王　超， 閆鈺佳,2， 張?jiān)劄椋?武雨珽， 代方方

(1.陜西科技大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院， 陜西 西安　710021； 2.西北大學(xué) 化工學(xué)院， 陜西 西安　710069)

0　引言

還原型谷胱甘肽(GSH)是一種廣泛存在于各種生物細(xì)胞內(nèi)的含有巰基的三肽，這一特異結(jié)構(gòu)使其成為體內(nèi)重要的抗氧化劑和自由基清除劑[1].可以保護(hù)蛋白質(zhì)等分子中的巰基，抑制自由基對(duì)各種生物大分子的侵襲和生物膜的損傷；與進(jìn)入人體的有毒化合物、重金屬離子或致癌物質(zhì)等相結(jié)合，并促進(jìn)其排出體外，起到中和解毒的作用[2].鑒于GSH在細(xì)胞中的重要作用，如何快速、高效、特異性的檢測(cè)GSH非常重要.目前，常用的GSH檢測(cè)方法有分光光度法、碘量法、高效液相色譜法、酶循環(huán)法和紙層析法等.但是這些方法往往存在特異性不夠好，操作過(guò)程復(fù)雜，無(wú)法在細(xì)胞內(nèi)實(shí)時(shí)、原位檢測(cè)GSH等缺點(diǎn)[3].

熒光探針作為一種新型的檢測(cè)工具，經(jīng)過(guò)不斷地發(fā)展，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于各種物質(zhì)的特異性檢測(cè).它具有操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、選擇性好以及非生物破壞性等優(yōu)點(diǎn)，尤其可用于活細(xì)胞、組織甚至動(dòng)物體內(nèi)原位檢測(cè)各種物質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程，所以該方法對(duì)于疾病診斷與相關(guān)研究等具有重要的應(yīng)用價(jià)值[4-6].目前用于檢測(cè)GSH的熒光探針?lè)磻?yīng)機(jī)理主要基于分子中硫醇結(jié)構(gòu)與探針間的特異性反應(yīng)[7-11].例如，利用GSH分子中巰基的親核性或還原性，使得熒光探針?lè)肿又胁糠只瘜W(xué)鍵斷裂，改變熒光探針的光譜性質(zhì)，實(shí)現(xiàn)GSH熒光檢測(cè)[7].

本論文以8-羥基久洛尼定為基本骨架，利用其剛性平面結(jié)構(gòu)增強(qiáng)香豆素母體的平面性，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)熒光探針波長(zhǎng)的紅移.同時(shí)，在香豆素母體3,4位分別引入醛基和氯原子作為GSH氨基和巰基的識(shí)別位點(diǎn)，最終獲得高特異性的GSH熒光探針，并進(jìn)一步通過(guò)光譜分析評(píng)價(jià)該熒光探針用于GSH比率響應(yīng)、定量檢測(cè)的可行性.

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1　試劑與儀器

(1)主要試劑：丙二酸、苯酚、三氯氧磷、間氨基苯酚、1-溴-3-氯丙烷、甲苯、碳酸氫鈉、DMF、無(wú)水硫酸鎂、乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇、石油醚、KH2PO4、Na2HPO4·12H2O、氯化鈉、氯化鉀、谷胱甘肽、L-半胱氨酸、二甲基亞砜、氘代氯仿，均為分析純.

(2)主要儀器：RE-52系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；SHB-Ⅲ型循環(huán)水多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)；Lumina熒光分光光度計(jì)(賽默飛世爾科技有限公司)；400 MHz核磁共振波譜儀(bruker公司)；PHS-3E型pH計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司).

1.2　探針的合成

目標(biāo)探針?lè)肿拥暮铣陕肪€如圖1所示.經(jīng)過(guò)四步合成得到，具體步驟如下.

1.2.1丙二酸二苯酯(1)的合成

參考Liu等[12]報(bào)道的方法，將三氯氧磷(4.7 mL，50.3 mmol)加入茄形瓶中，在冰水浴條件下，將丙二酸(4.49 g，43.3 mmol)和苯酚(8.15 g，86.6 mmol)緩慢的滴加到三氯氧磷中.在油浴115 ℃下回流反應(yīng)1.5 h，直到無(wú)氯化氫氣體冒出.反應(yīng)結(jié)束后，將上層黃色油狀液體倒入75 mL的水中，然后用150 mL乙酸乙酯萃取3次，無(wú)水硫酸鎂干燥，抽濾，旋蒸除去溶劑，得到黃色油狀產(chǎn)品10.32 g，產(chǎn)率94%，產(chǎn)物純度高，未經(jīng)進(jìn)一步純化直接用于下一步反應(yīng).

1.2.28-羥基久洛尼定(2)的合成

參考Liu等[13]報(bào)道的方法，將間氨基苯酚(8.73 g，80 mmol)溶于DMF(40 mL)中，再加入1-溴-3-氯丙烷(50.4 g，320 mmol)，最后加入碳酸氫鈉(26.88 g，320 mmol).加熱60 ℃，回流反應(yīng)15 h后，再升高溫度到90 ℃，回流9 h.反應(yīng)結(jié)束后，加入150 mL的乙酸乙酯萃取，300 mL水洗三次，無(wú)水硫酸鎂干燥，抽濾，旋蒸除去溶劑，得到黑色膠狀液體.硅膠柱色譜分離，展開(kāi)劑為石油醚∶乙酸乙酯=10∶1.得到白色固體產(chǎn)物3.4 g，產(chǎn)率23%.化合物結(jié)構(gòu)經(jīng)核磁共振氫譜表征.

1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ:6.66 (d，J=8.0 Hz，1H)，6.06(d，J=8.0 Hz，1H)，4.43(s，1H)，3.10(dd，J=11.0，4.5 Hz，4H)，2.68(dt，J=14.9，6.6 Hz，4H)，2.03～1.91 (m，4H) ppm.

1.2.39-羥基香豆素6H(3)的合成

參考Chen等[14]報(bào)道的方法，將8-羥基久洛尼定(0.5 g，2.64 mmol)、丙二酸二苯酯(0.56 g，2.15 mmol)、甲苯(4 mL)加入茄形瓶中.在115 ℃下回流反應(yīng)6 h.反應(yīng)結(jié)束后，將上層墨綠色液體倒掉.下層沉淀物加入石油醚洗滌，干燥后得到產(chǎn)物0.41 g，產(chǎn)率62%.

1.2.4探針的合成

參考Zhang等[15]報(bào)道的方法，將9-羥基香豆素6H(3)(0.32 g，1.25 mmol)溶于DMF(3.9 mL)中，記為①，將DMF(1 mL)和三氯氧磷(0.7 mL)混合，加熱50 ℃，磁力攪拌30 min，記為②，將①緩慢的滴加到②中，升溫到60 ℃反應(yīng)6 h.反應(yīng)結(jié)束后，取7 mL冰水，將反應(yīng)物倒入，產(chǎn)物析出，抽濾，干燥，得到磚紅色固體.硅膠柱色譜分離，展開(kāi)劑二氯甲烷∶甲醇=20∶1.得到固體產(chǎn)品0.165 g，產(chǎn)率43%.化合物結(jié)構(gòu)經(jīng)核磁共振氫譜表征.

1H NMR (400 MHz，CDCl3)δ:10.27(s，1H)，7.43(s，1H)，3.38(dd，J=11.9，6.8 Hz，4H)，2.86(t，J=6.4 Hz，2H)，2.79(t，J=6.2 Hz，2H)，2.03～1.93(m，4H)ppm.

圖1　探針的合成路線

1.3　光譜測(cè)試

探針母液的配制：準(zhǔn)確稱量探針的質(zhì)量，將其溶于DMSO中，配制成濃度為5 mmol/L的母液備用.檢測(cè)物母液的配制：準(zhǔn)確稱量GSH和L-半胱氨酸(Cys)的質(zhì)量，將GSH和Cys分別溶于PBS緩沖液中，配制成濃度為10 mmol/L的母液備用.工作液的配制：將母液用含有10%二甲基亞砜的PBS稀釋到一定的倍數(shù)，得到所需工作液的濃度，探針為10μmol/L.按實(shí)驗(yàn)濃度分別將GSH和Cys加入探針溶液中，進(jìn)行光譜測(cè)試.

2　結(jié)果與討論

2.1　探針的光譜性質(zhì)與GSH的響應(yīng)

通過(guò)核磁共振氫譜表征，確定探針結(jié)構(gòu)正確，分別測(cè)定其激發(fā)和發(fā)射光譜如圖2(a)所示.激發(fā)波長(zhǎng)峰值為466 nm，發(fā)射波長(zhǎng)峰值為516 nm.

在探針中加入GSH后其光譜性質(zhì)如圖 2(b)所示.與圖 2(a)相比，其激發(fā)和發(fā)射光譜均發(fā)生了變化，激發(fā)光譜波長(zhǎng)發(fā)生紅移.熒光光譜也呈現(xiàn)顯著地紅移現(xiàn)象，在516 nm處的發(fā)射峰消失，在561 nm處出現(xiàn)新的發(fā)射峰.探針和GSH反應(yīng)，應(yīng)該生成了共軛程度更高的物質(zhì)，從而使其激發(fā)和發(fā)射光譜均發(fā)生紅移.

(a)探針(10 μmol/L)

(b)探針(10 μmol/L)加入50 μmol/L GSH圖2　探針加入GSH前后的激發(fā)、發(fā)射光譜

2.2　探針對(duì)GSH響應(yīng)的選擇性

當(dāng)GSH熒光探針在檢測(cè)應(yīng)用時(shí)，易受到Cys等巰基化合物的干擾，為評(píng)價(jià)探針對(duì)于GSH響應(yīng)的選擇性，選用和GSH具有相似結(jié)構(gòu)的Cys作為對(duì)比.在使用380 nm的光激發(fā)時(shí)，探針對(duì)于GSH和Cys的熒光響應(yīng)如圖3(a)所示.由圖可知，探針及其與GSH反應(yīng)后熒光較弱，而探針與Cys反應(yīng)后熒光較強(qiáng)，峰值為515 nm.在使用470 nm光激發(fā)時(shí)，探針對(duì)于GSH和Cys的熒光響應(yīng)如圖3(b)所示.與探針相比，探針與GSH和Cys反應(yīng)后，熒光強(qiáng)度均減弱.其中，與GSH反應(yīng)后熒光峰值發(fā)生顯著紅移，與Cys反應(yīng)后熒光峰值發(fā)生微弱藍(lán)移.同時(shí)，可見(jiàn)光下和在紫外光下的熒光圖像如圖3(c)～(e)所示，三者之間熒光顏色有顯著差異.綜上，探針可以較好地實(shí)現(xiàn)GSH與Cys的選擇性檢測(cè).

2.3　探針與GSH和Cys反應(yīng)機(jī)理推測(cè)

參考文獻(xiàn)報(bào)道的機(jī)理[11]，推測(cè)探針和GSH及Cys的作用機(jī)理如圖4所示.當(dāng)探針和GSH反應(yīng)時(shí)，巰基對(duì)氯原子進(jìn)行取代，由于空間位阻效應(yīng)，其分子內(nèi)氨基不會(huì)對(duì)巰基發(fā)生進(jìn)一步取代，而是與醛基反應(yīng)生成希夫堿結(jié)構(gòu)，并進(jìn)一步形成分子內(nèi)氫鍵，會(huì)使其共軛程度增強(qiáng)，其激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)均會(huì)發(fā)生紅移.而探針與Cys反應(yīng)時(shí)，與GSH反應(yīng)類似，巰基會(huì)對(duì)氯原子進(jìn)行取代，但是由于Cys分子較小所受空間位阻小，其分子內(nèi)氨基會(huì)進(jìn)一步對(duì)巰基發(fā)生取代，因而影響了探針的共軛結(jié)構(gòu)，使其激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)都發(fā)生藍(lán)移.

(a)380 nm波長(zhǎng)激發(fā)的熒光光譜

(b)470 nm波長(zhǎng)激發(fā)的熒光光譜

(c)可見(jiàn)光下熒光圖像

(d)紫外燈254 nm下熒光圖像

(e)紫外燈365 nm下熒光圖像圖3　探針對(duì)于GSH和Cys的熒光響應(yīng)

圖4　探針與GSH、Cys的反應(yīng)機(jī)理

2.4　探針對(duì)GSH的響應(yīng)過(guò)程分析

為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)探針對(duì)GSH的檢測(cè)能力，進(jìn)行了探針的響應(yīng)過(guò)程分析.在10 μmol/L探針中加入50 μmol/L的GSH后，在不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)定反應(yīng)體系的熒光光譜.

如圖5(a)所示，當(dāng)470 nm光激發(fā)時(shí)，隨著時(shí)間的延續(xù)，探針在516 nm處的發(fā)射峰逐漸降低，表明探針逐漸發(fā)生反應(yīng)被消耗.其在516 nm處的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化關(guān)系如圖5(a)插圖所示，在250 min后，熒光強(qiáng)度基本趨于不變，說(shuō)明反應(yīng)基本完全，經(jīng)擬合表明該反應(yīng)過(guò)程符合二級(jí)反應(yīng)特征.

如圖5(b)所示，當(dāng)540 nm光激發(fā)時(shí)，隨著時(shí)間的延續(xù)，561 nm處出現(xiàn)顯著的熒光峰，且強(qiáng)度逐漸增大，表明探針與GSH逐漸反應(yīng)生成新的化合物.561 nm處的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化關(guān)系如圖5(b)插圖所示，表明新化合物的生成過(guò)程同樣符合二級(jí)反應(yīng)特征.

(a)470 nm波長(zhǎng)光激發(fā)

(b)540 nm波長(zhǎng)光激發(fā)圖5　探針加入GSH后在不同波長(zhǎng)光激發(fā)時(shí)的熒光變化過(guò)程

2.5　探針對(duì)不同濃度GSH的響應(yīng)分析

為評(píng)價(jià)探針用于GSH定量檢測(cè)的可行性，固定探針濃度，分析了探針對(duì)不同濃度GSH響應(yīng)的熒光光譜，如圖6所示.為更好地展示探針比率響應(yīng)的性能，選擇510 nm光作為激發(fā)光源.由圖6可知，隨著GSH濃度的升高，522 nm處的熒光峰逐漸降低，而561 nm處的熒光峰逐漸升高，呈現(xiàn)典型的比率響應(yīng)特征.對(duì)兩處熒光峰強(qiáng)度比率擬合分析，結(jié)果如圖6插圖所示，呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系.因此，根據(jù)熒光比率關(guān)系可實(shí)現(xiàn)GSH濃度的定量檢測(cè).

圖6　探針與不同濃度的GSH(0.1、0.5、1、 2、4、10、 20、40和100 μmol/L)反應(yīng)后的熒光光譜(插圖為I 561 nm/I 522 nm比率與GSH濃度關(guān)系)

3　結(jié)論

本文以8-羥基久洛尼定為基本骨架，合成了一例基于香豆素的GSH熒光探針.結(jié)果表明，該探針對(duì)GSH具有較高的選擇性，對(duì)GSH響應(yīng)后，探針在516 nm處的熒光逐漸減弱，561 nm處熒光逐漸增強(qiáng)，呈現(xiàn)典型的比率型響應(yīng)特征.該探針對(duì)不同濃度GSH的熒光響應(yīng)呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系，表明該探針可以實(shí)現(xiàn)GSH的特異性和定量檢測(cè).