Pathway相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

3 討論

BCR-ABL激酶能夠活化PI3K、Ras、Jak-STAT等信號通路，干擾正常的細(xì)胞周期和增殖分化，促進(jìn)白血病的發(fā)生和發(fā)展。伊馬替尼高度特異地占據(jù)BCRABL激酶非活化構(gòu)象上的ATP結(jié)合位點(diǎn)，阻礙ATP的鳥嘌呤與BCR-ABL結(jié)合和ATP磷酸化，進(jìn)而顯著抑制ABL酪氨酸激酶的催化活性，特異地抑制BCR-ABL細(xì)胞的增殖。以甲基咪唑環(huán)置換伊馬替尼的N-甲基哌嗪基團(tuán)，并在苯環(huán)上連接三氟甲基，得到新型高親和力ATP競爭性抑制劑尼洛替尼。尼洛替尼也是結(jié)合非活化構(gòu)象的ABL激酶，使P-環(huán)折疊覆蓋ATP結(jié)合位點(diǎn)，形成BCR-ABL激酶的無活性構(gòu)象[7]。有研究表明，伊馬替尼和尼洛替尼也能夠有效抑制血小板衍化生長因子（platelet-derived growth factor, PDGF）和c-Kit受體的酪氨酸激酶[8-9]。BCR-ABL激酶抑制劑從單靶點(diǎn)發(fā)展至多靶點(diǎn)，不斷提高其有效性和選擇性，以克服各種突變型激酶引起的耐藥。

為進(jìn)一步探索尼洛替尼與伊馬替尼在治療CML時(shí)對基因表達(dá)和功能的影響，本研究從GEO數(shù)據(jù)庫中下載GSE19567數(shù)據(jù)集，對TKIs處理后CML細(xì)胞的表達(dá)譜進(jìn)行分析，共篩選出519個(gè)差異基因。GO功能和KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)該差異基因主要涉及小分子代謝、血液凝固、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞增殖與凋亡調(diào)控等生物學(xué)過程，主要參與代謝通路、氨基酸合成、PI3K-Akt通路和Jak-STAT通路等Pathway?；蚧プ骶W(wǎng)絡(luò)分析篩選的核心基因包括SHMT2、CBS、CTH、HK2，MAPK信號通路、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期和腫瘤通路等核心Pathway在Pathway互作網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮主要作用，該基因和通路可能是TKIs抑制白血病的潛在靶點(diǎn)。SHMT2基因編碼絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶2，主要催化甘氨酸合成，也參與一碳代謝、細(xì)胞增殖調(diào)控等過程。CBS基因編碼胱硫醚β合酶，涉及同型半胱氨酸、胱氨酸、絲氨酸等氨基酸代謝過程。有研究發(fā)現(xiàn)[10]，CBS表達(dá)水平與巨核細(xì)胞白血病中成髓細(xì)胞對阿糖胞苷的敏感性密切相關(guān)。胱硫醚-γ-裂解酶CTH催化胱硫醚轉(zhuǎn)變?yōu)榘腚装彼幔婕昂虬被岽x、促進(jìn)NF-κB轉(zhuǎn)錄因子活性、抑制凋亡信號通路等過程。HK2在葡萄糖穩(wěn)態(tài)、缺血反應(yīng)、凋亡線粒體改變、線粒體膜滲透性調(diào)控等過程發(fā)揮作用，在急性髓系白血病FLT3/ITD突變通過上調(diào)線粒體中HK2的表達(dá)引起有氧糖酵解增加，使得白血病細(xì)胞高度依賴于糖酵解；另外三氧化二砷能夠抑制HK2，而HK2的過表達(dá)減少三氧化二砷所誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[11-13]。TKIs處理后CML細(xì)胞中SHMT2、CBS、CTH、HK2等基因表達(dá)下調(diào)，引起代謝通路和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路變化，活化MAPK、Jak-STAT信號通路，阻滯細(xì)胞周期，最終抑制白血病細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡。

總之，TKIs影響CML細(xì)胞代謝通路和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的相關(guān)基因，通過激活MAPK通路、細(xì)胞周期阻滯和誘導(dǎo)凋亡等分子機(jī)制抑制白血病，為白血病的分子靶向治療提供基礎(chǔ)，對設(shè)計(jì)和開發(fā)新型BCR-ABL激酶抑制劑也提供有價(jià)值的指導(dǎo)。