霍韜光　郭婧潭　張穎花　劉求　付忠星　姜泓　康廷國(guó)

摘要：目的 測(cè)定朱砂給藥后活性硫的藥動(dòng)學(xué)特征。方法 建立單溴二胺（MBB）柱前衍生化-高效液相色譜法測(cè)定朱砂灌胃后大鼠血漿中活性硫水平的方法，并將該法用于大鼠灌服朱砂后血漿中活性硫的藥動(dòng)學(xué)研究。結(jié)果 大鼠血漿中活性硫在0.25～15 ?mol/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r>0.99），定量限和檢測(cè)限分別為0.1 ?mol/L和0.02 ?mol/L，方法的日內(nèi)、日間精密度分別小于4.4%、3.5%，準(zhǔn)確度為-9.9%～6.0%，平均回收率為74.9%。灌胃給予大鼠朱砂0.6 g/kg，血漿中活性硫Cmax為（1.33±0.13）?mol/L，tmax為（150±34）min，t1/2為（323±62）min，AUC0-∞為（5743±297）ng/mL·h。結(jié)論 本研究建立了靈敏、專屬、準(zhǔn)確的柱前衍生化-高效液相色譜法測(cè)定血漿中活性硫含量的方法，可用于朱砂灌胃大鼠血漿中活性硫的動(dòng)力學(xué)特征研究。

關(guān)鍵詞：朱砂；活性硫；柱前衍生化-高效液相色譜法；藥動(dòng)學(xué)特征

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.03.019

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2018）03-0086-04

Abstract： Objective To study the pharmacokinetic features of reactive sulfide in rats after oral administration of Cinnabaris. Methods An HPLC coupled with precolumn derivatization method was developed for the pharmacokinetic features study on reactive sulfide in rats after oral administration of Cinnabaris. Results Good linearity （r>0.99） was found for reactive sulfide in plasma in the concentration range of 0.25–15 ?mol/L （r>0.99）. The LOQ and LOD of the method were 0.1 ?mol/L and 0.02 ?mol/L， respectively. The intra- and inter-day precision was less than 4.4% and 3.5% respectively， and the accuracy was -9.9%–6.0%. The average recovery rate was 74.9%. 0.6 g/kg Cinnabaris was given the rats for gavage， and the time-course pharmacokinetics parameters were as follows： Cmax （1.33±0.13） ?mol/L， tmax （150±34） min， t1/2 （323±62） min， AUC0-∞ （5743±297） ng/mL·h. Conclusion A sensitive， robust and accurate precolumn derivatization-HPLC method for the determination of plasma reactive sulfide is developed and validated. The method is successfully applied in the pharmacokinetic features study on reactive sulfide in plasma of rats after administration of Cinnabaris.

Keywords： Cinnabaris； reactive sulfide； precolumn derivatization-HPLC； pharmacokinetic features

朱砂為硫化物類礦物辰砂族辰砂，主含硫化汞（HgS），具有清心鎮(zhèn)驚、安神解毒的功效[1-2]，廣泛應(yīng)用于內(nèi)、外、婦、兒等各科，發(fā)揮著不可替代的療效作用。很多著名中成藥制劑（安宮牛黃丸、朱砂安神丸、小兒至寶定、小兒金丹片等）中均含朱砂。現(xiàn)代藥理研究表明，朱砂具有鎮(zhèn)靜、催眠、抗驚厥、抗心律失常作用，能降低大腦中樞神經(jīng)興奮性[3-4]，而朱砂的藥效作用活性成分目前尚未見報(bào)道。

近年研究表明，硫化氫（H2S）作為第3種氣體信號(hào)分子，廣泛參與神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞代謝及炎癥反應(yīng)等眾多病理生理調(diào)節(jié)過(guò)程，在生物體內(nèi)發(fā)揮著重要的生物學(xué)作用[5-7]。在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)朱砂中有可溶性硫存在[8]。然而，朱砂中的可溶性硫是否可以作為體內(nèi)活性硫的供體在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮著某種生物學(xué)作用，朱砂給藥后硫在體內(nèi)的動(dòng)力學(xué)特征如何，均尚待進(jìn)一步研究。

本研究建立血漿中活性硫含量的測(cè)定方法并探討朱砂灌胃大鼠血漿中活性硫的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，確定朱砂中的硫可引起血漿中活性硫水平的改變，為揭示朱砂體內(nèi)作用機(jī)制及藥效/毒性作用物質(zhì)基礎(chǔ)的進(jìn)一步研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 儀器、試藥與動(dòng)物

高效液相色譜儀，包括1525型輸液泵、2487型紫外檢測(cè)器、Empower 2色譜數(shù)據(jù)工作站，美國(guó)Waters公司。ER-182A全自動(dòng)電子天平（十萬(wàn)分之一），日本A&D;公司；3K-18超速冷凍離心機(jī)，Sigma公司；pH-3c型酸度計(jì)，上海精密科學(xué)實(shí)業(yè)有限公司；Easypure純水系統(tǒng)，美國(guó)Barnstead公司。

朱砂（批號(hào)20050321），沈陽(yáng)市藥材公司；硫化鈉標(biāo)準(zhǔn)品，天津光復(fù)精細(xì)化工所；單溴二胺（MBB），Sigma公司；色譜甲醇，天津光復(fù)精細(xì)化工所；色譜乙腈，山東禹王有限公司；三氟乙酸，天津光復(fù)精細(xì)化工有限公司；磺基水楊酸，遼寧永強(qiáng)醫(yī)藥機(jī)械化玻有限公司；其他試劑均為分析純。

SPF級(jí)雄性Wistar大鼠18只，15周齡，體質(zhì)量250～300 g，中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)SYXK（遼）2008-0005。飼養(yǎng)環(huán)境：室溫（24±1）℃，相對(duì)濕度（50±5）%，室內(nèi)人工照明（12 h光/暗循環(huán)，光照時(shí)間6：00-18：00），標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由攝食飲水。

2 方法與結(jié)果

2.1 柱前衍生化-高效液相色譜法測(cè)定活性硫含量

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)控樣品的制備

精密稱取硫化鈉標(biāo)準(zhǔn)品適量，用去離子水溶解，配制成濃度為600 ?mol/L的標(biāo)準(zhǔn)貯備液。精密量取硫化鈉貯備液適量，用去離子水稀釋成濃度分別為0.5、1.0、2.5、6.0、15、30 ?mol/L的硫標(biāo)準(zhǔn)溶液。

取6只大鼠的混合血漿15 ?L，加入15 ?L硫標(biāo)準(zhǔn)溶液，得相當(dāng)于濃度為0.25、0.5、1.25、3.0、7.5、15 ?mol/L的硫血漿標(biāo)準(zhǔn)樣品。

取大鼠混合血漿15 ?L，加入15 ?L濃度為2.0、8.0、24 ?mol/L的硫標(biāo)準(zhǔn)溶液，得濃度為1.0、4.0、12 ?mol/L的硫血漿質(zhì)控（QC）樣品。

2.1.2 衍生化試劑的制備及衍生化反應(yīng)原理

精密稱取MBB標(biāo)準(zhǔn)品適量，用乙腈溶解并定容至10 mL容量瓶中，得濃度為1.5 mmol/L MBB衍生化試液，避光保存。MBB與硫氫根離子在堿性環(huán)境下反應(yīng)生成硫乙二胺（SDB）衍生物，在380 nm波長(zhǎng)處有較強(qiáng)的紫外吸收。反應(yīng)原理見圖1。

2.1.3 血漿樣品的處理

血漿中活性硫含量的測(cè)定參照SHEN X等[9-10]的方法，取血漿30 ?L，加入70 ?L Tris-HCl緩沖溶液（pH=9.5），渦旋混勻2 min，加入MBB衍生化試劑50 ?L（1.5 mmol/L），渦旋混勻2 min，室溫避光放置30 min，加入50 ?L磺基水楊酸（200 mmol/L），離心10 min（12 000 r/min，4 ℃），取上清液，經(jīng)0.22 ?m濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣分析。

2.1.4 色譜條件

衍生化樣品在Thermo C18柱（250 mm×4.6 mm，5 ?m）上分離，流動(dòng)相A為水（含0.1%三氟乙酸）、B為乙腈（含0.1%三氟乙酸），梯度洗脫（0～5 min，15%～35%B；5～16 min，35%～55%B；16～23 min，55%～70%B；23～24 min，70%～90%B，維持2 min），流速為0.6 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為380 nm，進(jìn)樣量為20 ?L。在此色譜條件下，空白試劑、硫化鈉標(biāo)準(zhǔn)品（6.0 μmol/L）和血漿樣品經(jīng)衍生化后典型色譜圖見圖2?？梢?，活性硫衍生物與其他內(nèi)源性化合物分離良好，活性硫衍生物的保留時(shí)間為19 min。

2.1.5 方法學(xué)考察

2.1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢測(cè)限

取血漿標(biāo)準(zhǔn)樣品，按“2.1.3”項(xiàng)下方法處理后，進(jìn)入高效液相色譜分析，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。以血漿樣品中硫濃度為橫坐標(biāo)，衍生物色譜峰面積為縱坐標(biāo)，用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行回歸計(jì)算，求得直線的回歸方程，即為標(biāo)準(zhǔn)曲線。檢測(cè)限為空白的3倍積分面積。結(jié)果表明血漿中活性硫在0.25～15 ?mol/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。典型的回歸方程為Y=865.05X-143.67（r=0.997 0），檢測(cè)限為0.02 ?mol/L。

2.1.5.2 方法的精密度與準(zhǔn)確度

取硫血漿QC樣品，按“2.1.3”項(xiàng)下方法處理，每個(gè)濃度分別制備5個(gè)樣本，重復(fù)3個(gè)分析，連續(xù)測(cè)定3 d，以當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算QC樣品的測(cè)得濃度，并與配制的濃度進(jìn)行對(duì)照，求得方法的準(zhǔn)確度與精密度。結(jié)果表明，方法的日內(nèi)、日間精密度RSD分別小于4.4%、3.5%，準(zhǔn)確度的RE為-9.9%～6.0%，見表1。

2.1.5.3 方法的回收率

取硫血漿QC樣品，按“2.1.3”項(xiàng)下方法處理，每個(gè)濃度5個(gè)樣本，按上述方法進(jìn)行分析。另取大鼠混合血漿15 ?L，加入15 ?L去離子水，得空白樣品，同法測(cè)定。方法的回收率（%）=（測(cè)得的QC樣品濃度-測(cè)得的空白樣品濃度）÷加入的硫標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度×100%。結(jié)果表明，活性硫低、中、高3個(gè)濃度血漿樣品的回收率分別為74.1%、71.0%、79.5%，見表1。

2.2 朱砂灌胃大鼠血漿中活性硫藥動(dòng)學(xué)研究

2.2.1 分組、給藥及取樣

SPF級(jí)雄性Wistar大鼠18只，隨機(jī)分為3組，每組6只，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。大鼠禁食12 h，分別灌胃給予0.5%CMC-Na溶液、0.6 g/kg朱砂混懸液及50 mg/kg硫化鈉溶液，分別于給藥前及給藥后10、20、30、60、120、180、240、360、480、1440 min于眼后緣靜脈采血0.2 mL，分離血漿，-70 ℃冰箱貯存，待測(cè)。

2.2.2 樣品測(cè)定

未知血漿樣品按“2.1.3”項(xiàng)下方法分析，測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)血漿樣品中活性硫濃度。

2.3 藥動(dòng)學(xué)特征

計(jì)算大鼠灌胃給予朱砂后不同時(shí)間點(diǎn)血漿中活性硫濃度，并繪制出血漿中平均活性硫濃度-時(shí)間曲線，采用藥動(dòng)學(xué)軟件計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。數(shù)據(jù)用—x±s表示。朱砂灌胃大鼠血漿中活性硫平均濃度-時(shí)間曲線見圖3?？梢?，灌胃朱砂后，大鼠血漿中活性硫濃度于灌胃后30 min和150 min分別2次達(dá)到峰值。朱砂灌胃大鼠血漿中活性硫主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見表2。同時(shí)觀察灌胃給予0.5%CMC-Na和硫化鈉后大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血漿中活性硫濃度的變化，發(fā)現(xiàn)灌胃給予0.5%CMC-Na的大鼠血漿中活性硫平均濃度無(wú)明顯變化，而灌胃給予硫化鈉的大鼠血漿中活性硫平均濃度在灌胃后30 min達(dá)到最大值（見圖4）。

3 討論

有文獻(xiàn)報(bào)道測(cè)定血漿活性硫采用高效液相色譜-熒光檢測(cè)法[9-10]，本研究采用高效液相色譜-紫外檢測(cè)，雖然檢測(cè)靈敏度低于熒光檢測(cè)，但擴(kuò)大了HPLC方法的應(yīng)用范圍。目前，雖然已有關(guān)于MBB法測(cè)定生物體內(nèi)硫化氫水平的方法研究報(bào)道，但并未對(duì)方法學(xué)進(jìn)行系統(tǒng)確證及將方法進(jìn)行應(yīng)用。本研究對(duì)方法的專屬性、靈敏度、精密度、準(zhǔn)確度、回收率和穩(wěn)定性進(jìn)行了系統(tǒng)研究，為方法的實(shí)際應(yīng)用提供試驗(yàn)依據(jù)。

朱砂藥用范圍十分廣泛。2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》收載含朱砂的成方制劑共362種，占其收載成方制劑總數(shù)的5.2%。朱砂的主要成分為HgS，但迄今為止，僅研究了朱砂中汞在體內(nèi)的動(dòng)力學(xué)過(guò)程[11-12]，而硫在體內(nèi)的過(guò)程研究目前尚未見報(bào)道。

本研究采用柱前衍生化-高效液相色譜-紫外檢測(cè)法測(cè)定朱砂灌胃大鼠血漿中活性硫的藥動(dòng)學(xué)特征。由大鼠灌胃給予朱砂后血漿中活性硫的平均濃度-時(shí)間曲線可見，灌胃給予朱砂后，大鼠血漿中活性硫平均濃度隨時(shí)間發(fā)生變化，并在灌胃后30 min和150 min分別2次達(dá)到最大值。而大鼠灌胃給予CMC-Na后血漿中活性硫水平隨時(shí)間無(wú)明顯變化。灌胃給予硫化鈉后大鼠血漿中活性硫水平也在灌胃后30 min達(dá)到最大值。通過(guò)比較，我們推測(cè)朱砂中的游離硫離子首先吸收入血，并在30 min達(dá)到最大值（與硫化鈉趨勢(shì)一致）。朱砂中主要成分HgS在胃和腸道內(nèi)可通過(guò)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)（胃： ；腸道： ）釋放出硫離子[13]，這可能是朱砂灌胃后150 min時(shí)血漿中活性硫平均濃度升高的原因，提示朱砂中的硫能起到活性硫供體的作用。

本研究建立了一種靈敏、專屬、準(zhǔn)確的柱前衍生化-高效液相色譜測(cè)定血漿中活性硫含量的方法，并將其成功用于測(cè)定朱砂灌胃大鼠血漿中活性硫的平均血漿濃度-時(shí)間曲線，計(jì)算出藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。確定了朱砂中的硫可作為活性硫供體，引起血漿中活性硫水平的改變。

參考文獻(xiàn)：

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：137.

[2] KUMAR A， NAIR A G， REDDY A V， et al. Bhasmas： unique ayurvedic metallic-herbal preparations， chemical characterization[J]. Biol Trace Elem Res，2006，109（3）：231-254.

[3] ZHANG F， LU Y， WU Q， et al. Role of cinnabar and realgar of WSHFD in protecting against LPS-induced neurotoxicity[J]. J Ethnopharmacol，2012，139（3）：822-828.

[4] WANG Q， YANG X， ZHANG B， et al. The anxiolytic effect of cinnabar involves changes of serotonin levels[J]. Eur J Pharmacol，2007， 565（1/2/3）：132-137.

[5] KOLLURU G K， SHEN X， KEVIL C G. A tale of two gases： NO and H2S， foes or friends for life？[J]. Redox Biol，2013，1：313-318.

[6] SZAB? C. Hydrogen sulphide and its therapeutic potential[J]. Nat Rev Drug Discov，2007，6（11）：917-935.

[7] WALLACE J L， DICAY M， MCKNIGHT W， et al. Hydrogen sulfide enhances ulcer healing in rats[J]. FASEB J，2007，21（14）：4070- 4076.

[8] 郭婧潭，張穎花，霍韜光，等.水飛法炮制對(duì)朱砂中可溶性硫和汞的影響[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2015，33（5）：1113-1115.

[9] SHEN X， PATTILLO C B， PARDUE S， et al. Measurement of plasma hydrogen sulfide in vivo and in vitro[J]. Free Radic Biol Med， 2011，50（9）：1021-1031.

[10] SHEN X， CHAKRABORTY S， DUGAS T R， et al. Hydrogen sulfide measurement using sulfide dibimane： critical evaluation with electrospray ion trap mass spectrometry[J]. Nitric Oxide，2014， 41：97-104.

[11] 楊堃，李秀芳，孫艷，等.大鼠口服朱砂的毒代動(dòng)力學(xué)研究[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2009，29（7）：534-537.

[12] 付中祥，楊虹，陳秀芬，等.朱砂、朱砂安神丸及氯化汞在小鼠體內(nèi)吸收、分布對(duì)比[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19（1）：162-166.

[13] ZHOU X， ZENG K， WANG Q， et al. In vitro studies on dissolved substance of cinnabar： chemical species and biological properties[J]. J Ethnopharmacol，2010，131（1）：196-202.

（收稿日期：2017-08-21）

（修回日期：2017-10-16；編輯：陳靜）