徐　哲　李錦秀

（中國(guó)航空規(guī)劃設(shè)計(jì)研究總院有限公司，北京100120）

0　引言

無(wú)菌是生物技術(shù)中的一個(gè)重要概念。培養(yǎng)基、發(fā)酵設(shè)備等只有處于無(wú)菌前提下，微生物接種后，才能實(shí)現(xiàn)純種培養(yǎng)，最終得到所需的產(chǎn)品。

生物疫苗可分為細(xì)菌類(lèi)疫苗和病毒類(lèi)疫苗。細(xì)菌類(lèi)疫苗以培養(yǎng)、發(fā)酵工藝為主，病毒類(lèi)疫苗以細(xì)胞培養(yǎng)、病毒擴(kuò)增工藝為主，這兩類(lèi)疫苗的工藝生產(chǎn)具有相似性。

本文針對(duì)不同生產(chǎn)工藝的、非最終滅菌的病毒類(lèi)生物疫苗產(chǎn)品，對(duì)其生產(chǎn)車(chē)間的工藝布局進(jìn)行了分析，提出了更經(jīng)濟(jì)、更高效、更合理的工藝布局模式。

1　生產(chǎn)工藝流程及設(shè)備分析

1.1　工藝流程分析

病毒類(lèi)疫苗的生產(chǎn)流程（圖1）可以分為以下幾個(gè)階段：（1）細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)及擴(kuò)增，該生產(chǎn)過(guò)程為無(wú)毒生產(chǎn)過(guò)程；（2）細(xì)胞擴(kuò)增到一定程度后進(jìn)行細(xì)胞洗滌，并加入病毒液接種，然后帶毒培養(yǎng)，并不斷洗滌；（3）細(xì)胞培養(yǎng)好后，收集疫苗液；（4）如果制作滅活疫苗則需要進(jìn)行病毒滅活、制作過(guò)程，如果生產(chǎn)活疫苗則不需要該過(guò)程；（5）配制疫苗原液；（6）分裝入庫(kù)。同時(shí)，病毒接種前需要經(jīng)過(guò)復(fù)蘇培養(yǎng)及擴(kuò)增階段。

1.2　工藝設(shè)備分析

目前，病毒類(lèi)生物疫苗的原液生產(chǎn)工藝主要包括：轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)、細(xì)胞工廠培養(yǎng)以及生物反應(yīng)器培養(yǎng)（罐培養(yǎng)）等。

轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)技術(shù)是傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，工藝相對(duì)落后?，F(xiàn)國(guó)內(nèi)各企業(yè)通過(guò)工藝的優(yōu)化升級(jí)，逐步將傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝升級(jí)為細(xì)胞工廠培養(yǎng)或者生物反應(yīng)器培養(yǎng)工藝。

細(xì)胞工廠培養(yǎng)技術(shù)，對(duì)貼壁細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)有著明顯優(yōu)勢(shì)。首先，采用細(xì)胞工廠培養(yǎng)工藝，適用于擴(kuò)大生產(chǎn)，無(wú)需添加生產(chǎn)設(shè)備，大大縮短了從研發(fā)到生產(chǎn)的時(shí)間。其次，細(xì)胞工廠培養(yǎng)工藝的一次性投入很少，無(wú)需大型昂貴設(shè)備，也無(wú)需復(fù)雜的管道設(shè)計(jì)。此外，細(xì)胞工廠培養(yǎng)工藝能夠靈活地根據(jù)市場(chǎng)需求，安排生產(chǎn)規(guī)模。因此，越來(lái)越多的疫苗生產(chǎn)廠家采用細(xì)胞工廠培養(yǎng)技術(shù)大規(guī)模培養(yǎng)細(xì)胞。

生物反應(yīng)器培養(yǎng)技術(shù)，作為現(xiàn)階段比較先進(jìn)的一種技術(shù)，與傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)技術(shù)以及細(xì)胞工廠培養(yǎng)技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)：（1）單位體積內(nèi)的有效工作細(xì)胞數(shù)量增加；（2）全密閉、管道化的系統(tǒng)生產(chǎn)流程及過(guò)程自動(dòng)化監(jiān)控、控制技術(shù)，不僅減少了污染細(xì)胞的可能性，而且減輕了勞動(dòng)力強(qiáng)度，減少了人為誤操作因素的影響；（3）生物反應(yīng)器容積的擴(kuò)大，提升了終端產(chǎn)品的均一性，結(jié)合后期純化工藝，不但產(chǎn)品產(chǎn)量明顯提高，產(chǎn)品質(zhì)量也獲得提升；（4）生產(chǎn)疫苗所用勞動(dòng)力和車(chē)間、水、電、原材料、能源等成本遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝，綜合成本大大降低。

圖1　病毒類(lèi)疫苗生產(chǎn)流程

2　不同生產(chǎn)工藝步驟的潔凈室級(jí)別

某一工藝步驟需滿(mǎn)足的潔凈室級(jí)別取決于各工藝步驟的執(zhí)行情況，主要有兩種基本情況：開(kāi)放系統(tǒng)的操作（開(kāi)放工藝步驟）和密閉系統(tǒng)的操作（密閉工藝步驟）。

這兩種情況的具體設(shè)計(jì)理念如下：密閉工藝步驟要求產(chǎn)品在整個(gè)工藝步驟持續(xù)時(shí)間內(nèi)裝在完全關(guān)閉、密封的容器（或罐等）中，需通過(guò)泄漏試驗(yàn)對(duì)容器（或罐等）進(jìn)行氣密性驗(yàn)證。如有必要的話，可以采用經(jīng)完整性檢測(cè)并且被用作阻擋容器（或罐等）外潔凈室空氣接觸的屏障——除菌級(jí)通風(fēng)過(guò)濾器對(duì)容器（或罐等）進(jìn)行通風(fēng)。如果在密閉工藝步驟中必須向產(chǎn)品中添加物質(zhì)或取樣，就需使用適當(dāng)?shù)臒o(wú)菌裝置，例如蒸汽穿閥裝置，一次性無(wú)菌連接、無(wú)菌取樣系統(tǒng)或熔管器/密封器。如果滿(mǎn)足這些前提條件，所有密閉工藝步驟可在D級(jí)環(huán)境下進(jìn)行。D級(jí)是GMP指南中所定義的用于如CIP/SIP之前進(jìn)行拆卸和組裝設(shè)備的最低潔凈室級(jí)別。

對(duì)于開(kāi)放工藝步驟和系統(tǒng)，基于產(chǎn)品染菌風(fēng)險(xiǎn)，一般區(qū)分為兩種情況：

情況1：如果產(chǎn)品明顯暴露于潔凈室空氣中，就是完全開(kāi)放的工藝步驟或系統(tǒng)。例如，產(chǎn)品置于瓶中，但瓶蓋被移開(kāi)進(jìn)行取樣；或產(chǎn)品置于罐中，但人孔（檢修孔）蓋被打開(kāi)用于添加溶液。

情況2：關(guān)閉的但非密封的容器、罐等也被視為開(kāi)放系統(tǒng)，相關(guān)工藝步驟也被定義為開(kāi)放式步驟。例如，產(chǎn)品置于帶蓋的玻璃瓶中，但瓶和蓋之間沒(méi)有保證氣密性的膠墊。但此種情況下的產(chǎn)品染菌風(fēng)險(xiǎn)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于情況1。

通常情況下，產(chǎn)品滅菌前的開(kāi)放式工藝步驟應(yīng)該在C級(jí)環(huán)境下完成。C級(jí)比D級(jí)高一個(gè)級(jí)別（D級(jí)適用于密閉工藝步驟），更重要的是，C級(jí)是第一個(gè)對(duì)動(dòng)態(tài)粒子有要求的房間級(jí)別。

產(chǎn)品滅菌前，上述情況2的系統(tǒng)/工藝步驟可以在C級(jí)潔凈室下進(jìn)行，不需額外的保護(hù)處理。然而情況1的系統(tǒng)/工藝步驟，由于產(chǎn)品染菌的風(fēng)險(xiǎn)高，需要借助UAF（單向流）裝置進(jìn)行額外的局部保護(hù)。

產(chǎn)品滅菌后，情況1的開(kāi)放式工藝，需在B+A環(huán)境下進(jìn)行（或A級(jí)隔離器，二選一）無(wú)菌操作。情況2的開(kāi)放式工藝，不適用于無(wú)菌產(chǎn)品生產(chǎn)，需確保A級(jí)環(huán)境外的產(chǎn)品容器完全密封。

需要注意的是，所有不直接與產(chǎn)品生產(chǎn)相關(guān)的工藝步驟，即非關(guān)鍵步驟，如設(shè)備清潔、工裝清洗、滅菌密封等將在D級(jí)區(qū)完成。必要時(shí)，清潔品的開(kāi)放處理可在D級(jí)區(qū)域內(nèi)的UAF裝置保護(hù)下完成。

3　不同生產(chǎn)工藝的工藝布局分析

非最終滅菌的不可除菌過(guò)濾的病毒類(lèi)生物疫苗產(chǎn)品，鑒于其產(chǎn)品特性，不可最終除菌過(guò)濾及滅菌，要求在原液生產(chǎn)過(guò)程中，在最后一步可除菌或滅菌工藝之后，全程無(wú)菌操作以滿(mǎn)足無(wú)菌要求。

非最終滅菌的不可除菌過(guò)濾的病毒類(lèi)生物疫苗的生產(chǎn)工藝一般包括：轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝、細(xì)胞工廠培養(yǎng)工藝以及生物反應(yīng)器培養(yǎng)工藝。

3.1　轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝的工藝布局

受傳統(tǒng)慣例、對(duì)GMP等法規(guī)認(rèn)識(shí)不深、無(wú)菌概念不清晰等因素的影響，傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝一般在C級(jí)環(huán)境下的局部層流保護(hù)下生產(chǎn)。

根據(jù)法規(guī)要求，C級(jí)環(huán)境下的局部層流保護(hù)環(huán)境，不可作為無(wú)菌操作環(huán)境，其層流保護(hù)下的環(huán)境不是無(wú)菌環(huán)境，在該環(huán)境下生產(chǎn)，產(chǎn)品染菌風(fēng)險(xiǎn)較高，影響產(chǎn)品質(zhì)量及收率。

如按照無(wú)菌操作要求，將生產(chǎn)車(chē)間環(huán)境提升至B級(jí)背景下的A級(jí)環(huán)境，則會(huì)大大增加造價(jià)以及運(yùn)行成本。由于轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝的收率相對(duì)較低，在增加成本的同時(shí)，不能有效提高收率，因此車(chē)間整體的布局經(jīng)濟(jì)性、可行性較低。

現(xiàn)階段各企業(yè)經(jīng)過(guò)工藝優(yōu)化升級(jí)，逐步淘汰了轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝的大規(guī)模生產(chǎn)，僅在病毒培養(yǎng)等局部工藝或小規(guī)模生產(chǎn)中采用。傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝的車(chē)間局部工藝布局如圖2所示。

圖2　傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝的車(chē)間局部工藝布局

由圖2可以看出，傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝均是在C級(jí)環(huán)境下的層流保護(hù)下進(jìn)行，無(wú)菌環(huán)境的保證性較差。因此需對(duì)傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝的工藝布局進(jìn)行優(yōu)化升級(jí)，如圖3所示。優(yōu)化升級(jí)后的工藝布局，將裝瓶培養(yǎng)無(wú)菌操作設(shè)置在B級(jí)背景下的局部A級(jí)層流保護(hù)中，實(shí)現(xiàn)無(wú)菌操作，保證了產(chǎn)品質(zhì)量。培養(yǎng)箱設(shè)備放置在低級(jí)別的D級(jí)區(qū)，開(kāi)口設(shè)在B級(jí)區(qū)，在方便使用的同時(shí)，減少了對(duì)B級(jí)區(qū)的影響，便于設(shè)備維修、維護(hù)。退出部分設(shè)置前室，對(duì)操作間僅開(kāi)設(shè)一個(gè)門(mén)，降低對(duì)操作間無(wú)菌環(huán)境的影響。

3.2　細(xì)胞工廠培養(yǎng)工藝的工藝布局

細(xì)胞工廠培養(yǎng)工藝在連接、換液等操作環(huán)節(jié)不能夠?qū)崿F(xiàn)密閉操作。傳統(tǒng)的國(guó)內(nèi)原液生產(chǎn)車(chē)間，以二倍體細(xì)胞狂犬疫苗為例，其車(chē)間工藝布局如圖4所示。將細(xì)胞培養(yǎng)、毒種接種以及培養(yǎng)等工藝設(shè)置在C級(jí)環(huán)境中，在C級(jí)背景下的局部層流保護(hù)下進(jìn)行生產(chǎn)暴露操作，僅將最后的純化操作設(shè)置在B級(jí)環(huán)境下。這種操作不能實(shí)現(xiàn)無(wú)菌，染菌風(fēng)險(xiǎn)較大。由于二倍體狂犬病毒疫苗不可最終除菌過(guò)濾，生產(chǎn)過(guò)程如果不能實(shí)現(xiàn)全程無(wú)菌化操作，則產(chǎn)品質(zhì)量不能得到有效控制。

圖3　優(yōu)化升級(jí)后的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝車(chē)間局部工藝布局

D級(jí)環(huán)境下進(jìn)行，因此有兩種選擇：

（1）將培養(yǎng)設(shè)置在B級(jí)環(huán)境下，這樣方便操作和使用，物料無(wú)需反復(fù)進(jìn)出B級(jí)區(qū)，但能耗較大，在大規(guī)模生產(chǎn)中可行性不高。

（2）為了保證無(wú)菌環(huán)境，充分考慮能耗等因素以及物料如何有效進(jìn)出B級(jí)區(qū)，B級(jí)區(qū)需要采用VHP滅菌、濕熱滅菌等有效的滅菌手段以控制無(wú)菌環(huán)境。根據(jù)VHP的特性，進(jìn)出時(shí)長(zhǎng)在1 h以上，不利于細(xì)胞、病毒的培養(yǎng)。同時(shí)，細(xì)胞工廠反復(fù)進(jìn)出B級(jí)區(qū)，在增加工作量的同時(shí)，也不利于B級(jí)環(huán)境的保持。因此，考慮將操作間與恒溫室采用背靠背的模式，利用穿墻連接，實(shí)現(xiàn)物料在B級(jí)操作間內(nèi)無(wú)菌操作的同時(shí)，在D級(jí)環(huán)境下培養(yǎng)。優(yōu)化后的細(xì)胞工廠車(chē)間局部工藝布局如圖5所示。

圖4　原細(xì)胞工廠培養(yǎng)工藝的生產(chǎn)車(chē)間局部工藝布局

根據(jù)無(wú)菌操作要求，原液生產(chǎn)一般在B級(jí)背景下的A級(jí)環(huán)境下完成。操作完成后，放置于恒溫室內(nèi)恒溫培養(yǎng)一段時(shí)間后，反復(fù)進(jìn)行換液等操作，若干次后收獲原液。恒溫培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞工廠處于密閉狀態(tài)，因此在D級(jí)環(huán)境下的恒溫室培養(yǎng)即可。

由于細(xì)胞操作在B級(jí)環(huán)境下進(jìn)行，恒溫培養(yǎng)在

3.3　生物反應(yīng)器培養(yǎng)工藝的工藝布局

根據(jù)反應(yīng)器的性能及特點(diǎn)，生物反應(yīng)器可分為兩類(lèi)：一類(lèi)是非全密閉反應(yīng)器，即反應(yīng)器本身培養(yǎng)過(guò)程是全密閉化的，但不可實(shí)現(xiàn)在線清洗等操作；另一類(lèi)是全密閉反應(yīng)器，即反應(yīng)器可實(shí)現(xiàn)全密閉化生產(chǎn)、清洗、操作等。因此，需根據(jù)不同的反應(yīng)器類(lèi)型，有針對(duì)性地進(jìn)行工藝布局。

圖5　優(yōu)化后的細(xì)胞工廠車(chē)間局部工藝布局

非全密閉生物反應(yīng)器，是一種多用于小規(guī)模生產(chǎn)下的小容量生物反應(yīng)器，一般為玻璃等材質(zhì)。根據(jù)無(wú)菌要求，其生產(chǎn)操作需要在B級(jí)背景下的A級(jí)環(huán)境中進(jìn)行。非全密閉生物反應(yīng)器局部工藝布局如圖6所示。

圖6　非全密閉生物反應(yīng)器局部工藝布局

從圖6可以看出，非全密閉生物反應(yīng)器的生產(chǎn)操作間為B級(jí)環(huán)境，能耗較大，適用于不可完全密封、在線清洗的操作場(chǎng)合。而生物反應(yīng)器經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期發(fā)展，優(yōu)化升級(jí)，可實(shí)現(xiàn)全密閉培養(yǎng)和操作，實(shí)現(xiàn)在線清洗、滅菌等。通過(guò)生物反應(yīng)器的優(yōu)化升級(jí)，可降低對(duì)環(huán)境的要求，如果全過(guò)程實(shí)現(xiàn)密閉操作，則生產(chǎn)環(huán)境可降為D級(jí)，全密閉生物反應(yīng)器局部工藝布局如圖7所示。

從圖7可以看出，全密閉生物反應(yīng)器的生產(chǎn)操作間為D級(jí)環(huán)境，能耗較低。

圖7　全密閉生物反應(yīng)器局部工藝布局

4　結(jié)語(yǔ)

隨著GMP的深入發(fā)展及其對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量要求的不斷提高，無(wú)菌概念越來(lái)越受到關(guān)注與重視。本文針對(duì)不同生產(chǎn)工藝要求的病毒類(lèi)疫苗的無(wú)菌生產(chǎn)，對(duì)其工藝布局進(jìn)行了分析和優(yōu)化，提出了經(jīng)濟(jì)、有效、可行性較高的工藝布局模式。在滿(mǎn)足無(wú)菌操作要求的基礎(chǔ)上，充分考慮車(chē)間運(yùn)行成本，減少了高級(jí)別空調(diào)區(qū)域的面積，提高了工藝布局的經(jīng)濟(jì)性與可行性。