劉洪磊,張雅芬,余佳佳,葉子弘

(中國(guó)計(jì)量大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,浙江省生物計(jì)量及檢驗(yàn)檢疫技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江 杭州 310018)

茭白(ZizanialatffoliaTurez.)又稱(chēng)“菰”,是長(zhǎng)江中下游地區(qū)重要經(jīng)濟(jì)作物,也是我國(guó)第二大水生蔬菜.余永年認(rèn)為是菰黑粉菌侵入茭白植株,誘使植株產(chǎn)生大量吲哚乙酸,從而刺激茭白基部膨大形成了肉質(zhì)鮮美的可食用茭白[1].在正常茭白中,菰黑粉菌多以菌絲形態(tài)存在,稱(chēng)為MT型,而在灰茭中,菰黑粉菌在侵染早期即形成大量肉眼可見(jiàn)的褐色冬孢子堆,稱(chēng)為T(mén)型[2].對(duì)茭白不同生長(zhǎng)階段的組織中菰黑粉菌的分布進(jìn)行顯微觀察,發(fā)現(xiàn)在茭白膨大初期,菌絲急劇生長(zhǎng)[3-4].所以,菰黑粉菌菌量的迅速累積和雙核菌絲的生長(zhǎng)可能是茭白植株孕茭的重要原因.

研究表明,黑粉菌的菌絲生長(zhǎng)及增殖與其二型態(tài)轉(zhuǎn)變密切相關(guān),主要受環(huán)磷酸腺苷/蛋白激酶A(cAMP/PKA)信號(hào)途徑來(lái)調(diào)控其極性生長(zhǎng),并通過(guò)絲裂原活化蛋白激酶MAPK(mitogen activated protein kinase)信號(hào)途徑控制細(xì)胞延伸過(guò)程,共同作用于細(xì)胞融合及菌絲生長(zhǎng),從而實(shí)現(xiàn)侵染和擴(kuò)散[5].在菰黑粉菌近緣真菌玉米瘤黑粉菌中,a信息素信號(hào)和受體通過(guò)cAMP和MAPK信號(hào)途徑影響性親和單倍體菌株融合形成雙核菌絲,從而影響致病性[6-7].研究表明,玉米瘤黑粉菌缺失Rak1后,其接合管形成能力減弱,細(xì)胞融合形成雙核菌絲概率大大降低[8];當(dāng)MAPK信號(hào)途徑被激活或加入一定濃度的外源cAMP,Rak1缺失的性親和菌株的接合管形成能力恢復(fù)[8].因此Rak1可能參與激活cAMP/PKA和MAPK信號(hào)途徑,從而參與調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、融合[8].進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),Rak1可能是prf1激活子rop1的調(diào)節(jié)因子,從而實(shí)現(xiàn)信息素和信息素受體基因表達(dá)的調(diào)控[8].

WD-重復(fù)蛋白是一個(gè)含有多個(gè)高度保守的GH(glycine-histidine)和WD(tryptophan-aspartic acid)序列的蛋白家族,保守結(jié)構(gòu)域由40個(gè)左右的氨基酸殘基組成.該蛋白家族由許多結(jié)構(gòu)相關(guān)、功能不同的調(diào)控蛋白組成,在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白運(yùn)輸和RNA加工等過(guò)程中具有重要作用[9].實(shí)驗(yàn)室前期分別從龍茭2號(hào)正常茭和灰茭中分離出MT型和T型菰黑粉菌,本研究以此為研究材料,通過(guò)菰黑粉菌基因組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn),菰黑粉菌存在一個(gè)具有7個(gè)WD40結(jié)構(gòu)域的基因,并經(jīng)PCR克隆后獲得了候選基因的基因組序列和CDS序列.經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析及對(duì)WD40保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行同源性比對(duì)分析,發(fā)現(xiàn)該候選基因與玉米瘤黑粉菌Rak1的同源性最高,故命名為UeRak1.MT型和T型菰黑粉菌融合生長(zhǎng)試驗(yàn)顯示:MT型在細(xì)胞融合及菌絲生長(zhǎng)能力上均弱于T型.熒光定量PCR檢測(cè)表明:在細(xì)胞融合時(shí)期及菌絲生長(zhǎng)初期UeRak1的表達(dá)量急劇上升,在菌絲大量生長(zhǎng)后UeRak1的表達(dá)量又有所下降,同時(shí)結(jié)果顯示,在細(xì)胞融合生長(zhǎng)過(guò)程中,T型菰黑粉菌中UeRak1的表達(dá)量是MT型的2倍以上.結(jié)合MT型較弱的細(xì)胞融合生長(zhǎng)能力,我們推測(cè)UeRak1基因與菰黑粉菌細(xì)胞融合和菌絲生長(zhǎng)有關(guān).該結(jié)果有助于深入研究菰黑粉菌的二型態(tài)轉(zhuǎn)化.

1　材料方法

1.1　菌株及培養(yǎng)條件

以分離自龍茭2號(hào)正常茭和灰茭的MT-1和T-1菌株為試驗(yàn)菌株,在YEPS培養(yǎng)基(酵母提取物10 g/L、蛋白胨20 g/L、蔗糖20 g/L,瓊脂糖15 g/L)中劃線培養(yǎng),培養(yǎng)溫度為28 ℃.

1.2　UeRak1基因的克隆及分析

將培養(yǎng)的菰黑粉菌在液氮中充分研磨,按照Trizol試劑說(shuō)明書(shū)提供的方法提取菰黑粉菌總RNA,采用PrimeScriptRT regent Kit With gDNAEraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成菰黑粉菌總RNA的cDNA第一鏈.根據(jù)已有基因組數(shù)據(jù)信息設(shè)計(jì)引物UeRak1-F1、UeRak1-R1(表1),通過(guò)普通PCR擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠回收獲得目標(biāo)片段.將目標(biāo)片段連接PMD19-T載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌,挑取轉(zhuǎn)化子送測(cè)序確認(rèn).通過(guò)NCBI的CDD數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)預(yù)測(cè)該序列結(jié)構(gòu).按照CTAB的方法提取菰黑粉菌DNA.再按照UeRak1基因序列設(shè)計(jì)特異引物UeRak1-F2、UeRak1-R2以菰黑粉菌基因組DNA為模板獲得UeRak1目的基因.

1.3　融合試驗(yàn)

將固體培養(yǎng)的菰黑粉菌接種到Y(jié)EPS液體培養(yǎng)基,180 r/min、28 ℃培養(yǎng)至菌含量OD600為1.0左右.5 000 r/min離心5 min后收集菌體并以YEPS液體培養(yǎng)基稀釋成菌含量為2.0,分別將T-1型和MT-1型中的一對(duì)性親和菰黑粉菌1∶1混合后,滴加在YEPS固體培養(yǎng)基上,28 ℃培養(yǎng),此時(shí)為0 h.此后每隔12 h觀察取樣,至60 h.實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù).

1.4　熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)基因的相對(duì)表達(dá)量

將融合試驗(yàn)的樣本提取菰黑粉菌總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA,方法參考2.2.按照實(shí)時(shí)定量PCR的引物設(shè)計(jì)要求設(shè)計(jì)相關(guān)引物(表1).以菰黑粉菌β-actin基因作為內(nèi)參.qPCR采用20 μL體系,以SYBR Green為染料,使用StepOneTMReal-Time PCR System(ABI)進(jìn)行qPCR反應(yīng).PCR反應(yīng)體系為:10 μL SYBR Premix Ex TaqTM,0.5 μL Primer(10 μM),0.5 μL cDNA模板,加DEPC水至總體積為20 μL.反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 30 s;95 ℃ 30 s,54 ℃ 20 s,72 ℃30 s,循環(huán)40次,每個(gè)樣品做3管重復(fù).綜合考量標(biāo)準(zhǔn)曲線和Ct值,采用2-ΔΔCt法計(jì)算UeRak1基因的相對(duì)表達(dá)量.

表1　實(shí)驗(yàn)相關(guān)引物列表

2　結(jié)果與分析

2.1　菰黑粉菌UeRak1基因的克隆及序列分析

前期研究表明玉米瘤黑粉菌中存在一個(gè)含有WD40-重復(fù)序列的蛋白R(shí)ak1,在細(xì)胞融合和生長(zhǎng)中起著重要作用.近期,我們完成了菰黑粉菌的基因組測(cè)序工作,在分析過(guò)程中預(yù)測(cè)菰黑粉菌中可能也存在一個(gè)編碼WD40-重復(fù)蛋白的基因.如圖1，根據(jù)基因組預(yù)測(cè)序列我們?cè)O(shè)計(jì)了特異性引物UeRak1-F1、UeRak1-R1,擴(kuò)增得到菰黑粉菌中一段2 388 bp左右的基因組序列,確認(rèn)了基因組中存在該預(yù)測(cè)序列.接下來(lái),我們根據(jù)基因片段測(cè)序結(jié)果和結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)設(shè)計(jì)開(kāi)放閱讀框引物Uegpa3-F2和Uegpa3-R2對(duì)基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增,克隆得到1 994 bp的基因組序列,以引物Uegpa3-F2和Uegpa3-R2對(duì)cDNA進(jìn)行擴(kuò)增,獲得1 020 bp的CDS序列,經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證,CDD數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)確認(rèn)為完整序列.將基因組序列和CDS序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn),該基因存在1個(gè)大小為974 bp的內(nèi)含子.

1—2388 bp長(zhǎng)度的基因組DNA擴(kuò)增片段;2—完整的UeRak1基因序列,1 994 bp長(zhǎng)度的基因組DNA擴(kuò)增片段;3—1 020 bp長(zhǎng)度的cDNA擴(kuò)增片段.M-DNA Maker (DL2000 DNA Maker, Takara);箭頭所指的都是測(cè)序的條帶.圖1　UeRak1cDNA和基因組片段擴(kuò)增瓊脂凝膠電泳Figure 1　Agarose gel electrophoresis of the UeRak1 cDNA and genomic fragments

經(jīng)ExPasy(https://web.expasy.org/compute_pi/)預(yù)測(cè),該基因編碼339個(gè)氨基酸,蛋白相對(duì)分子質(zhì)量約為37.47 kDa,理論等電點(diǎn)為6.38.通過(guò)NCBI中的BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn),該基因編碼的蛋白與其他真菌中的Gβ亞基及其相似結(jié)構(gòu)的同源性極高,尤其是玉米黑粉菌的Rak1蛋白,因此我們將該基因命名為UeRak1(GenBank登錄號(hào)KT343767).

2.2　UeRak1蛋白結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)發(fā)育分析

通過(guò)對(duì)UeRak1蛋白保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)分析,結(jié)果表明該蛋白具有典型的WD40-重復(fù)結(jié)構(gòu)域(7個(gè)WD40重復(fù)序列)和精氨酸-HDAC-超家族結(jié)構(gòu)域(圖2),與G蛋白β亞基物同源.很多真核蛋白都具有WD40結(jié)構(gòu)域,該結(jié)構(gòu)域含有7個(gè)葉狀的β螺旋結(jié)構(gòu),在生命過(guò)程中起著重要的作用,例如RACK1是哺乳類(lèi)細(xì)胞中普遍存在的一種骨架蛋白,是蛋白激酶C受體,也存在保守的WD40結(jié)構(gòu)域,該β-螺旋槳結(jié)構(gòu)的支架蛋白具有整合不同信號(hào)通路集成輸出的作用,并通過(guò)調(diào)控核糖體的聚集來(lái)影響蛋白翻譯過(guò)程[9-11].在真菌中也存在RACK1同源物,比如粟酒裂殖酵母中的CPC2[12](SchizosaccharomycespombeCAB11079.1)、釀酒酵母中的ASC1[13](SaccharomycescerevisiaeAJT01249.1)和玉米瘤黑粉菌中的Rak1蛋白[8](UstilagomaydisXP_011388829.1),已有研究表明,它們不僅與真菌的有性生殖有關(guān),與真菌的菌絲生長(zhǎng)和致病性等也存在密切的聯(lián)系.精氨酸-HDAC-超家族則在不同細(xì)胞生命過(guò)程中起著重要作用,包括細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等.基于此,我們將該氨基酸序列與其它真菌中Gβ亞基、Gβ亞基同源物RACK1及RACK1同源物CPC2、ASC1和Rak1的氨基酸序列通過(guò)MEGA6軟件采用近鄰法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),結(jié)果發(fā)現(xiàn)菰黑粉菌中UeRak1蛋白與玉米絲黑穗病菌(SporisoriumreilianumSRZ2 CBQ71151.1)、賓地瘤黑粉菌(Melanopsichiumpennsylvanicum4 CDI55376.1)、擔(dān)子類(lèi)酵母菌(PseudozymabrasiliensisEST05924.1)和大麥堅(jiān)黑粉菌(UstilagohordeiCCF48119.1)中的CPC2蛋白及玉米瘤黑粉菌中的Rak1蛋白聚為一個(gè)分支,說(shuō)明與其親緣關(guān)系最近.而與釀酒酵母、粟酒裂殖酵母、花藥黑粉菌(MicrobotryumviolaceumKDE05309.1)等真菌中的Gβ蛋白或Gβ亞基同源CPC2及果蠅(DrosophilayakubaXP_002087998.1)和人(HomosapiensNP_006089)中的具有WD40結(jié)構(gòu)域的RACK1蛋白的親緣性較遠(yuǎn)(圖3).進(jìn)一步通過(guò)DNAMAN軟件對(duì)菰黑粉菌及與其親緣關(guān)系較近的四種真菌中的Gβ同源物CPC2和Rak1氨基酸序列中保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行比對(duì)分析,如圖4結(jié)果顯示:WD40重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域(7-309)在不同真菌中的保守性極高,相似度也較高,僅少數(shù)幾個(gè)位點(diǎn)的氨基酸不同,表明菰黑粉菌中該蛋白可能也參與真菌的菌絲生長(zhǎng)、致病性和有性生殖的過(guò)程.

圖2　UeRak1保守結(jié)構(gòu)域示意圖Figure 2　The blast result of conserved domain in UeRak1

圖3　UeRak1系統(tǒng)進(jìn)化分析Figure 3　Phylogenetic analysis of UeRak1

圖4　UeRak1與其它真菌中的WD40結(jié)構(gòu)域多序列比對(duì)Figure 4　Putative amino sequence alignment with the WD40 domain of UeRak1 with its homologs

2.3　UeRak1基因與菌絲的形成有關(guān)

A-0 h;B-12 h;C-24h;D-36 h圖5　不同培養(yǎng)時(shí)間下菰黑粉菌中UeRak1基因的差異表達(dá)分析Figure 5　Differential expression analysis of UeRak1 gene during different growth time

前期研究發(fā)現(xiàn),MT型和T型菰黑粉菌在細(xì)胞體外融合生長(zhǎng)中存在差異性,表現(xiàn)為在同等試驗(yàn)條件下,MT型的細(xì)胞融合生長(zhǎng)更少更慢，如圖5.本研究選取了分別分分離自正常茭的MT-1和灰茭T-1中的一對(duì)性親和單倍體菌株,在融合試驗(yàn)前單倍體菌株呈酵母形態(tài),(圖6A,0 h),后期細(xì)胞開(kāi)始融合(圖6B,12 h),后形成雙核菌絲(圖6C,24 h),最后菌轉(zhuǎn)為菌絲型生長(zhǎng),形成白色氣生菌絲(圖6D,36 h).運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR,分別在0、12、24、36、48、60、h檢測(cè)UeRak1的表達(dá)變化情況,如圖5.結(jié)果顯示:菰黑粉菌MT-1和T-1中UeRak1的表達(dá)趨勢(shì)基本沒(méi)有差別;在細(xì)胞融合生長(zhǎng)期(0-24 h,圖6B,C),UeRak1的表達(dá)量急劇升高;當(dāng)融合培養(yǎng)36 h后,氣生菌絲開(kāi)始生長(zhǎng)(圖6D),此時(shí)表達(dá)量開(kāi)始下降.而MT-1菌株中UeRak1基因的表達(dá)量均不到T-1菌株的一半.綜合分析不同培養(yǎng)時(shí)間和不同菌落形態(tài)下UeRak1基因的相對(duì)表達(dá)量差異,推測(cè)UeRak1基因與菰黑粉菌細(xì)胞融合和菌絲生長(zhǎng)具有緊密的聯(lián)系.

圖6　融合試驗(yàn)后菰黑粉菌細(xì)胞形態(tài)(上)和菌落型態(tài)圖(下)Figure 6　Morphology of cells and colonis after cell fusion of Ustilago esculenta

3　討　論

茭白是中國(guó)長(zhǎng)江流域及以南地區(qū)頗受喜愛(ài)的一種水生蔬菜,因其肉質(zhì)鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富、具有一定藥用價(jià)值,因此是我國(guó)南方一種重要的經(jīng)濟(jì)作物.前期眾多研究表明茭白植株中存在一種共生菌——菰黑粉菌,它參與茭白植株可食用肉質(zhì)莖的形成,研究發(fā)現(xiàn)在茭白膨大初期就可檢測(cè)到菌絲的存在,并隨著茭白的膨大形成菌絲簇[1,3].已有研究表明,真菌的致病性與它的菌絲的生長(zhǎng)狀態(tài)有著密切得聯(lián)系,如釀酒酵母與玉米瘤黑粉菌[13-14],所以研究菰黑粉菌從酵母型向菌絲型的轉(zhuǎn)變過(guò)程對(duì)闡明菰黑粉菌侵染茭白植株的意義重大.大量研究表明,菰黑粉菌與玉米瘤黑粉菌親緣關(guān)系較近,在玉米瘤黑粉菌的酵母型向菌絲型完成轉(zhuǎn)變后,可以侵入植株并通過(guò)吸收宿主的養(yǎng)分來(lái)完成有性生殖過(guò)程,且在該過(guò)程中MAPK和cAMP/PKA信號(hào)途徑具有重要的調(diào)節(jié)作用[6-7].在玉米瘤黑粉菌中發(fā)現(xiàn),Rak1作為MAPK和cAMP/PKA信號(hào)途徑的附加組件,參與細(xì)胞融合生長(zhǎng)和致病性過(guò)程[8].本文第一次克隆到了菰黑粉菌Rak1同源基因UeRak1;結(jié)構(gòu)分析表明UeRak1具有7個(gè)重復(fù)的WD40結(jié)構(gòu)域,是CPC2/ASC1的同源物;表達(dá)分析顯示,UeRak1可能參與菰黑粉菌從酵母型向菌絲型轉(zhuǎn)變的過(guò)程.

本研究基于全基因組測(cè)序結(jié)果成功擴(kuò)增出一段2388 bp序列,豐富了菰黑粉菌基因庫(kù).經(jīng)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)UeRak1與其它真菌中的WD40-重復(fù)蛋白具有極高的相似度,且WD40結(jié)構(gòu)域同源性在96%以上(圖4),表明該基因在物種間相對(duì)比較保守,與已有研究結(jié)果類(lèi)似,即WD-重復(fù)蛋白是一個(gè)具有高度保守的WD序列但是功能各異的蛋白大家族.而且雖然已經(jīng)克隆出很多編碼WD-重復(fù)蛋白的基因,但是大部分WD-重復(fù)蛋白的功能和調(diào)控機(jī)理都還不清楚.對(duì)菰黑粉菌中該基因的克隆鑒定及后續(xù)的功能研究,不但能更好地了解該基因在菰黑粉菌中的作用,也能更好地了解和掌握WD-重復(fù)蛋白家族的性質(zhì)和功能.

在菰黑粉菌融合試驗(yàn)中,0～24 h為性親和單倍體細(xì)胞融合生長(zhǎng)的時(shí)間段,培養(yǎng)36 h后開(kāi)始有較明顯的菌絲生長(zhǎng),而MT-1型菰黑粉菌融合生長(zhǎng)的細(xì)胞數(shù)量及菌絲生長(zhǎng)速度均少于T-1型(圖6).實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示UeRak1在12 h和24 h時(shí)表達(dá)量最高,之后就開(kāi)始下降(圖5).與其生長(zhǎng)狀態(tài)比對(duì)后,我們推測(cè)UeRak1是細(xì)胞融合生長(zhǎng)所必須的.

在玉米瘤黑粉菌中,cAMP/PKA和MAPK信號(hào)途徑分別參與調(diào)控真菌的芽殖和細(xì)胞延伸過(guò)程,兩個(gè)信號(hào)途徑協(xié)同調(diào)控a、b基因及prf1,從而調(diào)控真菌的融合生長(zhǎng)及致病性[15-17].其中,具有7個(gè)WD40重復(fù)序列保守域的Rak1蛋白缺失菌株中,prf1、a基因的表達(dá)量下調(diào)[8].本研究克隆得到的UeRak1基因與玉米瘤黑粉菌具有92%的相似度,它們的WD40保守序列具有99.7%的相似度(圖4),說(shuō)明UeRak1與Rak1極有可能具有相似的功能.熒光定量PCR的研究結(jié)果也表明UeRak1基因可能參與菰黑粉菌酵母型向菌絲型轉(zhuǎn)變的過(guò)程.該研究結(jié)果預(yù)示著UeRak1蛋白可能參與菰黑粉菌的細(xì)胞融合生長(zhǎng)等過(guò)程.因此,有必要進(jìn)一步對(duì)UeRak1與cAMP/PKA和MAPK信號(hào)途徑的聯(lián)系進(jìn)行研究,進(jìn)而闡述UeRak1基因在菰黑粉菌菌絲融合生長(zhǎng)及致病性中的作用及其機(jī)制.