徐　峰,凌淑萍,王全勝,付　巖,吳銀良,葉子弘

(1.中國計量大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 浙江省生物計量及檢驗檢疫技術(shù)重點實驗室,浙江 杭州 310018; 2.寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,浙江 寧波 315040)

豬鏈球菌是一種具有嚴(yán)重危害性質(zhì)的人獸共患病病原體,其中以豬鏈球菌2型(Streptococcussuistype 2, SS2)的致病性最大,我國把它列為二類動物疫病,嚴(yán)重影響我國養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展和人及其他動物的健康.研究表明,SS2可引發(fā)豬的腦膜炎、心內(nèi)膜炎、關(guān)節(jié)炎、肺炎、敗血癥等,各年齡段的豬均可感染豬鏈球菌.同時,該菌還可感染養(yǎng)豬相關(guān)的從業(yè)人員,引起細(xì)菌性敗血癥、休克、腦膜炎、永久性的聽力喪失,嚴(yán)重者甚至死亡[1].1968年丹麥學(xué)者首次報道了3例感染導(dǎo)致腦膜炎并發(fā)敗血癥病例;1975年荷蘭也出現(xiàn)了散發(fā)病例;在我國,人感染豬鏈球菌曾經(jīng)在江蘇省和四川省發(fā)生,1998年江蘇省發(fā)病25例,死亡14例;2005年6月至8月,四川省爆發(fā)疫情,發(fā)病204例,死亡38例,為國內(nèi)外迄今為止見于報道的最大規(guī)模人感染豬鏈球菌病疫情[2].截至2000年,全球已報道了200多例,且多發(fā)的國家和地區(qū)普遍養(yǎng)殖業(yè)發(fā)達(dá).人感染SS2主要是以豬傳染人的方式傳播,還未見人傳染人的報道.SS2在很多國家受到廣泛重視,其研究集中在毒力相關(guān)因子(virulence correlated facters, VAFs),研究表明VAFs與豬鏈球菌引起的病癥密切相關(guān)[3-4].莢膜多糖(CPS)是目前已確定的豬鏈球菌2型主要的毒力相關(guān)因子,具有抗吞噬的作用[5-6],因其具有很高的種特異性,因此csp2j常被作為檢測豬鏈球菌2型的靶基因[7].研究認(rèn)為,較為重要的豬鏈球菌毒力因子還有溶菌酶釋放相關(guān)蛋白(muramidase-released protein, MRP)和胞外因子(extracellular protein factor, EF).CPS、MRP和EF常用于評價豬鏈球菌毒力大小.目前檢測豬鏈球菌2型的方法有生化試驗、細(xì)菌培養(yǎng)、乳膠凝集試驗和qPCR等,相比于傳統(tǒng)的方法,qPCR方法能夠快速、準(zhǔn)確、靈敏地檢測目的基因,已被廣泛的應(yīng)用于豬鏈球菌病的檢測與診斷[5].

為了解寧波市養(yǎng)豬場、屠宰場和市場上的豬肉攜帶豬鏈球菌2型及相關(guān)毒力基因的情況,我們對該市的病豬咽喉拭子、死豬扁桃體、屠宰場和鮮肉市場上的樣本進(jìn)行系統(tǒng)檢測和分析,以期為有效開展防疫工作提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和實踐支撐.

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1樣品來源

2016年3月—12月分別從寧波海曙區(qū)一生豬養(yǎng)殖基地采集62份病豬咽喉拭子(有各種病癥反應(yīng)的豬)和65份死豬扁桃體.2015年12月到2016年11月在寧波寧海、北侖、慈溪等地采集屠宰場樣品100份(70份豬肉和30份豬肝),在寧波市各超市和菜場采集豬肉樣品24份.

1.1.2主要試劑

腦心浸液肉湯、萘啶酮酸、多粘菌素購自青島海博生物技術(shù)有限公司.Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒和蛋白酶K購自上海生工,Premix Ex TaqTM試劑盒購自TaKaRa,溶菌酶購自BIOSHARP.豬鏈球菌2型選擇性培養(yǎng)基以心腦浸液為基礎(chǔ),滅菌后冷卻到室溫并添加萘啶酮酸和多粘菌素至質(zhì)量濃度分別為30 μg/mL和15 μg/mL.

1.1.3主要儀器

SteponeplusTM定量PCR儀(ABI).

1.2　引物和TaqMan探針

根據(jù)GenBank公布的豬鏈球菌2型菌種鑒定基因cps2j(Accession Number: JX986792.1)、毒力因子基因mrp(Accession Number: X64450.1)、ef(Accession Number: JF813371.1)的參考序列設(shè)計引物和探針.探針的5′端分別標(biāo)記FAM,FAM,HEX;3′端標(biāo)記BHQ1.使用Beacon Designer 7設(shè)計引物,引物和探針均交由Life公司合成.表1為引物和探針序列.

表1　引物和探針序列

1.3　方法

1.3.1樣品采集與增菌

將拭子伸入病豬咽喉部涂抹,立即放入注有選擇性培養(yǎng)基的無菌拭子管子中,帶回實驗室并于37 ℃培養(yǎng)過夜.采集豬扁桃體、鮮肉、肝臟等放入無菌樣品袋中帶回實驗室,取一個扁桃體,或10 g其他組織,加入100 mL選擇性培養(yǎng)基,拍打均質(zhì)1 min后,37 ℃培養(yǎng)過夜.

1.3.2模板DNA的制備

吸取經(jīng)培養(yǎng)的菌液2 mL,按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒所列方法和步驟提取基因組DNA.制備好的模板經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳鑒定后,置于-20 ℃存放備用.

1.3.3熒光定量PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增反應(yīng)在Stepone Plus(ABI)上進(jìn)行,單熒光反應(yīng)體系(20 μL):Premix Ex TaqTM10 μL,10 μmol/L引物各0.4 μL,probe 0.8 μL,ROX Reference Dye(50×)0.4 μL,DNA模板2 μL,超純水6.0 μL;雙重?zé)晒夥磻?yīng)體系(20 μL):Premix Ex TaqTM10 μL,10 μmol/L引物1、引物2各0.4 μl,mrpprobe、efprobe各0.8 μL,ROX Reference Dye(50×)0.4 μL,DNA模板2 μL,超純水4.4 μL.反應(yīng)條件:95 ℃ 20 s;95 ℃ 1 s,60 ℃ 20 s,40個循環(huán),在每個循環(huán)的60 ℃收集熒光信號.

1.3.4結(jié)果判定

陰性對照無Ct值且無擴(kuò)增曲線,陽性對照的Ct≤30且有特定的擴(kuò)增曲線,如果陰性對照和陽性對照不滿足以上條件則此次實驗無效.無Ct值且無擴(kuò)增曲線判定為陰性;Ct<35且有特定的擴(kuò)增曲線判定為陽性;35≤Ct≤40判定為疑似,需要復(fù)檢,復(fù)檢結(jié)果無Ct值且無擴(kuò)增曲線判定為陰性,Ct≤40且有特定的擴(kuò)增曲線判定為陽性.

1.3.5統(tǒng)計學(xué)分析

統(tǒng)計各個樣本毒力因子基因的檢出情況,計算檢出率.不同來源,不同季度的樣本單一毒力因子檢出率進(jìn)行卡方檢驗,以P<0.05作為有統(tǒng)計學(xué)意義的判斷標(biāo)準(zhǔn).

2　結(jié)果與分析

2.1　不同樣本來源的豬鏈球菌2型毒力因子調(diào)查分析

通過熒光定量PCR技術(shù)對采集到的251份寧波市病死豬和健康豬樣本進(jìn)行檢測,結(jié)果見表2.從表中可知,豬鏈球菌2型廣泛存在于病死豬中.三種毒力因子cps2j、mrp、ef在病豬咽喉拭子中的檢出率最高,其次是死豬扁桃體.進(jìn)入市場銷售的屠宰場樣品、市場豬肉樣品中三種毒力因子的檢出率明顯低于前兩組,市場豬肉樣品中的檢出率最低.

病豬咽喉拭子樣本與死豬扁桃體樣本的三個毒力因子cps2j、mrp、ef、高致病性基因型cps2j+mrp+ef+的檢出率相關(guān)系數(shù)高達(dá)0.97,說明病豬感染豬鏈球菌2型和所攜帶的毒力情況可能是引起生豬死亡的一個重要的因素.同時攜帶cps2j+mrp+ef+三種毒力因子的高致病性菌株對人畜危害較大,致病風(fēng)險較大.病豬中攜帶的豬鏈球菌2型不僅比例高而且毒性大.高致病性菌株在病豬咽喉拭子的檢出率高達(dá)40.3%.

病豬樣品三種毒力因子的檢出率高于死豬樣品,可能是樣品的新鮮程度影響了檢測結(jié)果.病豬咽喉拭子樣本比死豬扁桃體樣本新鮮,菌量比死豬扁桃體高,活性也好,更容易增菌培養(yǎng).同時,死豬樣品放置時間較久,受其他腐生菌的影響,使得目標(biāo)菌量降低.但也有可能是病豬攜帶的毒力因子確實比死豬高,這批樣品豬的死亡還可能由于其他方面的疾病、暴力因素導(dǎo)致.

在屠宰場和鮮肉市場樣品中雖然有檢出了豬鏈球菌2型,但多數(shù)不含mrp和ef兩個毒力因子,是低風(fēng)險的菌株.屠宰場樣品中僅檢出一例cps2j+mrp+ef+高致病性菌株,所占比例為0.8%(1/124).菜市場和超市樣品中未檢出高毒性菌株.因此市民通過市場途徑感染高致病性豬鏈球菌2型的風(fēng)險比較小,但也不忽視相關(guān)從業(yè)人員在生豬屠宰運輸銷售過程中可能感染的風(fēng)險.

表2　不同樣本來源的豬鏈球菌2型毒力因子檢測結(jié)果

2.2　不同采集時間病、死豬樣本的豬鏈球菌2型及毒力因子調(diào)查分析

調(diào)查發(fā)現(xiàn),豬感染豬鏈球菌2型具有時節(jié)性.cps2j在病、死豬中的檢出情況大致相同,在各季度樣品中的檢出率均表現(xiàn)為第二季度>第一季度>第四季度>第三季度.但高致病性菌株檢出率在病、死豬中情況不同.病豬咽喉拭子中,各季度檢出率表現(xiàn)為第二季度與第三季度、第三季度與第四季度都有顯著性差異;在死豬扁桃體中豬鏈球菌2型的檢出率表現(xiàn)為第一季度與第三季度、第二季度與第三季度有顯著性差異(表3、表4).綜合病、死豬樣品中豬鏈球菌2型的檢出率與毒性大小表現(xiàn)可知,第二季度最容易感染豬鏈球菌2型,并且毒性較高,而第三季度感染率最低,而且所攜帶的多數(shù)是低毒性菌株.

表3　不同采集時間病豬咽喉拭子樣本的豬鏈球菌2型及毒力因子檢測結(jié)果

表4　不同采集時間死豬扁桃體樣本的豬鏈球菌2型及毒力因子檢測結(jié)果

由此可見,春末夏初和冬季是高毒性豬鏈球菌2型的高發(fā)期.春末夏初時節(jié),天氣濕熱,冷熱交替,豬更容易受到各種病毒與細(xì)菌的侵害.秋冬季天氣寒冷,豬舍溫度過低,豬不能有效抵御寒冷,抵抗力降低,寒冷的氣候可以一定程度上殺死各種細(xì)菌和病毒.

2.3　不同豬齡樣本的豬鏈球菌2型及毒力因子調(diào)查分析

日齡≤65 d的豬通常被歸為乳豬和保育豬,日齡>65 d為育肥豬.調(diào)查發(fā)現(xiàn),保育豬更容易受到高致病性豬鏈球菌2型的感染而致死.因為豬幼崽在此階段剛斷奶,各項機能尚未完善,自身主動免疫系統(tǒng)還未發(fā)育完全,對各種應(yīng)激的抵抗能力差,極易受到病源微生物的侵襲.

本實驗采集了不同日齡的豬樣本,結(jié)果表明生豬在任何階段都可能受到豬鏈球菌2型的感染,但不同日齡之間豬鏈球菌2型檢出率不同(表5).數(shù)據(jù)表明,在病、死豬樣品中,豬鏈球菌2型在保育豬的樣本中檢出率略高于育肥豬樣本的檢出率.毒力分析表明,mrp、ef兩個毒力因子在病豬中差異不大,但是在死豬樣品中,攜帶的毒力大小差異較大.mrp+在保育豬中的檢出率與育肥豬相比,差異顯著,說明死豬中保育豬感染高致病性菌株的情況比育肥豬更為嚴(yán)重.

表5　不同豬齡樣本的豬鏈球菌2型及毒力因子檢測結(jié)果

2.4　屠宰場和市場中豬鏈球菌2型及毒力因子的調(diào)查分析

124份寧波市各地區(qū)屠宰場和市場豬組織樣本中共檢出SS2陽性樣本11例,比例為8.9%,cps2j+mrp+ef+高致病性SS2陽性樣本1例,比例為0.8%.其他兩個毒力因子mrp、ef檢出率總計為2.4%、0.8%.在100份屠宰場樣品中,除寧海、北侖和慈溪的屠宰場有SS2的檢出外,其他地區(qū)均未檢出.24份鮮肉市場樣品中僅鄞州檢出2例SS2,但無高致病性基因型的SS2檢出.結(jié)果表明,進(jìn)入消費市場的豬攜帶高毒性SS2的概率很小,市民因購買和食用豬肉而感染高毒性SS2引起嚴(yán)重疾病的風(fēng)險很低.但一例高毒性陽性樣本的檢出提示著,不同產(chǎn)地的生豬在長途運輸中可能造成細(xì)菌的傳播和感染,且屠宰場的環(huán)境和刀具清潔不夠及時也容易造成豬肉的接觸污染.