王思瑤　李欣　孫璐　楊杰　李影　崔曈肸　詹亞光　尹靜

(林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué))，哈爾濱，150040)

白樺(BetulaplatyphyllaSuk.)屬樺木科樺木屬，為落葉喬木，其具有適應(yīng)力強(qiáng)、生長快速、材質(zhì)優(yōu)良的特點(diǎn)，是我國東北地區(qū)多種地帶性植被的先鋒樹種[1]。白樺中含有豐富的三萜類物質(zhì)[2]，例如樺葉烯三醇、白樺酯酸及白樺酯醇等。有研究顯示白樺酯酸可以抑制H9淋巴細(xì)胞中HIV病毒復(fù)制和選擇性地抑制黑色素瘤細(xì)胞的生長[3-4]，其毒性低、療效高、抗性強(qiáng)、作用廣的特點(diǎn)成為潛力巨大、應(yīng)用前景廣闊的新型藥物制劑[5-8]。

植物合成三萜類物質(zhì)往往不是由單個(gè)基因決定的，而是由多基因控制的數(shù)量性狀。因此，通過分離和鑒定與三萜類合成有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控三萜代謝多個(gè)基因表達(dá)，綜合提高植物三萜類物質(zhì)的產(chǎn)量，已成為現(xiàn)在植物諸多研究工作者的主要方向。bHLH(basic Helix-Loop-Helix)是植物中廣泛存在的一類重要轉(zhuǎn)錄因子，其結(jié)構(gòu)域約有60個(gè)氨基酸，包含堿性區(qū)域和螺旋-環(huán)-螺旋(HLH)區(qū)域，bHLH轉(zhuǎn)錄因子通過兩個(gè)A-螺旋之間的相互作用，形成同源或異源二聚體，與靶基因啟動子的G-box相結(jié)合，從而調(diào)控靶基因的表達(dá)[9]。對植物中分離得到的638個(gè)(水稻、葡萄、擬南芥等)bHLH轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行了分類，共32個(gè)亞家族，這些bHLH蛋白在植物生長發(fā)育、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和次生代謝調(diào)控中起重要作用[10]。但目前對bHLH功能研究在動物中進(jìn)展較快，而植物bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族的功能只有部分得到解析[13-14]。植物激素茉莉酸(Jasmonic Acid,JA)和水楊酸(Salicylic Acid,SA)作為誘導(dǎo)子，不僅對植物的生長發(fā)育及防御有著重要的調(diào)節(jié)和控制作用[15]，且在植物次生代謝產(chǎn)物合成中扮演著重要角色，二者可以顯著刺激抗逆酶活性的提高，并促進(jìn)黃酮、萜類等的生物合成及相關(guān)途徑的基因表達(dá)[16-24]。李春曉[23]的研究顯示MeJA(茉莉酸甲酯)和SA處理對白樺幼樹三萜積累的誘導(dǎo)主要表現(xiàn)在早期，不同濃度MeJA及SA處理總體上促進(jìn)了白樺葉片中總?cè)频姆e累。中科院陳曉亞團(tuán)隊(duì)以擬南芥為實(shí)驗(yàn)材料，明確了bHLH類轉(zhuǎn)錄因子參與激活JA信號途徑，調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育及抗逆防御反應(yīng)，并在擬南芥腺毛的萜類合成中發(fā)揮重要作用[24]。

基于本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果，SA和JA均可以顯著提升三萜含量及促進(jìn)相關(guān)基因的表達(dá)[19-20]，但不同bHLH轉(zhuǎn)錄因子對兩種信號的響應(yīng)表達(dá)存在差異(待發(fā)表)，這說明不同的bHLH轉(zhuǎn)錄因子在參與JA、SA信號誘導(dǎo)及調(diào)控萜類合成所扮演的角色不同。本研究通過對實(shí)驗(yàn)室前期篩選的白樺中響應(yīng)MeJA和SA誘導(dǎo)的BpbHLH2、BpbHLH3基因進(jìn)行克隆及表達(dá)模式分析，為闡明該基因在白樺生長發(fā)育及三萜類物質(zhì)合成中的作用奠定重要的基礎(chǔ)。

1　材料與方法

實(shí)驗(yàn)材料來自東北林業(yè)大學(xué)生命學(xué)院森林生物工程實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的白樺組培苗。

IPTG，X-gal，LB培養(yǎng)基，ExTaqDNA聚合酶，dNTPs，pMD18-T克隆載體，SYBR? Premix ExTaqTM(Perfect Real Time)，Takara Prime Script TM II 1st Strand cDNA Synthesis kit，DH-5α感受態(tài)細(xì)胞，均購于寶生物工程有限公司，DNA純化回收試劑盒購于OMEGA公司，PCR引物合成及DNA測序由哈爾濱博仕生物科技有限公司完成。白樺組培苗總RNA提取及DNA消化(Tris-CTAB法)參考粱甜[25]方法。

1.1　白樺cDNA的合成

采用Takara公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成第一條鏈cDNA，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2　BpbHLH2、BpbHLH3基因克隆及鑒定

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期轉(zhuǎn)錄組測序獲得的序列，將其進(jìn)行ORF-Finder分析，并設(shè)計(jì)特異性引物，引物F、R見表1，將獲得的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系、目的片段回收、純化、連接及轉(zhuǎn)化參考粱甜[25]的實(shí)驗(yàn)方法，需要注意的是BpbHLH2、BpbHLH3基因PCR擴(kuò)增時(shí)的退火溫度為55 ℃，延伸時(shí)間為2 min。

1.3　BpbHLH2、BpbHLH3基因生物學(xué)信息

利用NCBI、ExPASy、GOR4、Phyre2等生物信息網(wǎng)站，以及BIOEDIT、MEGA5等生物信息軟件對獲得的白樺BpbHLH2基因和BpbHLH3基因的全長cDNA序列及所編碼的氨基酸序列進(jìn)行分子特征、理化性質(zhì)、同源性和系統(tǒng)進(jìn)化等一系列分析預(yù)測。

表1　BpbHLH2、BpbHLH3基因克隆及定量分析引物

1.4　BpbHLH2、BpbHLH3基因表達(dá)

按照“1.2”的方法提取寄代4周的白樺組培苗的根、莖、葉中RNA，進(jìn)行組織特異性分析；于2016年6—9月每月15號上午09：00時(shí)，于東北林業(yè)大學(xué)盆栽試驗(yàn)場取統(tǒng)一栽培的3年生白樺植株葉片。取位于各株白樺植株中上部生長旺盛的葉片，每株各取10片混合，液氮速凍保存，待進(jìn)行不同月份基因表達(dá)量分析。以白樺微管蛋白(TU)基因?yàn)閮?nèi)參，使用BpbHLH2、BpbHLH3基因熒光定量PCR引物(見表1)，以不同組織cDNA為模板，進(jìn)行定量RT-PCR檢測(QRT-PCR)。具體程序及方法按照Takara公司的SYBR Premix EXTaqTM(Perfect Real Time)的試劑盒說明書進(jìn)行操作。PCR擴(kuò)增程序如下：預(yù)變性95 ℃、30 s，1個(gè)循環(huán)；95 ℃、5 s，60 ℃、35 s，95 ℃、15 s共40個(gè)循環(huán)；60 ℃、1 min，1個(gè)循環(huán)；95 ℃、15 s，1個(gè)循環(huán)。每個(gè)反應(yīng)3個(gè)重復(fù)。所有處理及測量均3次重復(fù)。利用SPSS軟件對不同處理獲得數(shù)據(jù)進(jìn)行鄧肯方差分析。

2　結(jié)果與分析

2.1　BpbHLH2、BpbHLH3基因的克隆

根據(jù)白樺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中基因已知bHLH2、bHLH3序列的兩端設(shè)計(jì)特異引物，以白樺總RNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，分別檢測到特異擴(kuò)增條帶，如圖1、2。測序結(jié)果顯示，PCR產(chǎn)物長度分別為1 438、1 355 bp，暫命名為BpbHLH2、BpbHLH3。

2.2　BpbHLH2、BpbHLH3全長序列生物信息學(xué)

2.2.1BpbHLH2、BpbHLH3基因分子特征

BpbHLH2含完整的ORF，核酸序列長為1 050 bp，編碼349個(gè)氨基酸。將此預(yù)測的cDNA全長序列利用BLASTp進(jìn)行序列比對，發(fā)現(xiàn)該氨基酸序列與胡桃(JuglansregiaL.)bHLH家族蛋白(GenBankID:XP_018817560.1)相似度為71%；轉(zhuǎn)錄因子BpbHLH3基因cDNA，含完整的ORF，核酸序列長為1 044 bp，編碼347個(gè)氨基酸。將此預(yù)測的cDNA全長序列利用BLASTp進(jìn)行序列比對，發(fā)現(xiàn)該氨基酸序列與胡桃(JuglansregiaL.)bHLH家族蛋白(GenBankID:XP_018813766.1)相似度為70%。

M.DL2000；1為BpbHLH2基因擴(kuò)增產(chǎn)物。

M.DL2000；1無樣品，2為BpbHLH3基因擴(kuò)增產(chǎn)物。

BpbHLH2、BpbHLH3蛋白質(zhì)分別在696～842 aa、609～752 aa有螺旋-環(huán)-螺旋的DNA結(jié)合保守結(jié)構(gòu)域，并且其附近均存在E-box和N-box位點(diǎn)。BpbHLH2氨基酸序列相對分子質(zhì)量為38 503.50，等電點(diǎn)為7.63，總平均疏水性為-0.497，具有親水性，不穩(wěn)定系數(shù)為51.54，該蛋白為不穩(wěn)定蛋白；BpbHLH3氨基酸序列分子質(zhì)量為38 789.67，等電點(diǎn)為6.41，總平均疏水性為-0.517，具有親水性，不穩(wěn)定系數(shù)為46.04，該蛋白為不穩(wěn)定蛋白。BpbHLH2氨基酸在第197位置處疏水性最強(qiáng)，達(dá)2.300，在186、187、189的位置具有最強(qiáng)的親水性，為-2.811，分布在0.5以上的峰值少于分布在-0.5以下的，說明該蛋白為親水蛋白；BpbHLH3氨基酸在第191位置處疏水性最強(qiáng)，數(shù)值為2.333，在180、181、182的位置具有最強(qiáng)的親水性，可達(dá)-2.811，分布在0.5以上的峰值少于分布在-0.5以下的，說明該蛋白為親水蛋白。BpbHLH2編碼的蛋白質(zhì)存在2個(gè)跨膜螺旋，并預(yù)測在第150～168個(gè)氨基酸鏈?zhǔn)怯蓛?nèi)向外跨膜，第301～318個(gè)氨基酸是由外向內(nèi)跨膜；BpbHLH3編碼的蛋白質(zhì)存在2個(gè)跨膜螺旋，并預(yù)測在第303～324個(gè)氨基酸鏈?zhǔn)怯蓛?nèi)向外跨膜，在第303～322個(gè)氨基酸鏈?zhǔn)怯赏庀騼?nèi)的跨膜。BpbHLH2蛋白由32.38%的α螺旋、50.72%的無規(guī)則卷曲和16.91%延伸鏈組成；BpbHLH3蛋白由31.99%的α螺旋、50.14%的無規(guī)則卷曲和17.87%延伸鏈組成。

2.2.2BpbHLH2、BpbHLH3氨基酸序列同源性

將BpbHLH2編碼的氨基酸分別與胡桃(JuglansregiaL. XP_018817560.1)、木薯(ManihotesculentaCrantz. OAY33546.1)、甜櫻桃(Cerasusavium(L.) Moench. XP_021829526.1)、桃樹(PrunuspersicaL. ONI02641.1)、巴西橡膠樹(Heveabrasiliensis(Willd. ex A. Juss.) Muell. Arg XP_021692404.1)、蘋果(MalusdomesticaMill. XP_017192897.1)、白梨(PyrusbretschneideriRehd. XP_009354636.1)、梅(PrunusmumeSieb. XP_008236887.1)、蓖麻(RicinuscommunisL. XP_002528912.2)、棗(ZiziphusjujubaMill. XP_015890448.1)、野草莓(FragariavescaXP_011466492.1)、可可(TheobromacacaoXP_017971736.1)、雷蒙德氏棉(GossypiumraimondiiUlbr. XP_012492040.1)、麻風(fēng)樹(JatrophacurcasL. XP_012079597.1)、木本棉(GossypiumarboreumLinn. XP_017629129.1)的bHLH轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列進(jìn)行了Clustal W法同源性比較，結(jié)果顯示，其BpbHLH2所編碼的蛋白質(zhì)與各物種的bHLH轉(zhuǎn)錄因子序列具有相似性，且大部分序列具有保守性(圖3)。其中，BpbHLH2轉(zhuǎn)錄因子與胡桃、木薯bHLH轉(zhuǎn)錄因子同源性較高，其氨基酸序列相似性分別達(dá)到了71%和65%。據(jù)此，我們推斷白樺BpbHLH2可能是bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族中的新成員，但其功能有待于進(jìn)一步的鑒定。

將白樺BpbHLH3編碼的氨基酸分別與胡桃(JuglansregiaL. XP_018813766.1)、可可(TheobromacacaoEOX91822.1)、梅(PrunusmumeSieb. XP_008236876.1)、陸地棉(GossypiumhirsutumLinn. XP_016723306.1)、甜櫻桃(Prunusavium(L.) Moench. XP_021829516.1)、野草莓(FragariavescaXP_004288301.1)、桃樹(PrunuspersicaL. ONI02640.1)、蘋果(MalusdomesticaMill. XP_008383369.1)、雷蒙德氏棉(GossypiumraimondiiUlbr. KJB18117.1)、白梨(PyrusbretschneideriRehd. XP_009347092.1)、木本棉(GossypiumarboreumLinn. KHG02490.1)、巴西橡膠樹(Heveabrasiliensis(Willd. ex A. Juss.) Muell. Arg XP_021655264.1)、木薯(ManihotesculentaCrantz. OAY33545.1)、麻風(fēng)樹(JatrophacurcasL. KDP32145.1)、甜橙(Citrussinensis(L.) Osbeck XP_006466576.1)的bHLH轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列進(jìn)行了Clustal W法同源性比對，結(jié)果顯示其白樺BpbHLH3所編碼的蛋白質(zhì)與各物種的bHLH轉(zhuǎn)錄因子序列具有較高的相似性，且大部分序列具有保守性(圖4)。其中，BpbHLH3與胡桃、可可bHLH轉(zhuǎn)錄因子同源性較高，其氨基酸序列相似性分別達(dá)到了70%和62%。據(jù)此，我們推斷白樺BpbHLH3也是bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族中又一新成員。

圖3　白樺BpbHLH2編碼蛋白與其他植物bHLH基因編碼蛋白的相似性

為了進(jìn)一步研究白樺BpbHLH2、BpbHLH3蛋白與其他bHLH類蛋白的親緣關(guān)系，構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹，如圖5。結(jié)果表明，隨著物種不同，它們之間遺傳距離存在顯著差異。白樺的BpbHLH2、BpbHLH3轉(zhuǎn)錄因子分別單獨(dú)在一個(gè)分支上。BpbHLH2、BpbHLH3與胡桃的bHLH轉(zhuǎn)錄因子親緣性較其他物種高，進(jìn)一步表明本研究獲得的白樺BpbHLH2、BpbHLH3基因是bHLH家族中的新成員，為編碼bHLH轉(zhuǎn)錄因子蛋白的2個(gè)新基因。

2.3　BpbHLH2、BpbHLH3基因的表達(dá)特征

2.3.1不同月份BpbHLH2、BpbHLH3基因相對表達(dá)量

如表2所示，BpbHLH2基因在葉片中的表達(dá)在8月份高于其它月份，其中8月份表達(dá)為6月的1.94倍，9月表達(dá)量最低；而BpbHLH3在7、8、9月表達(dá)量顯著高于6月，其中9月最高，是6月的30.17倍。研究結(jié)果表明兩個(gè)基因在不同月份的表達(dá)模式存在差異。

2.3.2BpbHLH2、BpbHLH3組織特異性

分析表明，BpbHLH2基因在根中的表達(dá)量最低，在葉中的表達(dá)量相對最高，是根中的1.74倍，二者差異顯著；BpbHLH3基因在葉中的表達(dá)量最高，其次為根、莖，其中葉中表達(dá)量是莖中的5.15倍，達(dá)顯著差異(表3)。

圖4　白樺BpbHLH3編碼蛋白與其他物種bHLH基因編碼蛋白的相似性分析

圖5　白樺BpbHLH2、BpbHLH3氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹

表2　不同月份白樺葉中BpbHLH2、BpbHLH3相對表達(dá)

注：表中同列不同小寫字母表示不同處理在p<0.05水平上差異顯著。

表3　白樺不同組織中BpbHLH2、BpbHLH3相對表達(dá)量

注：表中同列不同小寫字母表示不同處理在p<0.05水平上差異顯著。

3　結(jié)論與討論

本研究基于前期對東北白樺轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，并結(jié)合實(shí)驗(yàn)室前期篩選的響應(yīng)MeJA和SA信號的bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因，克隆得到兩條bHLH家族基因，分別命名為BpbHLH2、BpbHLH3，生物信息學(xué)分析顯示，為白樺新的bHLH家族基因。BpbHLH2、BpbHLH3均存在螺旋-環(huán)-螺旋的DNA結(jié)合保守結(jié)構(gòu)域，同時(shí)序列同源分析及分子進(jìn)化樹構(gòu)建結(jié)果也顯示BpbHLH2、BpbHLH3蛋白很可能為白樺bHLH家族中的新成員，其功能未知。

MYC2作為bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族之一，為JA信號途徑的主要調(diào)控因子[26-28]。在長春花懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中，JA可以誘導(dǎo)CrMYC1、CrMYC2 mRNA的表達(dá)，并且在JA應(yīng)答中，CrMYC2的下調(diào)對生物堿的積累影響顯著[29]；GL3是bHLH家族的轉(zhuǎn)錄因子，其過量表達(dá)大幅度提高了中藥中有效成分的含量[30]；在橡膠樹乳管細(xì)胞中，JA分子可能通過對bHLH等轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)的激活作用，啟動橡膠生物合成相關(guān)基因的表達(dá)，從而提高細(xì)胞的乳膠產(chǎn)量[31-32]。可見，在植物JA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，bHLH轉(zhuǎn)錄因子起著“主開關(guān)調(diào)節(jié)子”作用，通過啟動一系列相關(guān)基因的表達(dá)從而產(chǎn)生JA誘導(dǎo)的生理效應(yīng)[33]。本研究前期結(jié)果顯示，MeJA、SA可顯著誘導(dǎo)白樺三萜合成途徑關(guān)鍵基因FPS、SS、SE、BPW、BPY基因上調(diào)表達(dá)，且發(fā)現(xiàn)FPS、SS、SE基因啟動子序列含bHLH轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)G-box[34-35]，且MeJA和SA誘導(dǎo)的白樺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫結(jié)果顯示BpbHLH2、BpbHLH3響應(yīng)兩種信號誘導(dǎo)，并表現(xiàn)不同模式(待發(fā)表)，進(jìn)而推測白樺2個(gè)bHLH基因可能在MeJA或SA信號誘導(dǎo)三萜合成中發(fā)揮重要功能，且機(jī)制不同。萜類物質(zhì)合成具有組織特異性，并受季節(jié)和環(huán)境影響，這與其基因表達(dá)特異直接相關(guān)[1,20,23]。白樺葉中具有較豐富的達(dá)瑪烷三萜和齊墩果酸物質(zhì)，且相關(guān)的三萜合成途徑基因也受激素誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)[19,23]，本研究發(fā)現(xiàn)兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因均在葉片中高表達(dá)，是否其也參與調(diào)控相關(guān)激素對三萜的調(diào)控，有待進(jìn)一步通過該轉(zhuǎn)錄因子及其三萜合成基因的啟動子序列克隆及順式作用元件分析驗(yàn)證。同時(shí)本研究也發(fā)現(xiàn)兩個(gè)基因表達(dá)分別在8月和9月達(dá)最高，而研究顯示bHLH基因啟動子序列含有溫度脅迫響應(yīng)元件[35]，八月為哈爾濱夏季，溫度較高，而9月溫度開始下降，推測兩個(gè)基因?qū)囟茸兓嬖诓煌憫?yīng)。本研究BpbHLH2、BpbHLH3基因的cDNA全長序列克隆及生物信息學(xué)的分析，為進(jìn)一步闡明該基因在白樺三萜合成途徑中的重要作用奠定了基礎(chǔ)。