呂嘉櫪， 孟雁南， 史朝燁， 羅　瀟

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安　710021)

0　引言

金花菌是產(chǎn)生有性型，即子囊孢子階段和無性型，即分生孢子階段的多型真菌[1,2]，是茯磚茶中的優(yōu)勢菌群，能在茯磚茶內(nèi)部產(chǎn)生大量肉眼可見的金黃色顆粒[3]，是該菌在茯磚茶中產(chǎn)生的有性閉囊殼，俗稱金花，對茯磚茶風(fēng)味的形成具有重要作用[4]，金花菌的數(shù)量也是衡量茯磚茶品質(zhì)的重要依據(jù).

自1990年齊祖同將冠突散囊菌正式命名后[1]，研究者對不同茯磚茶來源的“金花菌”進(jìn)行了分類鑒定.黃浩等[5,6]根據(jù)菌落菌體形態(tài)特征和ITS序列分析將散茶發(fā)花中金花菌鑒定為冠突散囊菌(Eurotiumcristatum)，無性型為針刺曲霉(AspergillusspiculosusBlaser).

而近年來的研究發(fā)現(xiàn)，茯磚茶中的金花菌具有多樣性[7]，是由一群形態(tài)特征相似、生理生化相近的菌群組成.胡治遠(yuǎn)等[8]對湖南地區(qū)茯磚茶樣中的金花菌進(jìn)行分離鑒定發(fā)現(xiàn)其中金花菌有冠突散囊菌、謝瓦散囊菌、肋狀散囊菌、阿姆斯特丹散囊菌和蠟葉散囊菌，之后又首次提出茯磚茶中的冠突散囊菌具有遺傳多樣性[9]；隨后，王晗等[10]對散囊菌的NRPS保守基因進(jìn)行聚類研究分析時發(fā)現(xiàn)不同冠突散囊菌中的NRPS基因分布和基因數(shù)呈現(xiàn)出比較多樣的變化，進(jìn)一步說明了冠突散囊菌具有遺傳差異；王文濤等[11]認(rèn)為散囊菌形態(tài)上的較大差異可能是由ITS序列變化引起，也有可能是由NRPS基因引起.

早期對茯磚茶中金花菌的鑒定主要是通過比較子囊孢子和分生孢子的特征，但金花菌的形態(tài)特征復(fù)雜，不同種之間僅有微小的差別，很難根據(jù)形態(tài)差異將茯磚茶中的金花菌鑒定至種.本研究擬通過對茯磚茶中分離得到的金花菌進(jìn)行ITS序列特性分析，為茯磚茶中金花菌的鑒定提供一定理論依據(jù).

1　材料與方法

1.1　實(shí)驗(yàn)菌種

M1：冠突散囊菌(Eurotiumcristatum) CICC2 650，購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；

M2～M7：由陜西科技大學(xué)微生物研究室從陜西所產(chǎn)茯磚茶中分離純化得到.

1.2　主要培養(yǎng)基組成

改良察氏培養(yǎng)基(CZG)：蔗糖 4.0 g，NaCl 5.0 g，K2HPO40.1 g，NH4NO30.3 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，瓊脂 2.0 g，水 100 mL ，于 121 ℃、1×105Pa 滅菌鍋中滅菌 30 min.

1.3　儀器與設(shè)備

3730XL測序儀，Applied Biosystems；2720 thermal cycler型PCR儀，Applied Biosystems；5810R板式離心機(jī)，Eppendorf；JY04S-3C凝膠成像裝置，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；JY300C Power Supply電泳儀，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司.

1.4　實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1菌株的菌落形態(tài)觀察

將保存在斜面管中的7株菌株活化24 h，分別接種于CZG培養(yǎng)基，置于28 ℃下培養(yǎng)，每天觀察和測量各菌株菌落形態(tài)、生長速度及菌落直徑.

1.4.2被檢菌株的預(yù)處理

用已滅過菌的接種鏟將CZG培養(yǎng)基上生長的“金花菌”菌絲體刮下，置于1.5 mL無菌離心管中待用.

1.4.3基因組DNA提取

采用擎科貨號為TSP101植物基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行金花菌DNA提取.具體方法如下：

取50 mg新鮮菌絲體置于無菌研缽中，加入液氮迅速將菌絲研磨成粉末；將研磨好的菌絲體迅速置于1.5 mL離心管中，加入400μL GP1緩沖液，渦旋振蕩1 min，65 ℃水浴10 ～ 30 min，水浴過程中每隔5 min取出顛倒混勻以充分裂解；加入150μL GP2緩沖液，渦旋振蕩1 min，冰浴5 min，12 000 rpm離心 5 min；將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入上清等體積的無水乙醇，立即充分振蕩混勻，液體全部轉(zhuǎn)入吸附柱中，12 000 rpm離心30 s，棄廢液；向吸附柱中加入500μL 緩沖液PW， 12 000 rpm離心30 s，棄廢液，將吸附柱放入收集管中；向吸附柱中加入500μL 漂洗液，12 000 rpm離心30 s，棄廢液，將吸附柱放入收集管中；重復(fù)兩次后將吸附柱放回收集管中，12 000 rpm離心2 min，棄廢液后將吸附柱在室溫條件下放置5～10 min，徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液；取出核酸純化柱，放入一個干凈的離心管中，在吸附膜的中央處加入65 ℃預(yù)熱的TE緩沖液100μL，室溫放置2～5 min，使DNA盡可能多得被洗脫，12 000 rpm離心2 min，將溶液收集到離心管中，-20 ℃保存.

1.4.4PCR擴(kuò)增

采用真菌核糖體基因通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)為引物，使用2×TsingKEMasterMix(CodeNo.：TSE003)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時以dH2O做負(fù)對照.反應(yīng)體系如表1所示.

表1　PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系

擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)30次，最后72 ℃延伸10 min后得PCR產(chǎn)物，擴(kuò)增成功的PCR產(chǎn)物，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收.

1.4.5PCR產(chǎn)物純化

PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，電壓160 V，上樣2μL，采用溴化乙錠(EB)染色，凝膠成像儀中采集圖像，圖像必須保證條帶清晰.之后將擴(kuò)增成功的PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列分析.

1.4.6序列測定

采用BigDyeTerminator v3.1試劑盒進(jìn)行一代測序反應(yīng)及純化，反應(yīng)體系如表2所示.

表2　測序反應(yīng)體系

測序PCR熱循環(huán)條件為：96 ℃，2 min→(96 ℃，10 sec→50 ℃，10 sec→60 ℃，3 min)×30 cylce→4 ℃保溫.之后使用3730XL測序儀測定序列并收集測定數(shù)據(jù).

1.4.7系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

將所測得的序列提交到NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性比對，將同源性較高的序列利用生物分析軟件Mega對序列進(jìn)行分析，并構(gòu)建序列系統(tǒng)發(fā)育樹.

2　結(jié)果與討論

2.1　菌落形態(tài)特征

7株菌的菌落形態(tài)特征如圖1所示.對7株菌的形態(tài)學(xué)進(jìn)行鑒定時發(fā)現(xiàn)，7株菌在菌落形態(tài)上差異明顯， M2和M5菌株產(chǎn)生灰綠色分生孢子較多，無性繁殖特征較易出現(xiàn)，但M5在培養(yǎng)過程中菌落大小變化不大，菌落背面有褶皺；其余五株菌較易產(chǎn)生金黃色閉囊殼，M3、M4、M7與標(biāo)準(zhǔn)菌株M1形態(tài)學(xué)相似，在培養(yǎng)過程中菌落顏色加深，由淺黃色逐漸變?yōu)槌燃t色，而M6菌落顏色一直為橄欖黃色.

根據(jù)《中國真菌志》[12]，并結(jié)合形態(tài)學(xué)將M2、M5初步鑒定為謝瓦曲霉(Aspergilluschevalieri)，M1、M3、M4、M7初步鑒定為冠突散囊菌(Eurotiumcristatum)，無性型為針刺曲霉(Aspergillusspiculosus)，M6初步鑒定為阿姆斯特丹曲霉(Aspergillusamstelodami).

圖1　7株菌的菌落形態(tài)特征

2.2　ITS區(qū)域的PCR擴(kuò)增

利用試劑盒法提取7株菌的DNA，將提取出的基因組DNA作為模板，以ITS1和ITS4作為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖2所示.由圖2可以看出，七株菌的PCR產(chǎn)物始終只有一條條帶出現(xiàn)，且位于同一水平線上，無拖尾現(xiàn)象出現(xiàn)，電泳條帶較為清晰明亮，易于判別，說明提取的DNA是目的條帶.所有的條帶都在500 bp左右，差異不大.

圖2　7株菌的ITS-PCR產(chǎn)物電泳圖

2.3　ITS序列分析

從茯磚茶中分離出的6株菌M2～M7的基因序列測定結(jié)果如下，6株菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌株M1的分子序列完全相同，從分子序列可以看出七株菌實(shí)屬同種.

M1-M7 ITS序列：

AGGATCATTACCGAGTGCGGGCCCTCTGGG

TCCAACCTCCCATCCGTGTCTATCTGTACC

CTGTTGCTTCGGCGTGGCCACGGCCCGCC

GGAGACTAACATTTGAACGCTGTCTGAAG

TTTGCAGTCTGAGTTTTTAGTTAAACAAT

CGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTT

GGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGA

AATGCGATAATTAATGTGAATTGCAGAAT

TCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCA

CATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCA

TGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTC

AAGCACGGCTTGTGTGTTGGGCTTCCGT

CCCTGGCAACGGGGACGGGCCCAAAAG

GCAGTGGCGGCACCATGTCTGGTCCTCG

AGCGTATGGGGCTTTGTCACCCGCTCC

CGTAGGTCCAGCTGGCAGCTAGCCTCGC

AACCAATCTTTTTAACCAGGTTGACCT

CGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACT

TAAGCAT

2.4　ITS序列比對結(jié)果分析

將所測得的基因序列通過對18S rDNA ITS區(qū)域測序并在美國國家生物技術(shù)信息中心(National center ofbiotecllIlology infomation，NCBI)比對鑒定ITS區(qū)域，測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Nucleotide blast比對及同源性搜索，菌株M1～M7 ITS片段為518 bp，與數(shù)據(jù)庫中針刺曲霉、阿姆斯特丹曲霉、謝瓦曲霉ITS序列相似度均達(dá)到99.99%，比較結(jié)果如表3所示.

表3　ITS序列比對結(jié)果

由表3可以看出，陜西茯磚茶中的金花菌可能為針刺曲霉、阿姆斯特丹曲霉、謝瓦曲霉中的一種.以ITS序列對金花菌進(jìn)行分離鑒定具有很大的不確定性，只能通過ITS將茯磚茶中的金花菌鑒定為曲霉屬，具體是哪個種，還需進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定.趙仁亮等[13]基于rDNA-ITS序列對茯磚茶中分離金花菌進(jìn)行鑒定時也發(fā)現(xiàn)分離到的金花菌與屬內(nèi)多個種的同源性均在99%以上.郭鵬豪等[14]研究發(fā)現(xiàn)阿姆斯特丹散囊菌和冠突散囊菌由于ITS序列的高度同源性無法區(qū)分鑒定到種.

2.5　ITS聚類分析

綜合同源性比對結(jié)果，選擇已知分類地位的菌株，并以橘青霉(Penicilliumcitrinum)、黑曲霉(Aspergillusniger)作為外源群，應(yīng)用MEGA5軟件中Phylogeny程序繪制系統(tǒng)發(fā)育樹圖.由圖3可知，與7株“金花”菌同源性最高的已知分類地位的菌株為曲霉屬.且7株菌與已知分類地位的不同種菌均聚為一枝，因此，由構(gòu)建的整個系統(tǒng)發(fā)育樹分析，從茯磚茶樣中分離獲得的7株“金花”菌均屬于曲霉屬曲霉組，即散囊菌屬.

圖3　7株“金花”菌基于ITS基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

由此也可說明，雖然ITS區(qū)域因其“種內(nèi)保守，種間變異”的特征而廣泛應(yīng)用于真菌分類鑒定[15]，但其鑒定能力在不同種屬間是存在差異的.Stephen W.Peterson[16]根據(jù)形態(tài)學(xué)特征將13個曲霉屬下種進(jìn)行鑒定后，利用ITS序列及MLST對其進(jìn)一步鑒定發(fā)現(xiàn)：曲霉屬真菌的ITS序列并不總是唯一識別屬種，有的不同種曲霉ITS序列相同，而有的同種曲霉卻具有多種ITS基因型，但其MLST基因型在種間不重疊，可將13個曲霉鑒定至種；何亞濤等[17]基于NCBI單基因ITS序列在屬一級水平對散囊菌目系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)行了較為全面的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)單基因 ITS序列的分析結(jié)果與散囊菌目的4個科的分類結(jié)果并不完全一致；李穎等[18]研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)對曲霉的種水平鑒定率要低于形態(tài)學(xué)方法，只能鑒定到曲霉屬或曲霉某種，絕大多數(shù)無法鑒定菌株.

3　結(jié)論

本研究從陜西茯磚茶中分離得到的6株菌在形態(tài)上差異較為明顯，且3株菌與冠突散囊菌標(biāo)準(zhǔn)菌株形態(tài)一致，根據(jù)《中國真菌志》，并結(jié)合形態(tài)學(xué)，初步將M2、M5鑒定為謝瓦曲霉，M1、M3、M4、M7鑒定為針刺曲霉，M6鑒定為阿姆斯特丹曲霉.7株菌PCR產(chǎn)物的電泳條帶均處于同一水平線上，分子量大小均為500 bp，差異不大，且7株菌的ITS序列一致，與NCBI中Aspergillusspiculosus、Aspergillusamstelodami、Aspergilluschevalieri的同源性均較高，根據(jù)分子生物學(xué)和形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，陜西茯磚茶中分離得到的6株菌可能為針刺曲霉、阿姆斯特丹曲霉、謝瓦曲霉的一種.由此可以看出，ITS序列對金花菌進(jìn)行分離鑒定與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果較為一致，但只能通過ITS將茯磚茶中的金花菌鑒定為曲霉屬，在屬以下的種分辨率不高.

綜上所述，茯磚茶中的金花菌在形態(tài)學(xué)方面差異較大，但經(jīng)ITS序列分析之后發(fā)現(xiàn)其實(shí)屬同一種，故而判斷：

(1)盡管不同來源的“金花”菌最終被鑒定為同種，但其形態(tài)特征還是存在差異，可能茯磚茶中的金花菌存在亞種或變種；

(2)散囊菌屬真菌中rDNA基因的ITS1和ITS4保守區(qū)可用于區(qū)分屬間以及部分種間差別，而不能很好地反映菌株乃至某些菌種之間的遺傳多樣性.若需進(jìn)一步得到種水平信息，則應(yīng)結(jié)合分辨能力更高的基因進(jìn)一步鑒定，如可選擇轉(zhuǎn)錄組水平的β-微管蛋白基因、鈣調(diào)節(jié)蛋白基因等，或者可以進(jìn)行多基因系統(tǒng)發(fā)育分析或全基因分析.