劉彩萍， 白　陽

(陜西科技大學 化學與化工學院 陜西省輕化工助劑重點實驗室， 陜西 西安　710021)

0　引言

近年來，基于金屬配合、π-π堆積、主客體識別、氫鍵等非共價作用力構筑的超分子聚合物(SPs)因其構筑驅(qū)動力動態(tài)可逆和多重刺激響應性的特點備受關注，廣泛應用于構筑刺激響應性聚合物、藥物控釋載體和生物成像領域[1-4].目前，基于主客體識別的非共價作用在環(huán)境刺激條件下表現(xiàn)出豐富的包合和解包合特性，而且主客體識別誘導的自組裝過程只需在合適條件下進行“模塊化”組分配比和簡單的后處理即可自發(fā)形成，不需進行催化或化學反應，方法簡單，產(chǎn)物易得，并具有豐富的環(huán)境刺激響應性[5,6].在眾多主體大環(huán)分子中，β-環(huán)糊精具有溶解性好、低毒廉價、來源豐富的特點，不僅能在生物利用率方面增強細胞膜吸收，并能促進其在細胞膜中的滲透[7-10]，具有十分優(yōu)異的性能表現(xiàn).基于環(huán)糊精-客體分子的主客體包合作用構筑的超分子聚合物也因其具有多種刺激響應性優(yōu)點，可用于包載抗癌藥物，實現(xiàn)藥物控制釋放[11-15].例如，Peng L等[16,17]多次制備的基于β-環(huán)糊精與二茂鐵主客體識別作用的超分子聚合物可在水中自組裝形成膠束，用以包載疏水性的藥物分子，實現(xiàn)氧化還原控制的藥物釋放. Zhang H等[18]以環(huán)糊精和偶氮苯的主客體包合作用制備了可“呼吸”空心納米球，并實現(xiàn)藥物在溫度刺激響應下的控制釋放.

目前，化學治療是國內(nèi)外治療癌癥最主要和最有效的方法，但多數(shù)抗癌藥物水溶性差、吸收困難，并具有一定的毒副作用[19-26].由于腫瘤細胞與人體正常細胞內(nèi)微環(huán)境的差異[27-31]，如腫瘤細胞內(nèi)酸性的內(nèi)涵體/溶酶體環(huán)境(pH 5.0～5.5)，因此制備對腫瘤細胞的內(nèi)部環(huán)境具有刺激響應性的聚合物藥物運送載體，并利用腫瘤組織的高通透性和滯留效應(EPR效應)，有望實現(xiàn)藥物在腫瘤細胞內(nèi)的富集和靶向釋放，提高有效利用率，降低由藥物本身的毒性而產(chǎn)生的毒副作用.

本論文首先通過對β-環(huán)糊精進行改性制備環(huán)糊精-阿霉素的前藥分子，阿霉素與環(huán)糊精之間以pH響應性動態(tài)化學鍵-酰腙鍵相連，然后利用環(huán)糊精和偶氮苯的主客體包合作用構筑超分子聚合物并在純水中自組裝形成以疏水性抗癌藥阿霉素為核，親水性聚甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯為殼的前藥膠束.最后對所構筑聚合物-前藥膠束的體外藥物控釋行為進行了研究，超分子聚合物的構筑及藥物控釋行為如圖1所示.

圖1　CD-DOX/Azo-PDMA超分子聚合物-前藥納米膠束的制備及酸性環(huán)境誘導的體外藥物釋放行為

1　實驗部分

1.1 原料與儀器

(1)主要原料：β-環(huán)糊精(β-CD)，天津市科密歐化學試劑有限公司，分析純；溴乙酸乙酯、水合肼(NH2NH2·H2O)、甲基丙烯酸-N,N-二甲氨基乙酯(DMA),上海麥克林生化科技有限公司；鹽酸阿霉素(DOX·HCl)，薩恩化學技術(上海)有限公司；4-(苯基偶氮基)苯酚(Azo-OH)、1,1,4,7,7-五甲基二亞乙基三胺(PMDETA),北京百靈威科技有限公司；氫化鈉(NaH)，質(zhì)量分數(shù)為60%，保存于煤油中，北京百靈威科技有限公司；2-溴異丁酰溴(BIBB)，阿拉丁試劑.以上試劑均為直接使用.溴化亞銅(CuBr)使用前在乙酸中攪拌過夜，乙醇中洗滌三次除去殘留乙醇，25 ℃下真空干燥兩天，天津市天力化學試劑有限公司；三乙胺(TEA)使用前用4A級分子篩除水，廣州市金華大化學試劑有限公司.

(2)主要儀器：傅立葉紅外光譜(FTIR)在VECTOR-22型紅外光譜儀上測定，測試試樣為KBr涂片，分辨率4 cm-1，每個樣品掃描32次；1H NMR及2D1H NMR NOESY采用Bruker AV-400 核磁共振儀(Bruker BioSpin,Switerland)測定，CDCl3，DMSO-d6或D2O為溶劑，以四甲基硅烷為內(nèi)標；分子量和分子量分布在美國waytt公司凝膠滲透色譜/多角度激光光散射聯(lián)用儀(SEC/MALLS)上測定，色譜柱型號為：MZ 103 ?(300×6.8 mm)，THF為流動相，進樣量0.2 mL，溶劑流出速度為0.5 mL/min，測定溫度為40 ℃，聚合物溶液的dn/dc值通過Optilab rEX型示差折光儀測定，使用Waters 515型泵.

1.2　實驗步驟

1.2.1酯化環(huán)糊精β-cyclodextrin-ester(β-CD-ester)的制備

1.2.2酰肼化環(huán)糊精β-CD-hydrazide的制備

向10mL圓底燒瓶中加入β-CD-ester(1 g，0.81 mmol)，NH2NH2·H2O(3 mL)和2 mL DMF，室溫下磁力攪拌24 h.反應完成后，使用冰丙酮沉淀，抽濾并真空干燥，得到白色固體β-CD-hydrazide.FTIR(KBr)：1 662 cm-1(ν，C=O).1H NMR(DMSO-d6，TMS，δ)：1.74～2.0(2H，-NH2)，3.20～3.90(2,3,4,5,6H inβ-CD)，4.39～4.61(6H，6-OH)，4.78～4.92(7H，1H inβ-CD)，5.69～5.87(14H，2,3-OH)，7.93～8.01(1H，-NHNH2).

1.2.3β-環(huán)糊精-阿霉素前藥分子(β-CD-hydrazone- DOX)的制備

參考文獻[32]的方法，向圓底燒瓶中加入β-CD-hydrazide(62.1 mg，0.05 mmol)，DOX·HCl (43.5 mg，0.075 mmol)，25 mg無水Na2SO4和2.5 mL DMF，攪拌5 min.隨后加入一滴冰乙酸并通氮氣10 min，于避光狀態(tài)下室溫攪拌40 h.反應完成后，抽濾除去無水Na2SO4，濾液在冰丙酮中沉淀，抽濾，將粗產(chǎn)物用無水乙醇洗三次，真空干燥，得紅色固體β-CD-hydrazone-DOX，產(chǎn)率22.2%.FTIR(KBr)：1 659 cm-1(ν，C=O).1H NMR(DMSO-d6，TMS，δ)：1.01～1.31(3H，-CH3)，3.99(3H，-OCH3)，7.61～8.00(3H，Ar).

1.2.4引發(fā)劑2-溴-2-異丁酯偶氮苯(Azo-Br)的制備

參考文獻[33]的方法，將4-(苯基偶氮基)苯酚(1.5 g，7.6 mmol)和三乙胺(1.53 g，15.2 mmol)溶于50 mL CH2Cl2，在冰浴條件下將2-溴異丁酰溴溶液(3.5 g 溶于20 mL CH2Cl2，15.2 mmol)逐滴加入反應瓶中，室溫下攪拌24 h.反應完成后，抽濾除去不溶性鹽，將濾液用每次不少于50 mL的去離子水萃洗3次，并用無水Na2SO4干燥，濃縮得粗產(chǎn)物.將粗產(chǎn)物在乙醇中重結晶3次，得到橙黃色晶體產(chǎn)物，產(chǎn)率47.02%.1H NMR(CDCl3，TMS，δ)：2.079(6H，-CH3)，7.38～8.05(9H，Ar).MS，F(xiàn)ound m/z：369.02[M+Na]+.

1.2.5偶氮苯封端的聚甲基丙烯酸-N,N-二甲氨基乙酯(Azo-PDMA)的制備

1.2.6CD-DOX/Azo-PDMA超分子聚合物膠束溶液的制備與表征

將β-CD-hydrazone-DOX(2 mg)和Azo-PDMA(6 mg)溶于2 mL的DMF，攪拌30 min后加入40μL TEA作為縛酸劑，繼續(xù)攪拌30 min后緩慢滴加2 mL的去離子水，攪拌過夜.使用截留分子量為1 000的透析袋透析上述混合溶液，得CD-DOX/Azo-PDMA超分子聚合物膠束溶液7.5 mL，向膠束溶液中加入0.5 mL去離子水，定容至1 mg/mL.超分子聚合物的制備如圖2(c)所示.

超分子聚合物膠束溶液超聲20 min，磁力攪拌30 min后，使用Nano Brook 90Plus Zeta型多角度激光粒度儀(DLS)測定Dz值，測試溫度25 ℃，散射光由垂直極化的He-Ne激光器發(fā)射，測試角度90°.將7μL膠束溶液滴于銅網(wǎng)上，5 min后除去附著液體，使用Hitachi-760型透射電子顯微鏡測試，加速電壓75 KV.

1.2.7DOX體外控制釋放實驗

(1)DOX溶液標準曲線的建立

用pH為7.4的磷酸鹽緩沖液配濃度2.5×10-5mmol/mL的鹽酸阿霉素溶液，稀釋此溶液，得到濃度為0.1 mmol/mL、0.25 mmol/mL、0.5 mmol/mL、0.75 mmol/mL、1.0 mmol/mL、2.5 mmol/mL、5.0 mmol/mL、7.5 mmol/mL和10×10-6mmol/mL的一系列標準溶液，并測568 nm處熒光強度，得到熒光標準曲線.

(2)體外控釋實驗

兩個廣口瓶中分別加入pH為5.0和7.4的磷酸鹽緩沖液40 mL，取CD-DOX/Azo-PDMA超分子聚合物膠束溶液2 mL移入截留分子量1 000的透析袋，將透析袋浸沒在緩沖液中，于37 ℃下恒溫振蕩.特定的時間點在廣口瓶中取出3 mL緩沖液，并再加入相同體積的緩沖液.pH為5.0和7.4的實驗分別平行進行三次.將取出的溶液測熒光，根據(jù)DOX的熒光標準曲線，得到DOX的濃度，并計算累計釋放率，累計釋放率的計算公式如式(1)所示：

(1)

(a)β-CD-hydrazone-DOX的合成路線

(b)Azo-PDMA的合成路線

(c)CD-DOX/Azo-PDMA超分子聚合物的制備圖2　β-CD-hydrazone-DOX，Azo-PDMA的合成路線和CD-DOX/Azo-PDMA超分子聚合物的制備

2　結果與討論

2.1　β-CD-hydrazone-DOX的合成及表征

β-CD-hydrazone-DOX的合成路線如圖2(a)所示.首先通過β-環(huán)糊精的酯化反應制備其衍生物β-CD-ester，由于β-環(huán)糊精6位羥基較活潑，當其與過量氫化鈉反應后脫去H2生成醇鈉，并進一步與溴乙酸乙酯反應制得β-CD-ester.β-CD-ester的FT-IR如圖3中a曲線所示，1 745 cm-1處出現(xiàn)酯基的特征吸收峰；結合1H NMR譜圖4(a)，δ=1.215、4.145和4.127處出現(xiàn)溴乙酸乙酯特征氫a,b,c的吸收峰，證明成功合成了β-CD-ester.通過對溴乙酸乙酯氫a的吸收峰和β-環(huán)糊精2,3位的羥基氫的吸收峰進行積分計算，峰面積比約為1∶3，因此溴乙酸乙酯對β-環(huán)糊精的平均取代度為1.5.接下來通過氨解反應制備酰肼化β-環(huán)糊精衍生物β-CD-hydrazide，其FT-IR如圖3中b曲線所示，1 662 cm-1處出現(xiàn)酰肼鍵的特征吸收峰，且1 745 cm-1處酯基特征吸收峰消失，此外，在其1H NMR譜圖4(b)出現(xiàn)仲胺和伯胺氫的特征吸收峰，同時溴乙酸乙酯a和c氫的特征峰消失，以上測試結果證明酯基氨解完全，生成了酰肼鍵.最后通過β-CD-hydrazide與DOX羰基在冰醋酸催化下的席夫堿反應制得目標產(chǎn)物β-CD-hydrazone-DOX，粗產(chǎn)物使用無水乙醇反復溶洗除掉未反應的DOX.如圖4(c)所示，1H NMR譜圖上出現(xiàn)DOX的特征吸收峰，表明β-CD-hydrazide與DOX發(fā)生了反應.DOX的氫e與β-環(huán)糊精2,3位的羥基氫吸收峰面積積分比為1∶3.1，平均取代度為1.6，與溴乙酸乙酯對β-環(huán)糊精的平均取代度相一致.以上結果表明最終成功制備了 DOX以酰腙共價鍵連接在環(huán)糊精上的前藥分子β-CD-hydrazone-DOX.

圖3　β-CD-ester，β-CD-hydrazide和β-CD-hydrazone-DOX的FT-IR圖

(a)β-CD-ester (b)β-CD-hydrazide (c)β-CD-hydrazone-DOX圖4　β-CD-ester,β-CD-hydrazide和β-CD-hydrazone-DOX 的1H NMR圖

2.2　偶氮苯端基聚合物Azo-PDMA的合成及表征

聚合物Azo-PDMA以Azo-Br作為引發(fā)劑，通過ATRP聚合反應得到，合成路線如圖2(b)所示.引發(fā)劑由Azo-OH與過量BIBB進行酯化反應制備，反應以三乙胺為縛酸劑，粗產(chǎn)物在無水乙醇重結晶制得.Azo-Br的1H NMR如圖5(a)所示，偶氮苯對應氫原子a,b,c,d與BIBB的異丁基特征氫e均可被觀察到，峰面積比接近2∶2∶3∶2∶6.此外，質(zhì)譜測試的分子量為369.02[M+Na]+(如圖6所示)，與理論分子量相符.表明成功合成了引發(fā)劑Azo-Br.ATRP聚合以CuBr為催化劑，60 ℃條件下聚合3 h.其中引發(fā)劑Azo-Br，單體DMA，配體PMDETA和催化劑CuBr的摩爾比為1∶20∶1∶1.1H NMR如圖5(b)所示，可清楚地觀察到Azo和PDMA的特征吸收峰，通過積分計計算Azo-Br特征氫c的吸收峰和PDMA鏈上特征氫e的吸收峰的面積比得出PDMA的平均聚合度DPNMR=37，由此計算出Azo-PDMA的數(shù)均分子量(Mn,NMR)為37×157+346=6 155，此外，SEC/MALLS測試Azo-PDMA的分子量為5 800，兩者保持一致，同時，分子量分布為1.12，測試淋洗曲線呈單窄峰分布，如圖7所示，以上結果均表明成功制得了窄分子量分布的聚合物Azo-PDMA.

(a)Azo-Br (b)Azo-PDMA圖5　Azo-Br和Azo-PDMA的1H NMR圖

圖6　Azo-Br的質(zhì)譜圖

圖7　Azo-PDMA的SEC/MALL淋洗曲線

2.3　CD-DOX/Azo-PDMA超分子聚合物的構筑及其自組裝性能

CD-DOX/Azo-PDMA 超分子聚合物通過混合溶劑溶解并透析的方法制得.β-CD的疏水空腔對偶氮苯具有強包結絡合作用，在水溶液中，偶氮苯能夠進入β-環(huán)糊精的空腔，2D1H NMR NOESY如圖8所示，β-環(huán)糊精的3,5-H質(zhì)子與偶氮苯的a,c氫質(zhì)子之間出現(xiàn)了交叉峰，說明CD-DOX/Azo-PDMA超分子聚合物是由環(huán)糊精與偶氮苯的主客體相互作用形成的.所構筑的超分子聚合物為兩親性聚合物，其中藥物分子DOX具有疏水性，聚合物鏈PDMA具有親水性，因此超分子聚合物在水中可形成以DOX為核，PDMA為殼層并具有一定尺度的膠束自組裝體.動態(tài)光散射(DLS)如圖9(b)所示，平均粒徑82 nm，TEM如圖9(a)所示，可清楚觀察到球形納米粒，粒徑分布在100 nm，兩者測試結果基本保持一致.這表示通過主客體識別作用已構筑出形態(tài)尺寸穩(wěn)定的納米膠束.

2.4　DOX的體外藥物控釋行為

將鹽酸阿霉素標準溶液在λex=484 nm，λem=556 nm的條件下測試熒光，以吸光度對阿霉素的濃度進行線性回歸，得到標準曲線方程.

藥物分子DOX通過共價酰腙鍵與β-環(huán)糊精相連接，酰腙鍵具有pH敏感的特性，在酸性條件下，酰腙鍵發(fā)生水解.體外pH=5.0的藥控實驗中，53 h后，DOX的累計釋放率達到了76%，然而，在9 h內(nèi)，累計釋放率就已達到60%左右，相較pH=7.4的藥控實驗，50 h時，DOX的累計釋放率僅為31%(圖10)，充分說明酰腙鍵對酸性環(huán)境極為敏感，DOX的快速釋放是由酰腙鍵的水解引起的.腫瘤細胞內(nèi)酸性的內(nèi)涵體/溶酶體環(huán)境pH為5.0～5.5，而正常細胞和人體血液的pH為7.4，因此，有望實現(xiàn)藥物在腫瘤細胞的靶向釋放，從而降低藥物的毒副作用.

圖8　CD-DOX/Azo-PDMA超分子聚合物的2D 1H NMR NOESY譜圖

(a)TEM圖

(b)DLS圖圖9　CD-DOX/Azo-PDMA超分子聚合物的TEM和DLS圖

圖10　CD-DOX /Azo-PDMA超分子聚合物在pH 5.0和pH 7.4磷酸鹽緩沖液中DOX的累計釋放率

3　結論

本文通過主客體識別作用構筑了基于環(huán)糊精前藥分子和偶氮苯封端聚合物的聚合物前藥膠束.測試結果表明聚合物前藥膠束為具有合適尺度的納米組裝體.納米膠束通過化學鍵合的方式負載藥物分子，提高了藥物的穩(wěn)定包載，而由于膠束中存在對pH敏感的酰腙鍵，因此超分子聚合物膠束在較低pH下可實現(xiàn)酰腙鍵的斷裂，從而有效還原釋放出藥物分子DOX.此類pH敏感型超分子聚合物-前藥納米膠束的制備在腫瘤的靶向治療方面有著潛在的應用價值.