陳甲瑞 鞏文峰 邢瑜琪 卓瑪曲措 岳海梅

摘要：【目的】從西藏色季拉山長鞭紅景天根際土壤中分離篩選出溶磷菌株，為高寒植物根際促生菌的開發(fā)利用和豐富溶磷菌種質(zhì)資源提供理論基礎和科學依據(jù)?！痉椒ā恳蚤L鞭紅景天為研究物種，采用溶磷圈法從其根際土壤中分離溶磷菌，以鉬銻抗比色法測定溶磷量進行復篩；篩選出溶磷效果最好的菌株，測定其產(chǎn)吲哚乙酸（IAA）、固氮促生特性，結(jié)合形態(tài)、生理生化特性和16S rRNA序列分析進行分類鑒定。以芽孢桿菌為對照，將芽孢桿菌和分離獲得的溶磷菌株分別在4、10、15、20和30 ℃下培養(yǎng)7 d，研究其低溫適應性?！窘Y(jié)果】從長鞭紅景天根際土壤中篩選出21株具有溶磷作用的菌株，其中PSB19菌株在PKO無機磷培養(yǎng)基上的溶磷圈直徑/菌落直徑（D/d）最高，液體溶磷量達392.15 μg/mL，具有產(chǎn)IAA和固氮特性，其在4和10 ℃的低溫條件下生長良好。通過形態(tài)、生理生化鑒定和16S rDNA序列分析，將PSB19菌株歸類于粘著箭菌（Ensifer adhaerens）?！窘Y(jié)論】PSB19菌株有較好的溶磷、產(chǎn)IAA和固氮特性及低溫適應性，具有作為生物菌肥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及植被恢復等方面應用的潛力。

關鍵詞： 長鞭紅景天；溶磷菌；篩選；鑒定；低溫適應性

中圖分類號： S154.381 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2018）02-0280-07

Abstract：【Objective】The strains with sound phosphate solubilizing capacity were isolated from rhizosphere soil of Rhodiola fastigiata in Sehgyla Mountains in Tibet， and their taxonomic status， growth promoting effects and low temperature adaptation were introduced to provide theoretical basis and reference for developing growth promotion rhizobacteria of psychrophytes and enriching phosphate solubilizing strain resources. 【Method】R. fastigiata was research species. Phosphate solubilizing ring method was applied to isolate phosphate solubilizing bacteria， and the method of Mo-Sb colorimetry was applied to measure phosphorus solubilizing capacity. The strains with the optimum phosphorus solubilizing capacity were selected， and their abilities of indoleacetic acid（IAA） production， nitrogen fixation and growth promotion were evaluated. These strains were graded based on morphology， physiological-biochemical characteristics and 16S rRNA gene sequence. Bacillus subtilis was used as control. B. subtilis and the strains isolated were cultured at 4， 10， 15， 20 and 30 ℃ for 7 d to study their low temperature adaptability. 【Result】From the rhizosphere soil of Rhodiola fastigiata， 21 bacterial strains with inorganic phosphate solubilizing capacity were selected. Phosphate solubilizing diameter/colony diameter（D/d） value of PSB19 was the highest in PKO liquid culture medium， and soluble phosphorus content reached 392.15 mg/L. PSB19 had ability of IAA secretion， nitrogen fixation， and grew well under low temperature（4 and 10 ℃）. Through morphology， physiology and biochemistry identification and 16S rDNA sequence analysis， strain PSB19 was classified as Ensifer adhaerens. 【Conclusion】Strain PSB19 has sound phosphate solubilizing capacity， IAA production， nitrogen fixation and low temperature adaptation. Therefore， it might act as a biological bacterial fertilizer for the application in agricultural production and revegetation.

Key words： Rhodiola fastigiata； phosphate solubilizing bacteria； selection； identification； low temperature adaptation

0 引言

【研究意義】土壤中有95%～99%的磷以難溶的金屬螯合物形式存在，無法被植物根系吸收而影響植物的生長發(fā)育（Ramkumar and Kannapiran， 2011）。磷是植物生長發(fā)育所需的主要元素之一，在植物的光合作用、呼吸作用、能量運輸、信號轉(zhuǎn)導、大分子生物合成及豆科植物固氮等代謝過程中發(fā)揮著重要作用（Kouas et al.，2005；Khan et al.， 2010）。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，農(nóng)民通過增施可溶性磷肥來提高作物產(chǎn)量，但大部分的磷會與土壤中的Ca2+、Fe3+和Al3+等金屬離子絡合形成不溶性磷酸鹽，從而降低了磷肥的有效性（史吉平等，1998；夏文建等，2017）。此外，長期施用化肥不僅導致土壤肥力喪失，土壤板結(jié)，土壤微生物多樣性降低，還會造成生態(tài)環(huán)境污染（鄭世仲等，2009）。尤其在西藏地區(qū)，大部分耕地處在高海拔、高寒環(huán)境，其土壤肥力較差，土壤中的磷素主要以鐵磷、鋁磷和鈣磷等難溶態(tài)形式存在，很難被植物直接吸收（裴海，2002）。根際促生菌（PGPR）通過固氮、溶磷、代謝產(chǎn)生植物激素等直接或間接促進植物的營養(yǎng)元素循環(huán)，提高植物抗旱、抗寒及抵抗重金屬污染的能力（Parray et al.，2016），其中，溶磷菌能提高土壤磷素有效性，減少磷肥使用量（Adesemoye et al.，2009；宋小敏等，2016；林英等，2017），因此，篩選出適應西藏高海拔、高寒的溶磷根際促生菌具有重要的生產(chǎn)意義。【前人研究進展】已有研究發(fā)現(xiàn)植物的根際存在多種溶磷菌。王舒等（2015）從紅壤丘陵區(qū)油茶根際土壤中分離獲得5株解磷能力較強的解無機磷細菌，采用形態(tài)特征、生理生化、Biolog系統(tǒng)和16S rDNA序列分析鑒定，確定WB38為耳假單胞菌（Pseudomonas auricularis），WB39（WB75）為杓蘭果膠桿菌（Pectobacterium cypripedii），WB53（WB68）為路德維希腸桿菌（Enterobacter ludwigii）；舒健虹等（2017）從扁穗雀麥根際分離得到多株菌株，不僅具有較高的溶磷活性，還對扁穗雀麥具有較好的促生作用；伍善東等（2017）從油菜地土壤中分離到4株對卵磷脂有不同降解能力的細菌，結(jié)合解有機磷細菌的菌落形態(tài)特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析結(jié)果，初步確定菌株JYP-1和JYP-4為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），JYP-2和JYP-3為橋石短芽孢桿菌（Brevibacillus choshinensis）；武志海等（2017）利用溶磷圈法從水稻根際土壤中分離獲得2株對水稻具有明顯促生作用的菌株，分別屬于腸桿菌（Enterobacter sp.）和沙雷氏菌（Serratia sp.）。具有溶磷作用的菌株還有青霉屬（Aspergillus）（王莉晶等，2009）、曲霉屬（Penicillium）（龔明波等，2010）等，共生固氮菌也顯示出溶磷活性（Zaidi et al.， 2009）；部分溶磷菌還能有效抑制作物病原菌，增強作物抗病力（Wani et al.， 2007；伍善東等， 2017）。在西藏地區(qū)，劉芳等（2010）篩選出具有耐低溫和拮抗作用的細胞短桿狀LSSC3，其對擬南芥有較好的促生作用，說明在西藏特殊地理氣候條件下存在特殊的微生物資源?！颈狙芯壳腥朦c】從國內(nèi)外關于根際促生菌的文獻報道中可看出，在特定環(huán)境條件下根際促生菌具有其特有性和多樣性。目前，針對西藏這一特殊的地理單元，關于土壤根際促生菌中溶磷菌篩選的研究報道較少?！緮M解決的關鍵問題】以生長在高海拔、高寒、低氣壓、高輻射、晝夜溫差大的西藏色季拉山植物長鞭紅景天為研究物種，對其根際土壤中的根際溶磷菌進行分離和篩選，并對篩選獲得的高效溶磷菌株進行形態(tài)、生理生化、16S rDNA鑒定和低溫適應性試驗，以期為高寒植物根際促生菌的開發(fā)利用和豐富溶磷菌菌種資源提供理論基礎和科學依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

1. 1. 1 供試土樣 從地處藏東南的色季拉山海拔超過4600 m的山頂挖取帶完整根系的長鞭紅景天（Rhodiola fastigiata；在色季拉山瘠薄的土壤條件下生長旺盛，是西藏主要的藥用經(jīng)濟植物）植株根際土壤，用無菌袋裝好密封帶回實驗室，置于4 ℃冰箱保存。

1. 1. 2 培養(yǎng)基 無機磷（PKO）固體培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、NA培養(yǎng)基（李振高等，2008）及阿須貝無氮培養(yǎng)基（于文清等，2014）。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 溶磷菌的初篩與純化 采用稀釋分離法分離溶磷菌。依次吸取稀釋10-3、10-4、10 -5和10-6的土壤懸液各100.0 μL，分別涂布在PKO培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫倒置培養(yǎng)。培養(yǎng)9 d后，挑選菌落周圍產(chǎn)生溶磷圈的菌落到NA培養(yǎng)基上進行分離純化。出現(xiàn)單菌落后，NA培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)24 h，然后置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫罨鄣龋?008）。

1. 2. 2 溶磷菌促生特性測定

1. 2. 2. 1 定性測定 將保存的初篩溶磷菌株進行活化，28 ℃培養(yǎng)24 h后點接于PKO培養(yǎng)基上，每菌重復3皿，28 ℃倒置培養(yǎng)9 d 后取出，測定溶磷圈直徑（D）和菌落直徑（d），計算D/d，根據(jù)D/d確定各初篩溶磷菌株的溶磷能力（吳翔等，2014）。

1. 2. 2. 2 定量測定 采用鉬銻抗比色法（康慧穎等，2015），測定700 nm下的吸光值，繪制磷溶液標準曲線，計算溶磷量（?g/mL），從而進一步判斷其溶磷能力。

1. 2. 2. 3 產(chǎn)吲哚乙酸（IAA）定性測定 選取D/d和溶磷量最高的菌株，采用Salkowski比色法測定其產(chǎn)IAA能力，參照李振東等（2010）的方法配制PC比色液和S2比色液。分別取溶磷菌培養(yǎng)液和空白對照50.0 ?L，分別加入50.0 ?L比色液， 置室溫黑暗條件下靜置30 min后觀察其顏色變化，3個重復均變紅色為陽性， 表示能分泌IAA， 顏色越深表示分泌數(shù)量越多；3個重復均不變色為陰性， 表示不分泌IAA。

1. 2. 2. 4 固氮特性 將溶磷菌連續(xù)轉(zhuǎn)接5次到阿須貝無氮培養(yǎng)基上，均能正常生長的菌株視為具有固氮活性（代金霞等，2017）。

1. 2. 3 溶磷菌低溫適生特性檢測 將100.0 μL芽孢桿菌和溶磷菌菌液分別接種在盛有LB液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，以西藏微生物及植物病理重點實驗室從林芝砂生槐根際土壤中分離獲得的芽孢桿菌（該菌不能在低溫下生長，數(shù)據(jù)未列出）為對照，分別在4、10、15、20和30 ℃下培養(yǎng)7 d，每24 h搖勻取培養(yǎng)液在530 nm下測吸光值（謝永麗等，2014；Meena et al.， 2015）。

1. 2. 4 溶磷菌鑒定及系統(tǒng)發(fā)育進化分析 溶磷菌的形態(tài)觀察及生理生化測定方法參考《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》（東秀珠和蔡妙英，2001）。

溶磷菌的16S rDNA PCR擴增及系統(tǒng)發(fā)育進化分析：細菌16S rDNA引物設計、PCR擴增參考馬驄毓等（2017）的方法。PCR擴增體系50.0 μL：處理后的樣品（70 ng/μL）模板2.0 μL；dNTP Mixture（2.5 mmol/L）2.5 μL；27F（20 μmol/L）1.5 μL；1492R（20 μmol/L）1.5 μL；10×Ex Taq Buffer（Mg2+ plus）5.0 μL；Ex Taq酶（5 U/μL）0.2 μL，ddH2O補足至50.0 μL。DNA序列分析：將測得的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）中進行相似性搜索，與已報道細菌菌株的16S rDNA序列進行同源性比較，并利用MEGA 5.2構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1. 3 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2016進行處理，利用SPSS 20.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計及差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 溶磷菌的促生特性分析結(jié)果

2. 1. 1 溶磷特性 通過初篩從長鞭紅景天根際土壤中分離獲得21株溶磷菌，將其進行活化培養(yǎng)，點接到無機磷培養(yǎng)基上，通過透明圈法測定菌株溶磷能力（Meena et al.，2015），結(jié)果（表1）表明，21株溶磷菌在無機磷培養(yǎng)基上培養(yǎng)9 d，其D/d為1.92～4.00，溶磷菌株的溶磷效果存在明顯差異。將溶磷菌株接種于含Ca3（PO4）2的無機磷液體培養(yǎng)基中，利用鉬銻抗比色法對培養(yǎng)基中可溶性磷進行定量測定，結(jié)果（表1）表明，21株菌株均具有溶解無機磷的能力，不同菌株的溶磷能力不同，其中溶磷量最小為52.75 μg/mL，最大為392.15 μg/mL。在21株溶磷菌株中以PSB19菌株的D/d和溶磷量最高，因此選取PSB19菌株作進一步研究。

2. 1. 2 PSB19菌株產(chǎn)IAA和固氮的定性測定結(jié)果

通過比色反應可看出，含100 mg/L色氨酸的培養(yǎng)液（圖1-8～圖1-10）較不含色氨酸培養(yǎng)液（圖1-3～圖1-5）的顏色變化更明顯，分別呈紫紅色和淡紅色，與對照（圖1-1）有明顯差異，說明在金氏培養(yǎng)基中加入100 mg/L色氨酸能增加菌株IAA的分泌量。固氮特性測試結(jié)果（圖2）顯示，PSB19菌株在阿須貝無氮培養(yǎng)基中能正常生長，說明該菌株具有固氮能力。

2. 2 PSB19菌株低溫適應特性檢測結(jié)果

由圖3可看出，PSB19菌株在4～30 ℃的條件下均能生長，但在20 ℃以下菌株生長有所延遲。4 ℃下，PSB19菌株與對照在生長前5 d無明顯差異，培養(yǎng)5 d后PSB19菌株比對照生長迅速（圖3-A）；10 ℃下，培養(yǎng)4 d后PSB19菌株生長速度高于對照（圖3-B）；15和20 ℃下，PSB19菌株與對照的生長曲線相似，但PSB19菌株生長優(yōu)于對照（圖3-C和圖3-E）；30 ℃下，PSB19菌株與對照菌株的生長曲線基本無差別，在經(jīng)過短暫的延遲期后很快進入對數(shù)生長期。

2. 3 PSB19菌株鑒定結(jié)果

在LB培養(yǎng)基上，PSB19菌株的菌體呈桿狀（圖4），革蘭氏染色呈陰性。PSB19菌株菌落呈乳白色、濕潤、光滑，有黏液，邊緣整齊（圖5）。PSB19菌株對硝酸鹽還原、過氧化氫酶、甘露醇、檸檬酸鹽、淀粉水解和糖發(fā)酵作用呈陽性反應（表2）。根據(jù)16S rDNA測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST比對結(jié)果，對PSB19菌株與參比菌株進行系統(tǒng)發(fā)育進化分析，并將序列提交NCBI數(shù)據(jù)庫獲得登錄號為MF784286。從圖6可看出，PSB19菌株與登錄號為 KY753268.1的菌株（Ensifer adhaerens）處于同一分支，親緣關系較近，同源性高達99%，綜合形態(tài)觀察、革蘭氏染色及生理生化鑒定結(jié)果，將PSB19菌株暫定為粘著箭菌（E. adhaerens）。

3 討論

磷是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中一個重要的限制因素，而溶磷微生物干預似乎是解決土壤中磷有效性的有效途徑。微生物溶磷主要是通過有機酸溶磷（席琳喬等，2007）、酶解作用（Zhu et al.，2011）和質(zhì)子作用（李文紅和施積炎，2006）溶解難溶性磷。本研究以溶磷圈法初篩、鉬銻抗比色法復篩，得到多株具有較好溶磷作用的菌株，但菌株間的溶磷能力存在明顯差異。有些菌的D/d雖然小，但其液體溶磷量并不小，說明菌株的溶磷能力不僅與時間有關，還與菌株代謝物的種類和代謝產(chǎn)物在基質(zhì)中的蔓延程度等因素有關，因此，溶磷圈的大小并不與溶磷量完全呈正相關，與劉雪紅等（2013）、趙龍飛等（2015）的研究結(jié)果一致。

溫度是影響生物生長的重要因素，低溫會對細胞膜、酶活性、DNA復制和細胞結(jié)構(gòu)造成嚴重損壞（D'Amico et al.， 2006），但在生物進化過程中，低溫微生物已形成了適應低溫機制。青藏高原是生態(tài)環(huán)境最奇特、生物資源最豐富的自然資源寶庫之一，在高海拔和低溫的影響下，植物生長緩慢（李希來，2002）。本研究從長鞭紅景天根際土壤中分離獲得的PSB19菌株能在4和10 ℃的低溫下良好生長，且該菌具有固氮和產(chǎn)IAA特性，使得該菌在高原環(huán)境下具有作為生物菌肥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及植被恢復等方面應用的潛力。

本研究通過形態(tài)、生理生化鑒定和16S rDNA分子生物學鑒定，確定PSB19菌株為粘著箭菌（E. adhaerens，登錄號MF784286），該菌株與中華根瘤菌（Sinorhizobium）有較高的相似性。據(jù)前人對野生型粘著箭菌的研究結(jié)果表明，粘著箭菌不能在菜豆和銀合歡上形成根瘤，但從熱帶根瘤菌（Rhizobium tropici）獲得質(zhì)粒后的菌株可形成根瘤，說明該菌不屬于共生固氮菌類型（Rogel et al.，2001）。此外，該菌是否還具有其他促生作用，以及在高原條件下的最佳發(fā)酵條件和田間促生情況等均有待進一步探究。

4 結(jié)論

本研究從高海拔、高寒環(huán)境下生長良好的長鞭紅景天根際土壤中分離得到21株具有溶磷作用的菌株，其中PSB19菌株有較好的溶磷、產(chǎn)IAA和固氮特性，且在低溫下生長活躍，通過形態(tài)、生理生化特性和16S rDNA鑒定為粘著箭菌（E. adhaerens），該菌具有作為生物菌肥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及植被恢復等方面應用的潛力。

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（責任編輯 麻小燕）