饒麗莎　王培　張家君　黃田盛　　　 許珊珊　曹光球　林思祖

(福建農林大學, 福州,350002)　　　　　　　　(國家林業(yè)局杉木工程技術研究中心(福建農林大學林學院))

杉木(Cunninghamialanceolata(Lamb．) Hook．)是我國南方重要的速生用材樹種[1]。我國一些杉木主產區(qū)常年夏季高溫少雨，冬季寒冷干燥，極端低溫和干旱現象頻發(fā)且土壤富鐵鋁化嚴重[2]。因此，杉木在生長過程中經常遭受各種逆境脅迫(鋁毒害、低溫和干旱等)，此類環(huán)境因素限制了杉木的生長。逆境脅迫容易引起植物體內活性氧代謝失衡，導致植物體內活性氧大量積累造成氧化損傷，最終使植物生長受抑。逆境脅迫下，為保護細胞免受活性氧的傷害，植物在長期進化過程中，建立了一套酶促和非酶促系統組成的抗氧化體系。超氧化物歧化酶(SOD)作為酶促抗氧化系統中重要的組成部分，在清除植物體內超氧陰離子自由基，減輕其對細胞的損傷，維持細胞膜的結構和功能中起著十分關鍵的作用[3]。SOD是一類廣泛存在于植物體內的金屬酶類，根據金屬輔基的不同通常將SOD分為3種不同的類型，即Cu/Zn-SOD、Mn-SOD和Fe-SOD[4]。研究表明在這3種不同類型的SOD中，Mn-SOD在清除活性氧中尤為關鍵，是需氧生物生存必不可缺的一種SOD，與植物眾多抗逆性密切相關[5-6]。研究發(fā)現煙草Mn-SOD基因轉化苜蓿(MedicagosativaLinn)植株，Mn-SOD活性顯著提高[7]。類似的研究結果在水稻[8]中也有發(fā)現，因此Mn-SOD基因對于清除活性氧維持植物正常生理功能具有重要意義。近年來在芥菜(Brassicajuncea(L.) Czern. et Coss.)[9]、茄子(SolanummelongenaL.)[10]、茶樹(Camelliasinensis)[11]、小麥(TriticumaestivumL.)[12]、銀杏(GinkgobilobaL.)[13]、蓮(NymphaeaL.)[14]等植物中克隆獲得Mn-SOD基因并進行了逆境脅迫下的表達分析，進一步證實了Mn-SOD基因在調控植物對逆境脅迫耐性中具有重要作用。

目前對杉木Mn-SOD基因在逆境脅迫下的分子機理未見報道。鑒于此，本研究根據已克隆的Mn-SOD基因序列，運用qRT-PCR技術探究不同逆境脅迫下杉木Mn-SOD基因的表達情況，為進一步探究杉木Mn-SOD基因在逆境脅迫中的功能及抗逆育種的分子機制提供理論依據。

1　材料與方法

1.1　植物材料

以杉木020組培苗作為試驗材料，選取長勢大小一致的組培苗接種到MS液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度25 ℃，濕度70%，光照周期為16 h光照/8 h黑暗，有效光輻射150 μmol·m-2·s-1。預培養(yǎng)1周后分別用4 ℃低溫、0.054 6 g·mL-1甘露醇、2 mmol·L-1鋁離子和300 mmol·L-1的NaCl進行脅迫。采用3組重復試驗，取在未處理(CK)和脅迫培養(yǎng)下不同時間點的組培苗(低溫脅迫0、6、12、24、48、96 h；干旱脅迫0、12、24、48 h；鋁脅迫0、6、12、24、48 h；鹽脅迫0、12、24、48 h)，取成熟未處理的杉木組培苗的根、莖和葉，用于組織特異性表達。液氮冷凍后保存于-80 ℃冰箱備用。

1.2　總RNA的提取和cDNA的合成

取100 mg杉木組培苗加入液氮迅速研磨，直至研磨成粉末狀，采用天根公司的多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取總RNA。利用紫外分光光度計和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質量。采用TaKaRa生物公司的PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒進行cDNA第一鏈合成。

1.3　qRT-PCR分析

試驗以杉木Actin為內參基因，設計引物F1：5’-CAGCAACTGGGATGATATGG-3’，R1：5’-ATTTCGCTTTCAGCAGTGGT-3’；根據擴增得到的杉木Mn-SOD基因設計引物F2：5’-TGACAGCCACTGTCTTGAAA-3’，R2：5’-ACTATTAAACCTCTCTGCCAGTT-3’。

qPCR反應采用TaKaRa生物公司的SYBR?Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)試劑盒，在ABI7500熒光定量PCR儀上進行試驗。反應條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，40個循環(huán)。

1.4　數據處理

選用2-ΔΔCT法對目的基因的相對表達量進行計算。其中：ΔΔCT=(試驗組ΔCT)-(對照組ΔCT)；試驗組ΔCT=(試驗組目的基因CT)-(試驗組內參基因CT)[15]。

2　結果與分析

2.1　杉木總RNA檢測

提取各脅迫處理的杉木總RNA，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果見圖1。RNA3條帶完整，28S的亮度為18S的2倍，5S的亮度最淡。OD值均在1.8～2.0，可知樣品總RNA完整性好，可進行后續(xù)cDNA合成試驗。

M為2000DNA相對分子質量標準；1為總RNA。

2.2　杉木Mn-SOD基因的表達量

2.2.1不同脅迫下杉木Mn-SOD基因的表達

由表1可知，與對照組相比，短時間(6 h)低溫脅迫(4 ℃)處理能誘導Mn-SOD基因相對表達量增加；隨脅迫時間延長，Mn-SOD基因相對表達量呈現出先增加后降低的趨勢，當低溫脅迫時間達到12 h時，Mn-SOD基因相對表達量達到峰值，此時Mn-SOD基因相對表達量是對照的47.94倍。繼續(xù)延長脅迫時間至96 h內，Mn-SOD基因相對表達量則出現急劇下調，盡管此時Mn-SOD相對表達量下降，但仍顯著高于對照處理，是對照組的18.65倍。

在干旱脅迫下，隨時間的推移，Mn-SOD基因的相對表達量呈先上升后下降的趨勢。12 h時Mn-SOD基因相對表達量出現急劇上調且顯著高于對照組，是對照組的3.29倍。處理24 h時相對表達量降低至對照組的0.85倍，繼續(xù)延長脅迫時間至48 h，Mn-SOD基因的相對表達量仍呈下降趨勢，是對照組的0.64倍。

經2 mmol·L-1鋁離子脅迫，Mn-SOD基因的相對表達量隨著時間延長總體呈現上升的趨勢，且均顯著高于對照組的相對表達量。短時間(6 h)鋁脅迫就能誘導Mn-SOD基因表達量增加，當鋁脅迫時間達到24 h的時候Mn-SOD基因表達量達到峰值，此時Mn-SOD基因表達量是對照的22.21倍。繼續(xù)延長脅迫時間至48 h，Mn-SOD基因表達量呈現下調的趨勢，盡管此時Mn-SOD表達量下降，但仍顯著高于對照處理。

鹽脅迫可在一定程度上破壞植物體內的離子平衡和滲透壓，從而引起植物體內代謝紊亂，導致活性氧積累，從而造成自由基傷害。杉木組培苗中Mn-SOD基因表達量在48 h內呈顯著上升的趨勢，相對表達量均顯著高于對照組，12～24 h時Mn-SOD基因的相對表達量是對照的9倍左右，在48 h時Mn-SOD基因相對表達量達到峰值，此時Mn-SOD基因表達量是對照的33.88倍。

表1　不同脅迫下杉木Mn-SOD基因相對表達量

注：不同小寫字母表示處理間顯著性水平P<0.05。

2.2.2杉木Mn-SOD基因的組織特異性表達

Mn-SOD基因在成熟未處理的杉木根、莖和葉中均有表達，但相對表達量存在顯著差異。Mn-SOD基因在葉中表達水平最高，莖的相對表達量次之，在根中的相對表達量最低。將根中的Mn-SOD基因相對表達量作為對照，莖中的相對表達量為根的3.96倍，葉片中的相對表達量為根的4.93倍(表2)。

表2　杉木Mn-SOD基因在不同組織部位的相對表達量

注：不同小寫字母表示處理間顯著性水平P<0.05。

3　討論與結論

在正常生長條件下，植物體內活性氧自由基的產生和清除始終保持著動態(tài)平衡，當植物遭受外界脅迫時，這種動態(tài)平衡就會被打破，從而導致活性氧迅速積累。當活性氧累積超過植物自身調節(jié)能力時，就會發(fā)生膜脂過氧化并引發(fā)連鎖反應，導致細胞膜系統受損，細胞內組分外滲，引起代謝紊亂。為保護細胞免受活性氧的損害，在長期進化過程中植物建立一套由酶性抗氧化系統(如超氧化物歧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶等)和非酶性抗氧化系統(如抗壞血酸和谷胱甘肽)組成的抗氧化防御體系[16]。超氧化物歧化酶是清除活性氧的第一道防線，主要催化超氧物陰離子自由基(O2-)歧化形成過氧化氫(H2O2)，隨后在過氧化物酶和過氧化氫酶的作用下形成水，保護細胞免受傷害[17-18]。超氧化物歧化酶活性與植物的耐氧化性、耐旱性之間呈正相關，且受到相應超氧化物歧化酶基因的表達調控。植物轉基因試驗研究發(fā)現，檉柳(TamarixchinensisLour.)中克隆的Mn-SOD基因轉化到酵母基因組中，其抗干旱、高溫能力明顯提高[19]。轉Mn-SOD基因仙客來(Cyclamenpersicum)植株對高溫脅迫的抗性也有所提高[20]。相同的結果在西伯利亞蓼(PolygonumsibiricumLaxm.)中也發(fā)現，其PsMnSOD基因提高了酵母對鹽堿脅迫的抗性[21]。

本研究通過實時熒光定量PCR發(fā)現低溫脅迫下杉木組培苗中Mn-SOD基因表達也受到迅速誘導(6 h)，在12 h時達到峰值，隨后其表達量迅速下降。導致基因Mn-SOD表達量出現下調的原因可能就是由于長時間低溫脅迫導致杉木組培苗不可逆損傷，造成其抗寒能力下降。在48 h時Mn-SOD基因的表達量與對照差異不顯著，可能由于低溫脅迫基因響應時間較短，脅迫時間過長等原因，這與在研究低溫下茄子SmMnSOD基因的表達受到顯著抑制的結果相一致[10]。同時前人研究結果也表明，低溫脅迫能顯著誘導植物體內SOD基因的迅速表達，增強植物對低溫脅迫的抗性[22]。除了低溫脅迫可以迅速誘導Mn-SOD基因表達，其他逆境脅迫同樣可誘導表達，例如茶樹[11]和小麥[12]在干旱脅迫和鹽脅迫下均能顯著誘導Mn-SOD基因快速表達，呈現上調趨勢。與前人研究結果類似，本研究中發(fā)現隨干旱脅迫時間的延長，杉木組培苗Mn-SOD基因表達量增加，12 h時表達量達到最高且顯著高于對照；24 h后表達量顯著降低，可推測杉木Mn-SOD基因在干旱脅迫一定時間內能對杉木起到調節(jié)保護作用。而這種隨著脅迫時間延長表達量下降的情況，可能是由于杉木自身較為敏感，長時間脅迫處理使其體內活性氧過量積累造成嚴重損失，引起細胞各部位代謝紊亂，從而最終引起該基因表達量下降。眾所周知，鋁脅迫迅速誘導活性氧在植物體內積累，導致氧化損傷，抑制植物生長。類似地，鋁脅迫下杉木組培苗Mn-SOD基因表達量同樣呈上升趨勢，而且其表達量均高于對照，說明Mn-SOD基因在杉木應對鋁脅迫過程中具有一定的作用。鹽脅迫下杉木組培苗Mn-SOD基因表達量變化幅度最大，脅迫48 h表達量上升33.88倍。由此可見，不同逆境脅迫均能快速誘導杉木Mn-SOD基因表達，而不同的脅迫方式調控機制不同，導致對脅迫的響應時間和響應程度不同。低溫和干旱脅迫可以較快地誘導Mn-SOD基因的表達，均在12 h時相對表達量達到峰值，Mn-SOD基因在鋁脅迫下的表達量是波動的，在24 h時相對表達量達到峰值，而Mn-SOD基因響應鹽脅迫時間要長于其他3種脅迫，在48 h達到峰值且顯著高于對照組。

同時本研究通過實時熒光定量PCR分析Mn-SOD基因在杉木組培苗根、莖和葉組織中的表達差異，豐富了Mn-SOD基因的表達規(guī)律。研究發(fā)現Mn-SOD基因在根、莖和葉均有表達。其中，Mn-SOD基因在杉木葉片有較高的表達，而莖和根的表達量相對較低。前人研究表明，茄子(SolanummelongenaL.)中SmMnSOD基因在多個組織中均有表達，其中葉片和花瓣中的表達量最高[10]；杧果(Mangiferaindica)MiMnSOD基因在多個組織中表達，其中在成熟葉片和果實中表達水平最高[23]。

本研究證實了杉木Mn-SOD基因能對不同逆境脅迫條件產生響應，暗示在逆境脅迫下，當植物體內細胞受到傷害時，杉木可能通過誘導Mn-SOD基因的表達，從而減輕逆境脅迫對杉木造成的傷害。研究結果為通過基因工程手段改良杉木抵抗逆境脅迫能力，增強杉木對逆境脅迫的耐性提供理論依據。