陸曉鷗　宗興燕　王璐　陳宏泉

[摘要]目的通過對皮膚鱗狀細(xì)胞癌（cSCC）基因表達(dá)的數(shù)據(jù)分析找到異常表達(dá)的基因群，明確這些差異基因的功能、參與的信號傳導(dǎo)通路，并找出具有標(biāo)志性功能的樞紐基因，進(jìn)一步探討cSCC的分子機(jī)制。

方法從Gene Expression Omnibus（GEO）數(shù)據(jù)庫中下載GSE66359的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，對差異基因進(jìn)行基因本體論（GO）分析和基于京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫的通路分析（KEGG通路分析），并應(yīng)用Cytoscape軟件構(gòu)建差異基因產(chǎn)物的蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，篩選樞紐基因。

結(jié)果該cSCC基因芯片數(shù)據(jù)中共有894個差異基因，其中438個上調(diào)基因，456個下調(diào)基因。GO分析顯示上調(diào)基因主要富集的生物進(jìn)程為：有絲分裂細(xì)胞周期過程，染色體分離；下調(diào)基因：角質(zhì)形成細(xì)胞分化。KEGG分析顯示，上調(diào)基因主要富集的信號通路：DNA復(fù)制、細(xì)胞周期；下調(diào)基因：MAPK信號通路、Notch信號通路。通過構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)得到了前10位樞紐基因SHC1、AURKB、SMC4、PLK1、PCNA、PTTG1、BRCA1、MCM2、EphB2、HDAC，這些基因參與3條重要通路，包括細(xì)胞周期、DNA復(fù)制和蛋白酶體。

結(jié)論SHC1、AURKB、SMC4等基因的變異導(dǎo)致染色體、有絲分裂、細(xì)胞周期及MAPK、Notch信號通路的異?？赡軈⑴ccSCC的發(fā)生及進(jìn)展過程。

[關(guān)鍵詞]腫瘤，鱗狀細(xì)胞；皮膚；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；微陣列分析；生物標(biāo)志物

[中圖分類號]R751

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號] 20965532（2018）02021007

皮膚鱗狀細(xì)胞癌（cSCC）是發(fā)生于表皮上皮細(xì)胞的一種惡性腫瘤，其病因復(fù)雜，紫外線照射、熱輻射損傷、化學(xué)致癌物、病毒感染及某些慢性皮膚病等均是其致病因素。白種人cSCC是非黑色素性皮膚腫瘤中僅次于基底細(xì)胞癌（BCC）的第二大皮膚腫瘤，與BCC相比，cSCC具有更強(qiáng)的侵襲性、更高的復(fù)發(fā)率及轉(zhuǎn)移率，因而其危險性比BCC更大[1]。高天文等[2]研究顯示，國內(nèi)cSCC約占所有皮膚惡性腫瘤的29.4%，略高于BCC（28.0%），其中cSCC的確診病例數(shù)以每年2.6%的比例逐年上升。由于目前對cSCC發(fā)生的分子機(jī)制認(rèn)識不清，cSCC早期診斷及治療效果均不理想?；蛐酒且环N高通量基

2期

陸曉鷗，等. 皮膚鱗狀細(xì)胞癌的基因表達(dá)及信號傳導(dǎo)通路的生物信息學(xué)分析

211

因表達(dá)分析平臺，近年來在差異基因篩選、疾病與基因表達(dá)的關(guān)系、疾病的分子診斷、新藥開發(fā)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。在cSCC的研究中應(yīng)用基因芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)了成百上千個差異基因，也發(fā)現(xiàn)了其中部分基因在某些生物進(jìn)程中的作用。然而僅分析某個差異基因有其局限性，不能全面地分析差異基因間的相互作用，應(yīng)用基因芯片技術(shù)聯(lián)合生物信息學(xué)方法能夠更全面地分析cSCC中基因的差異性表達(dá)，充分挖掘原始研究中有價值的信息[3]。FARSHCHIAN等[4]收集了cSCC細(xì)胞樣本和正常表皮角質(zhì)形成細(xì)胞樣本進(jìn)行差異基因分析。本文研究從高通量基因表達(dá)（GEO）數(shù)據(jù)庫中下載其原始數(shù)據(jù)（GSE663

59）進(jìn)行分析，首先通過比較cSCC細(xì)胞和正常表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的基因表達(dá)譜篩選出差異基因，然后對差異基因進(jìn)行基因功能注釋分析和信號傳導(dǎo)通路富集分析，并找出具有高連通度的樞紐基因，進(jìn)而從分子水平研究cSCC的發(fā)生、進(jìn)展機(jī)制，為cSCC的診斷、靶向藥物研究及判斷預(yù)后提供有價值的信息。

1材料和方法

1.1基因芯片數(shù)據(jù)

從GEO數(shù)據(jù)庫中下載GSE66359數(shù)據(jù)，該研究是基于GPL570平臺（Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array）的芯片，由FARSHCHIAN等[4]發(fā)表。GSE66359數(shù)據(jù)集包含13個樣本，其中8個cSCC細(xì)胞樣本，5個正常人類表皮角質(zhì)形成細(xì)胞樣本。

1.2差異基因篩選

用GeneSpring軟件（version 14.8，Agilent，USA）對原始數(shù)據(jù)的TXT文件進(jìn)行分析，應(yīng)用分層聚類分析法將原始數(shù)據(jù)分為cSCC組和正常人類表皮組。使用GeneSpring軟件中的主要成分分析（PCA）控制探針質(zhì)量，探針強(qiáng)度值低于20%的數(shù)據(jù)被排除。用經(jīng)典t檢驗(yàn)篩選表達(dá)變化在2倍以上的差異基因，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.3差異基因的基因本體論（GO）分析和通路分析

GO分析是進(jìn)行基因和基因產(chǎn)物注釋及鑒別高通量基因組和轉(zhuǎn)錄組特有生物學(xué)屬性的常用方法。京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫（KEGG）可以對基因功能和有高位功能信息的相耦合基因組進(jìn)行系統(tǒng)分析。在DAVID數(shù)據(jù)庫中對基因進(jìn)行相關(guān)的生物學(xué)注釋是成功的高通量基因功能分析的關(guān)鍵基礎(chǔ)。本研究應(yīng)用DAVID中的在線工具對差異基因進(jìn)行GO分析和KEGG分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.4蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)整合及模塊分析

STRING數(shù)據(jù)庫是分析評價蛋白質(zhì)相互作用信息的在線工具，該數(shù)據(jù)庫涵蓋了來自于1 133種生物的5 214 234種蛋白。為評價差異基因編碼的蛋白質(zhì)間的相互作用關(guān)系，將篩選出的差異基因輸入到STRING中，只有實(shí)驗(yàn)證實(shí)的相互作用綜合得分>0.4的蛋白質(zhì)才被認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。用Cytoscape軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖，并用MCODE（molecular complex detection algorithm）插件進(jìn)行掃描，

有意義的PPI模塊篩選標(biāo)準(zhǔn)為：MCODE得分>3，網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)數(shù)>4。

對篩選出的模塊中的差異基因再進(jìn)行功能和通路富集分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1篩選差異表達(dá)基因

用GeneSpring軟件對FARSHCHIAN等[4]收集的8個疾病樣本和5個正常樣本原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以P<0.05、倍數(shù)變化（FC）>2.0為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異基因，共篩選出894個差異基因，其中上調(diào)基因438個，下調(diào)基因456個。前50位上調(diào)基因和下調(diào)基因用熱圖表示，見圖1。

2.2GO分析

GO分析顯示上調(diào)基因主要富集的生物進(jìn)程（BP）：有絲分裂細(xì)胞周期過程，染色體分離，有絲分裂核分裂；下調(diào)基因主要富集的BP：角質(zhì)形成細(xì)胞分化。上調(diào)基因主要富集的分子功能（MF）：DNA解旋酶活性，染色質(zhì)結(jié)合，DNA復(fù)制起始結(jié)合；下調(diào)基因主要富集的MF：MAP激酶酪氨酸/絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶活性，生長因子受體結(jié)合，MAP激酶磷酸酶活性。上調(diào)基因主要富集的細(xì)胞成分（CC）：染色體的一部分，核質(zhì)，稠密染色體；下調(diào)基因主要富集的CC：編碼角質(zhì)化包膜，胞外區(qū)，胞囊。見表1。

2.3KEGG信號通路分析

得到了上調(diào)基因和下調(diào)基因富集的主要信號通路，上調(diào)基因主要富集的信號通路包括DNA復(fù)制、細(xì)胞周期、錯配修復(fù)、蛋白酶體、Fanconi貧血通路；下調(diào)基因主要富集的信號通路包括MAPK信號通路、腹背軸的形成、Notch信號通路、精氨酸和脯氨酸代謝、軸突導(dǎo)向。見表2。

2.4蛋白質(zhì)PPI分析

基于STRING數(shù)據(jù)庫篩選出10個最具代表性的樞紐節(jié)點(diǎn)如下：Src homology 2 domaincontaining

3討論

cSCC具有轉(zhuǎn)移至人體任何器官的能力，從預(yù)后來講cSCC轉(zhuǎn)移是致命的。已有研究表明，轉(zhuǎn)移性cSCC致死率超過70%，因此對于轉(zhuǎn)移性cSCC的治療是困難的[5]。因此，cSCC發(fā)病的分子機(jī)制研究對其的診斷、治療及預(yù)后有非常重要的意義。本研究從GEO數(shù)據(jù)庫中下載了GSE66359數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)是基于對正常角質(zhì)形成細(xì)胞和cSCC細(xì)胞的基因表達(dá)譜的分析而形成的數(shù)據(jù)集，通過對比分析該基因芯片的原始數(shù)據(jù)得到的差異基因能夠?yàn)楹罄m(xù)各種有意義的分析提供可靠的依據(jù)。

本研究應(yīng)用生物信息學(xué)分析方法確定了cSCC和正常對照組間具有表達(dá)差異的基因894個，包括438個上調(diào)基因和456個下調(diào)基因，應(yīng)用GO分析和KEGG分析方法探討了差異基因的功能。GO分析顯示，上調(diào)的差異基因富集的細(xì)胞成分主要是染色體，具體在著絲粒區(qū)，通過調(diào)節(jié)DNA解旋酶活性、DNA復(fù)制參與有絲分裂細(xì)胞周期過程，包括核分裂、染色單體分離及細(xì)胞周期各時相的變化；下調(diào)的差異基因主要參與角質(zhì)形成細(xì)胞分化。由此可以看出，差異基因主要影響細(xì)胞的有絲分裂。研究證實(shí)，細(xì)胞周期及細(xì)胞增殖的失調(diào)是cSCC發(fā)生及進(jìn)展的重要機(jī)制，p53等細(xì)胞周期調(diào)節(jié)分子的突變是參與癌變的重要因素[6]；細(xì)胞周期蛋白D1作為重要的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子在cSCC中表達(dá)增高，在表皮細(xì)胞癌變過程中主要引起細(xì)胞增殖而導(dǎo)致cSCC的發(fā)生[7]。KEGG信號通路分析顯示，上調(diào)差異基因主要富集的信號通路包括DNA復(fù)制、細(xì)胞周期、錯配修復(fù)及Fanconi貧血通路。已有研究表明，與細(xì)胞周期相關(guān)的基因突變與cSCC的轉(zhuǎn)移性有密切的聯(lián)系[8]。DNA復(fù)制出現(xiàn)變異與cSCC的分化程度有密切聯(lián)系，MCM蛋白是一系列調(diào)控DNA復(fù)制的蛋白質(zhì)，是細(xì)胞增殖的特異性指標(biāo)，在高分化和低分化的cSCC中，MCM蛋白的表達(dá)有顯著差異，說明DNA復(fù)制對cSCC的表型及預(yù)后有重要影響[9]。

錯配修復(fù)基因在DNA復(fù)制中發(fā)揮著重要作用，這些基因突變可能導(dǎo)致異常短的或失活的蛋白質(zhì)產(chǎn)生而引起細(xì)胞癌變[10]；錯配修復(fù)的雙等位基因失活（MSH2或MLH1）可導(dǎo)致腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化。本文結(jié)果顯示，與正常對照組織比較cSCC樣本MSH2表達(dá)明顯升高，說明錯配修復(fù)基因參與cSCC的發(fā)生[11]。Fanconi貧血是一種罕見的隱性遺傳性疾病，由編碼貧血通路的15個基因中的1個基因突變引起，F(xiàn)anconi貧血病人有患頭面部SCC的極端風(fēng)險，有明顯鱗狀細(xì)胞癌的易感性[12]，F(xiàn)anconi貧血的突變基因可能參與cSCC的發(fā)生過程，具體基因及通路有待進(jìn)一步探討。下調(diào)基因主要與MAPK信號傳導(dǎo)通路及Notch信號通路有關(guān)，MAPK信號傳導(dǎo)通路在日光性角化（AK）向cSCC的轉(zhuǎn)化過程中起重要作用，因此作為預(yù)防cSCC的潛在靶點(diǎn)在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增生及存活的過程中起主要作用[13]。已知Notch信號通路可維持干細(xì)胞功能或誘導(dǎo)潛在的癌癥起始細(xì)胞終末分化，在調(diào)節(jié)組織發(fā)育和自我更新過程中發(fā)揮作用[1416]。Notch通路在癌癥的發(fā)展中起抑制作用。有研究結(jié)果顯示，陽光暴露部位的浸潤性cSCC的Notch1表達(dá)下調(diào)[17]，長期紫外線照射引起MAPK及Notch信號通路的抑制，可能導(dǎo)致cSCC發(fā)生。

本研究對差異基因進(jìn)行了PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，篩選出10個最具代表性的樞紐基因：SHC1、AURKB、SMC4、PLK1、PCNA、PTTG1、BRCA1、MCM2、EphB2、HDAC。①PPI分析結(jié)果顯示，SHC1是連通度最高的樞紐基因，說明該基因與cSCC的發(fā)生及進(jìn)展關(guān)系最為密切，可能是本病潛在的生物標(biāo)志物。已知SHC1基因編碼包含SH2和PTB結(jié)構(gòu)域的支架蛋白，參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能，如MAPK激活、細(xì)胞增殖和凋亡以及腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移，特別與乳癌的分型及不良預(yù)后有關(guān)[18]。與正常細(xì)胞相比，SHC1在多種腫瘤細(xì)胞中均高表達(dá)和高磷酸化。SHC1可通過不同磷酸化反應(yīng)和PPI對表皮生長因子的刺激做出反應(yīng)，有利于細(xì)胞增殖和存活[19]。SHC1是增強(qiáng)癌癥細(xì)胞對8ClcAMP治療敏感性的關(guān)鍵，SHC1及其信號網(wǎng)絡(luò)是該治療的靶點(diǎn)[20]。胰腺癌中Ⅰ型膠原激活的盤狀結(jié)構(gòu)域受體1上調(diào)N鈣黏著蛋白時需要SHC1輔助[21]，而SHC1在cSCC中的信號通路值得進(jìn)一步研究。②第2個樞紐基因是AURKB，其編碼產(chǎn)物是Aurora激酶家族的一員，屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶，是CPC（chromosomal passenger complex）的催化組分，可調(diào)節(jié)細(xì)胞G2期到胞質(zhì)分裂的過程，包括染色單體分離、組蛋白修飾和胞質(zhì)分裂，AURKB過表達(dá)在人類多種惡性腫瘤中被發(fā)現(xiàn)[22]，AURKB可磷酸化P53組蛋白，破壞其穩(wěn)定性，導(dǎo)致有絲分裂異常[23]。③第3個樞紐基因是SMC4，其過表達(dá)參與腫瘤細(xì)胞的生長、轉(zhuǎn)移及侵襲性，與癌癥病人的不良預(yù)后有關(guān)。SMC4的蛋白表達(dá)水平在人類神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中顯著增加，并與不良預(yù)后相關(guān)，SMC4過表達(dá)顯著促進(jìn)體外和體內(nèi)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖速度和侵襲能力，而SMC4下調(diào)時則降低。此外，在SMC4轉(zhuǎn)導(dǎo)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中被激活而在SMC4沉默的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中被抑制的轉(zhuǎn)化生長因子β（TGFβ）/Smad信號通路增強(qiáng)了SMC4介導(dǎo)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲性[24]。在人類肝細(xì)胞癌組織和細(xì)胞系中SMC4高表達(dá)，并且SMC4蛋白水平與原發(fā)性肝癌的腫瘤大小、分化程度、TNM分期及血管浸潤有關(guān)。miR219調(diào)節(jié)肝細(xì)胞癌的增殖和侵襲也是通過SMC4實(shí)現(xiàn)的，這兩個指標(biāo)呈負(fù)相關(guān)[25]。④第4個樞紐基因是PLK1，其在cSCC中過表達(dá)，并且是cSCC細(xì)胞存活所必需的，在多種不同的腫瘤類型中都有相似的表現(xiàn)。與正常增殖的角質(zhì)形成細(xì)胞相比，cSCC角質(zhì)形成細(xì)胞中PLK1基因敲除和抑制可以誘導(dǎo)G1/M期阻滯和凋亡[26]。⑤PCNA為DNA聚合酶δ的輔助蛋白，與DNA合成關(guān)系密切，在細(xì)胞增殖的啟動上起重要作用，是反映細(xì)胞增殖狀態(tài)的良好指標(biāo)[27]。子宮頸癌組織中CCHE1通過與PCNA的mRNA結(jié)合增強(qiáng)PCNA表達(dá)，從而發(fā)揮促進(jìn)癌細(xì)胞增殖的作用，并且對腫瘤的生長、侵襲及預(yù)后產(chǎn)生重大影響[28]。⑥PTTG1在活動性細(xì)胞周期中的表達(dá)顯著增加，提示該基因與細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)有關(guān)，并且有研究顯示PTTG1通過抑制TGFβ通路促進(jìn)乳癌細(xì)胞生長[31]。角質(zhì)形成細(xì)胞中PTTG1過表達(dá)可以通過反向激活cMyc、Cyclin B1和CDK1而導(dǎo)致細(xì)胞增殖，cMyc、Cyclin B1及CDK1都與細(xì)胞生長及癌變密切相關(guān)，提示PTTG1在表皮癌變和向惡性腫瘤轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮獨(dú)特的作用[30]。在cSCC中，PTTG1可能是細(xì)胞增殖的潛在標(biāo)志，其表達(dá)水平與P53蛋白突變呈正相關(guān)。紫外線照射致p53突變累積，而異常的p53突變使PTTG1基因表達(dá)增強(qiáng)，從而導(dǎo)致皮膚腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化[31]。⑦BRCA1腫瘤抑制蛋白是幾種不同大分子蛋白質(zhì)復(fù)合體的核心成分，有DNA損傷修復(fù)作用，執(zhí)行細(xì)胞周期檢控

點(diǎn)功能，這種DNA修復(fù)蛋白網(wǎng)絡(luò)能夠維持基因組穩(wěn)定、抑制癌癥的發(fā)生[32]。BRCA1參與細(xì)胞分化、凋亡和DNA重組等重要的生物進(jìn)程，其突變或異常表達(dá)在各種類型的鱗狀細(xì)胞癌中均被發(fā)現(xiàn)。在cSCC中rAd/p53基因治療能夠使BRCA1的表達(dá)增加，表明BRCA1是cSCC重要的抑癌基因[33]。⑧MCM2蛋白參與DNA復(fù)制和細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)，因其與DNA從G1期進(jìn)入S期有關(guān)，所以是細(xì)胞增殖的潛在特異性指標(biāo)，是發(fā)育不良、原位癌及浸潤性惡性腫瘤的有效標(biāo)志物。在高分化和低分化的cSCC中MCM2蛋白表達(dá)差異有顯著性，MCM2蛋白與6 mm厚的cSCC之間有顯著聯(lián)系，MCM2蛋白表達(dá)與cSCC的預(yù)后密切相關(guān)[9]。⑨在cSCC腫瘤細(xì)胞中EphB2出現(xiàn)特異性高表達(dá)，阻止其表達(dá)可以顯著抑制cSCC細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移，Eph信號通路介導(dǎo)細(xì)胞接觸依賴性細(xì)胞排斥作用，可以引導(dǎo)細(xì)胞定向移動，抑制EphB2表達(dá)能夠減低細(xì)胞間排斥作用，導(dǎo)致cSCC細(xì)胞的定向轉(zhuǎn)移能力缺陷，降低其侵襲性。另外，EphB2調(diào)節(jié)MMP13和MMP1兩種重要侵襲蛋白酶的表達(dá)，從而引起cSCC細(xì)胞的侵襲及植入組織，EphB2在原位cSCC向侵襲性cSCC轉(zhuǎn)化過程的早期發(fā)揮重要作用[4]。⑩HDACs是癌癥分子治療的重要靶點(diǎn)，催化去除組蛋白和非組蛋白的賴氨酸殘基的乙?；?/p>

HDACs對細(xì)胞周期進(jìn)程、細(xì)胞增殖及分化都產(chǎn)生重要影響，HDACs也被證明是皮膚腫瘤抑制因子p53和p63的重要調(diào)節(jié)劑。

綜上所述，本研究對cSCC的差異表達(dá)基因進(jìn)行了全面的生物信息學(xué)分析。本文結(jié)果顯示，cSCC中差異基因的基因產(chǎn)物主要富集于染色體，包括稠密染色體著絲粒區(qū)；cSCC中差異基因主要參與有絲分裂細(xì)胞周期過程、有絲分裂核分裂、姐妹染色單體分離、角質(zhì)形成細(xì)胞分化等生物進(jìn)程；基因的差異性表達(dá)導(dǎo)致DNA解旋酶活性、染色質(zhì)結(jié)合、DNA復(fù)制起始結(jié)合以及絲氨酸內(nèi)肽酶抑制劑活性等分子功能的異常也可能與CSCC發(fā)病的分子機(jī)制有關(guān)系。SHC1、AURKB、SMC4等基因的差異性表達(dá)導(dǎo)致MAPK、Notch等信號通路的異常，進(jìn)而影響錯配修復(fù)、細(xì)胞周期、DNA復(fù)制和蛋白酶體，可能參與cSCC的發(fā)生及進(jìn)展過程。上述信號傳導(dǎo)通路及樞紐基因可能參與cSCC的發(fā)生及進(jìn)展，需要進(jìn)一步的試驗(yàn)研究加以證實(shí)。本研究可為將來cSCC的分子機(jī)制、生物標(biāo)志物及靶向藥物的研究提供有價值的信息。今后還需要分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步探討差異基因在cSCC進(jìn)展中的具體作用機(jī)制。

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（本文編輯黃建鄉(xiāng)）