董軼　楊紹南　潘旭東　馬愛軍　李舒　裴浩天

[摘要]目的

探討微小RNA 181b（miR181b）是否通過調(diào)節(jié)自噬相關(guān)靶蛋白參與動脈粥樣硬化發(fā)展。

方法

通過頸總動脈套環(huán)誘導(dǎo)ApoE-/-小鼠頸動脈粥樣硬化斑塊形成。通過尾靜脈注射miR181b慢病毒載體構(gòu)建其過表達(dá)（miR181bOE）及低表達(dá)（miR181bKD）模型。檢測血漿中脂質(zhì)水平，蘇木精伊紅染色對動脈粥樣硬化斑塊大小和體積進(jìn)行定量，Western Blot檢測自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)。

結(jié)果各組ApoE-/-小鼠血漿中總膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白膽固醇水平均無顯著差異（P>0.05）。MiR181bKD和miR181bOE分別顯著減少和增加頸動脈斑塊面積和體積（F=118.95～322.03，P<0.05）。MiR181bOE可下調(diào)微管相關(guān)蛋白1輕鏈3膜結(jié)合型（LC3Ⅱ）的表達(dá)，上調(diào)核糖體蛋白質(zhì)S6激酶類70kDa（p70S6K）表達(dá)，抑制自噬體形成；相反，miR181bKD可上調(diào)LC3Ⅱ的表達(dá)，下調(diào)p70S6K表達(dá)，促進(jìn)自噬體形成。差異均有顯著性（F=107.38～398.13，P<0.05）。

結(jié)論抑制miR181b可能通過下調(diào)p70S6K表達(dá)增加自噬活性，延緩頸動脈粥樣硬化斑塊的形成。

[關(guān)鍵詞]動脈粥樣硬化；微RNAs；自噬體；核糖體蛋白質(zhì)S6激酶類，70kDa

[中圖分類號]R743.1；R543.5

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號] 20965532（2018）02014406

動脈粥樣硬化已經(jīng)成為威脅人類健康的最危險的疾病之一，頸動脈是多發(fā)部位[12]。頸動脈狹窄是缺血性卒中的危險因素，可導(dǎo)致高達(dá)10%～20%的卒中或短暫性腦缺血發(fā)作[3]。研究認(rèn)為，動脈粥樣硬化是一種炎癥性疾病，其起始和發(fā)展與大動脈和中動脈內(nèi)膜中的膽固醇積累有關(guān)[4]。但是，目前動脈粥樣硬化的病理生理機(jī)制還不完全清楚，新的治療方法和生物標(biāo)志物都需進(jìn)一步闡明。自噬是一種高度保守過程，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的物質(zhì)均可通過溶酶體依賴途徑降解[56]。最近的證據(jù)表明，動脈粥樣硬化斑塊中的自噬標(biāo)志物的表達(dá)可在低密度脂蛋白、炎癥和代謝應(yīng)激等內(nèi)在刺激下被相應(yīng)上調(diào)。值得注意的是，前期研究表明自噬也會被其他信號因子調(diào)控。其中，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）被認(rèn)為在自噬誘導(dǎo)的負(fù)性調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[5，7]。核糖體

蛋白質(zhì)S6激酶類70kDa（p70S6K）作為mTOR主要下游效應(yīng)物，參與了細(xì)胞生長、細(xì)胞存活和凋亡相關(guān)分子mRNA翻譯過程[89]。自噬活性與mTOR/p70S6k信號通路密切相關(guān)[1011]。文獻(xiàn)報道，微小RNA 320a（miR320a）、miR155、miR143/145和miR92a與動脈粥樣硬化斑塊形成關(guān)系密切[1217]。miR181b的表達(dá)水平在經(jīng)腫瘤壞死因子α（TNFα）處理或喂食高脂肪飲食的小鼠主動脈內(nèi)膜中下調(diào)。脂質(zhì)體包裹miR181b靶向基因轉(zhuǎn)染可以模擬ApoE-/-小鼠，抑制核因子κB（NFκB）活化，NFκB反應(yīng)性促炎基因表達(dá)、白細(xì)胞積聚和動脈粥樣硬化病變形成[1824]。目前還不清楚miR181b是否可以通過mTOR信號通路調(diào)節(jié)自噬活性。本研究的目的是通過miR181b過表達(dá)和低表達(dá)來研究動脈粥樣硬化斑塊和自噬的相關(guān)性。

1材料和方法

1.1動物與試劑

1.1.1動物及分組取雄性6周齡的ApoE-/-小鼠40只（C57BL/6小鼠，北京華阜康生物科技股份有限公司），喂飼高脂肪飲食（含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.002 5的膽固醇和0.150 0的脂肪，北京華阜康生物科技股份有限公司）。所有小鼠飼養(yǎng)在青島大學(xué)中心實驗室內(nèi)，室溫為22～24 ℃，明暗照明周期為12 h12 h，動物自由飲食。ApoE-/-小鼠在手術(shù)和整個實驗開始前2周開始高脂肪飲食。按照文獻(xiàn)報道的方法[2526]，在高脂肪飲食喂養(yǎng)后2周頸總動脈套環(huán)誘導(dǎo)斑塊形成。在病變發(fā)展的8周過程中，小鼠每周3次經(jīng)尾靜脈注射生理鹽水（對照）或miR181b慢病毒載體。小鼠在8周齡隨機(jī)被分為4組（每組10只），分別是對照組（A組，高脂飲食+假手術(shù)+10 μL生理鹽水）、模型組（B組，高脂飲食+手術(shù)+10 μL生理鹽水）、miR181b過表達(dá)組（OE組（C組），高脂飲食+手術(shù)+10 μL miR181bLV， 每只鼠滴定至2×107 TU）和miR181b低表達(dá)組（KD組（D組），高脂飲食+手術(shù)+10 μL miR181bRNAiLV，每只鼠滴定至2×107 TU）。動物實驗的所有執(zhí)行程序均按照ARRIVE指南。

1.1.2試劑及來源蛋白質(zhì)提取試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），抗p70S6K抗體（Cell Signaling，2708），抗pp70S6K抗體（abcam，ab131436），抗LC3Ⅱ（abcam，ab48394），抗GAPDH（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司），miR181bshRNA的慢病毒載體購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司。

1.2測試指標(biāo)與方法

1.2.1血脂分析8周后處死小鼠并從股動脈處采血，離心后收集血清。通過日本希森美康XS500i全自動血液分析儀分別檢測總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDLC）和低密度脂蛋白膽固醇（LDLC）的含量。

1.2.2組織學(xué)和透射電子顯微鏡檢查頸動脈用40 g/L多聚甲醛固定12 h，用于石蠟包埋。頸動脈石蠟切片用蘇木精伊紅（HE）染色觀察形態(tài)學(xué)變化。選取從頸動脈近心端至遠(yuǎn)端連續(xù)切片中的5個視野進(jìn)行分析。電鏡樣品先用30 g/L戊二醛固定，然后固定于10 g/L四氧化鋨中，在二甲胂酸鈉緩沖液中洗滌，用梯度乙醇脫水，再置換為環(huán)氧丙烷，并應(yīng)用Epon812環(huán)氧樹脂包埋。切成半薄片（1 μm）用亞甲基藍(lán)染色，然后用光鏡（Olympus，日本）定位觀察。超薄切片用檸檬酸鉛鹽和乙酸雙氧鈾染色，最后在JEM1400電子顯微鏡（JEOL，日本）下觀察。采用EM相機(jī)特征圖像系統(tǒng)（830.10U3 CCD Gatan，美國）拍攝透射電鏡圖像。

1.2.3蛋白免疫印跡將頸動脈保存在液氮中并儲存在-80 ℃冰箱中。樣品被均質(zhì)化，蛋白質(zhì)通過RIPA裂解緩沖液提取，蛋白質(zhì)濃度通過BCA法定量。將等量蛋白質(zhì)（20 μg）上樣，并通過150 g/L十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE電泳）。然后，將蛋白轉(zhuǎn)移并固定到聚偏二氟乙烯膜上（PVDF膜，Millipore，美國）。使用體積分?jǐn)?shù)0.05的脫脂牛奶將膜在室溫下封閉2 h，然后在4 ℃下用一抗（1∶1 000）孵育過夜。次日，將膜與相應(yīng)辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗（1∶5 000）（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）在室溫下孵育1 h。采用GE Image Quant LAS 4000mini超靈敏化學(xué)發(fā)光成像儀顯影，并用Image Pro Plus軟件對吸光度進(jìn)行測定。以管家蛋白GAPDH（上海碧云天生物科技有限公司）作為內(nèi)參蛋白。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理。計量數(shù)據(jù)用[AKx-D]±s形式表示，多組之間的比較用單因素方差分析法（ANOVA）進(jìn)行分析，多重比較采用LSD、SNK、Tukey等方法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1miR181b對小鼠血漿脂質(zhì)水平的影響與對照組相比較，模型組、miR181bOE組以及2.2MiR181b對小鼠動脈粥樣硬化斑塊形成影響

與模型組相比較，miR181bKD組中斑塊最大狹窄部位面積和斑塊體積顯著減?。‵=118.95～302.43，P<0.05）。相反，與模型組相比較，miR181bOE組斑塊面積和體積顯著增加（F=122.10～322.03，P<0.05）。因此，miR181b基因過表達(dá)促進(jìn)模型小鼠頸動脈粥樣硬化斑塊形成，而miR181b基因敲除抑制斑塊形成。見圖1和表2。

2.3MiR181b對小鼠動脈粥樣硬化斑塊中自噬體形成影響

透射電鏡觀察結(jié)果表明，對照組動脈粥樣硬化斑塊中無自噬空泡聚集，可見少量脂滴；而模型組動脈粥樣硬化斑塊中自噬空泡和脂滴較對照組增多；miR181bOE組小鼠動脈粥樣硬化斑塊中自噬體較模型組顯著減少；而miR181bKD組動脈粥樣硬化斑塊中自噬體顯著高于模型組，而且可見大量自噬溶酶體。見圖2。以上結(jié)果提示，miR181b可能通過自噬途徑影響小鼠動脈粥樣硬化的形成。

2.4MiR181b對小鼠動脈粥樣硬化斑塊中LC3Ⅱ蛋白表達(dá)影響

蛋白印跡檢測結(jié)果顯示，與模型組相比，miR181bKD組中自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ表達(dá)水平顯著增加，而miR181bOE組LC3Ⅱ表達(dá)被抑制（F=107.38～376.53，P<0.05），表明miR181b低表達(dá)可增強(qiáng)自噬活性，而其高表達(dá)抑制自噬活性。見圖3。

2.5miR181b對小鼠動脈粥樣硬化斑塊中pp70S6K和p70S6K蛋白表達(dá)影響

與模型組相比較，miR181bOE組小鼠的pp70S6K/p70S6K明顯升高，但miR181bKD組的pp70S6K/p70S6K明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義

（F=117.33～398.13，P<0.05）。表明miR181b可能激活mTOR信號通路并導(dǎo)致自噬抑制。見圖4。

3討論

本研究采用ApoE-/-小鼠頸動脈套管術(shù)和高脂飲食建立動脈粥樣硬化動物模型，結(jié)果顯示，下調(diào)miR181b可以抑制ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化斑塊的形成，而過表達(dá)可促進(jìn)ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化形成。在miR181bOE組LC3Ⅱ表達(dá)下調(diào)、p70S6K表達(dá)上調(diào)、自噬被抑制，而miR181bKD組LC3Ⅱ表達(dá)上調(diào)、p70S6K表達(dá)下調(diào)、自噬增強(qiáng)。抑制miR181b表達(dá)可能通過抑制p70S6K表達(dá)增強(qiáng)自噬，延緩頸動脈粥樣硬化斑塊的形成。

miRNA是一組長度19～25 bp、高度保守的非編碼小RNA，通過堿基互補(bǔ)或部分堿基互補(bǔ)與靶基因mRNA結(jié)合，降解mRNA或抑制其翻譯，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)。近年來的研究結(jié)果表明，miRNAs在動脈粥樣硬化斑塊進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[13]；miR155在ApoE-/-小鼠主動脈中表達(dá)上調(diào)，敲除miR155可抑制動脈粥樣硬化斑塊形成。miR143/145在調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換中發(fā)揮重要作用。研究還發(fā)現(xiàn)，Ldlr-/-小鼠敲除miR143/145后動脈粥樣硬化斑塊體積顯著減小[14]。既往的研究表明，促炎刺激和高脂肪飲食可抑制小鼠主動脈組織中miR181b表達(dá)[21]。同時，炎癥疾病病人循環(huán)miR181水平有所下降，包括膿毒癥和冠狀動脈疾病[21，24]。然而，沒有研究直接評估m(xù)iR181b水平在動脈粥樣硬化過程中的作用。本研究中，通過在ApoE-/-小鼠尾靜脈中注射miR181b慢病毒載體構(gòu)建miR181b過表達(dá)和低表達(dá)模型，并進(jìn)一步評價其生物學(xué)功能。與模型組比較，miR181bOE組頸動脈斑塊面積和體積明顯增高，相反，miR181bKD組斑塊形成明顯減輕。因此，我們的研究結(jié)果表明，miR181b過表達(dá)加重動脈粥樣硬化斑塊形成，而miR181b下調(diào)則延遲動脈粥樣硬化斑塊的進(jìn)展。

自噬是一種用以維持細(xì)胞基礎(chǔ)代謝穩(wěn)定的自我平衡機(jī)制，是一種依賴細(xì)胞自身溶酶體的降解途徑。近年來發(fā)現(xiàn)，自噬與動脈粥樣硬化的進(jìn)展關(guān)系密切。據(jù)報道，動脈粥樣硬化早期自噬即可活化，以保護(hù)巨噬細(xì)胞免受氧化損傷，以及對過量蛋白質(zhì)和受損細(xì)胞器進(jìn)行降解[27]。在巨噬泡沫細(xì)胞中，自噬參與將膽固醇和脂肪滴轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體中去[2728]。因此，本研究為調(diào)節(jié)動脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性和治療動脈粥樣硬化病人的新方法提供了有用的提示。雖然我們的研究結(jié)果表明，模型組頸動脈斑塊中的自噬被激活，但與對照相比其展現(xiàn)出較嚴(yán)重的動脈粥樣硬化。有學(xué)者認(rèn)為，自噬的激活不能在嚴(yán)重的腦血管損傷和氧化應(yīng)激條件下吞沒受損的線粒體細(xì)胞器[29]。其更有可能激活內(nèi)源性凋亡細(xì)胞，導(dǎo)致動脈粥樣硬化進(jìn)展期間細(xì)胞器損傷或蛋白質(zhì)聚集。也有學(xué)者認(rèn)為，缺乏自噬相關(guān)基因可以降低巨噬細(xì)胞應(yīng)對內(nèi)源性凋亡作用和應(yīng)激的能力，從而導(dǎo)致動脈粥樣硬化斑塊壞死[28]。因此，我們推測動脈粥樣硬化進(jìn)展期間mTOR信號傳導(dǎo)抑制涉及各種危險因素，并可促成自噬激活。即自噬失活不能延緩動脈粥樣硬化斑塊形成的進(jìn)展。

LC3是自噬活性的標(biāo)志蛋白，主要有LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、LC3Ⅲ等3個亞型，其中LC3Ⅱ常作為自噬標(biāo)志性物質(zhì)。有文獻(xiàn)報道，自噬在動脈粥樣硬化早期階段被激活，以保護(hù)巨噬細(xì)胞免受氧化損傷，并降解過量的蛋白質(zhì)和受損的細(xì)胞器[27]。并且越來越多的證據(jù)表明，miRNAs在動脈粥樣硬化進(jìn)展中可調(diào)節(jié)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)，如miR126、146a、155等[1517]。本研究顯示，miR181bOE組小鼠頸動脈斑塊中自噬體形成減少，LC3Ⅱ表達(dá)水平下調(diào)；相反，miR181bKD組自噬體形成增多，LC3Ⅱ表達(dá)水平也上調(diào)。說明miR181b過表達(dá)可能通過抑制自噬加速動脈粥樣硬化斑塊進(jìn)展，而miR181b下調(diào)則通過激活自噬延緩斑塊進(jìn)展。

mTOR作為生長因子、能量和營養(yǎng)狀態(tài)的感受器，可通過調(diào)節(jié)下游自噬復(fù)合物的形成，直接調(diào)控細(xì)胞自噬。p70S6K作為mTOR的主要下游效應(yīng)物，mTOR的激活導(dǎo)致p70S6K的磷酸化，最終增強(qiáng)了與細(xì)胞生長、細(xì)胞存活和凋亡相關(guān)分子mRNA翻譯和蛋白質(zhì)表達(dá)。研究結(jié)果表明，miRNA122通過mTOR/p70S6k信號通路可調(diào)控靶基因胰島素樣生長因子受體1的功能[29]。miRNA223抑制細(xì)胞增殖的作用也是通過其下游信號通路mTOR/p70S6k而實現(xiàn)的[30]。因此，mTOR/p70S6k信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可作為miRNAs發(fā)揮其調(diào)控作用的機(jī)制之一。同時，自噬活性與mTOR/p70S6k信號通路也密切相關(guān)。但是，miRNAs能否通過mTOR/p70S6k通路影響自噬過程報道較少。本研究結(jié)果表明，miR181bOE組斑塊中pp70S6K/總p70S6K表達(dá)比例顯著上調(diào)，而miR181bKD組其比值顯著降低，提示miR181b可能通過mTOR/p70S6k信號通路調(diào)節(jié)自噬進(jìn)而影響動脈粥樣硬化過程。

綜上所述，miR181b可通過正性調(diào)節(jié)mTOR信號通路的下游分子p70S6K的表達(dá)，而負(fù)性調(diào)節(jié)自噬，進(jìn)而促進(jìn)了動脈粥樣硬化斑塊的形成。然而，miR181b調(diào)控mTOR信號通路的具體分子機(jī)制還需要進(jìn)一步研究探索。

[參考文獻(xiàn)]

[1]SELWANESS M， BOS D， VAN DEN BOUWHUIJSEN Q， et al. Carotid atherosclerotic plaque characteristics on magnetic resonance imaging relate with history of stroke and coronary heart disease[J]. Stroke， 2016，47（6）：15421547.

[2]BRINJIKJI W， HUSTON J 3rd， RABINSTEIN A A， et al. Contemporary carotid imaging： from degree of stenosis to plaque vulnerability[J]. J Neurosurg， 2016，124（1）：2742.

[3]FAIRHEAD J F， ROTHWELL P M. The need for urgency in identification and treatment of symptomatic carotid stenosis is already established[J]. Cerebrovasc Dis， 2005，19（6）：355358.

[4]MONTEROVEGA M T. The inflammatory process under

lying atherosclerosis[J]. Critical Reviews in Immunology， 2012，32（5）：373462.

[5]WANG Z G， WANG Y， HUANG Y， et al. bFGF regulates autophagy and ubiquitinated protein accumulation induced by myocardial ischemia/reperfusion via the activation of the PI3K/Akt/mTOR pathway[J]. Scientific Reports， 2015（5）：9287. doi：10.1038/srep09287.

[6]ZHOU J， HU S E， TAN S H， et al. Andrographolide sensitizes cisplatininduced apoptosis via suppression of autophagosomelysosome fusion in human cancer cells[J]. Autophagy， 2012，8（3）：338349.

[7]KIM Y C， GUAN K L. mTOR： a pharmacologic target for autophagy regulation[J]. The Journal of Clinical Investigation， 2015，125（1）：2532.

[8]CHANG X， ZHAO Y， GUO L. Effect of OrexinA on cortisol secretion in H295R cells via p70S6K/4EBP1 signaling pathway[J]. International Journal of Endocrinology， 2015， 2015（3）：405157.

[9]DUAN P， HU C H， QUAN C， et al. 4Nonylphenol induces autophagy and attenuates mTORp70S6K/4EBP1 signaling by modulating AMPK activation in Sertoli cells[J]. Toxicology Letters， 2017，267（3）：2131.

[10]CAO C J， HAN D D， SU Y， et al. Ginkgo biloba exocarp extracts induces autophagy in Lewis lung cancer cells involving AMPK/mTOR/p70S6k signaling pathway[J]. Biomedicine & Pharmacotherapy， 2017，93（5）：11281135.

[11]SHEN Y M， LIU Y Y， SUN T， et al. LincRNAp21 knockdown enhances radiosensitivity of hypoxic tumor cells by reducing autophagy through HIF1/Akt/mTOR/P70S6K pathway[J]. Experimental Cell Research， 2017，358（2）：188198.

[12]BARTEL D P. MicroRNAs： target recognition and regulatory functions[J]. Cell， 2009，136（2）：215233.

[13]JI R R， CHENG Y H， YUE J M， et al. MicroRNA expression signature and antisensemediated depletion reveal an essential role of MicroRNA in vascular neointimal lesion formation[J]. Circulation Research， 2007，100（11）：15791588.

[14]SALA F， ARANDA J F， ROTLLAN N， et al. MiR143/145 deficiency attenuates the progression of atherosclerosis in Ldlr-/- mice[J]. Thrombosis and Haemostasis， 2014，112（4）：796802.

[15]CHEN C， WANG Y， YANG S L， et al. MiR320a contributes to atherogenesis by augmenting multiple risk factors and downregulating SRF[J]. Journal of Cellular and Molecular Medicine， 2015，19（5）：970985.

[16]LI G， MORRISBLANCO K C， LOPEZ M S， et al. Impact of microRNAs on ischemic stroke： from preto postdisease[J/OL]. Progress in Neurobiology， 2017. https：//doi.org/10.1016/j.pneurobio. 2017.08.002.

[17]ZHU N， ZHANG Dongze， CHEN Sifeng， et al. Endothelial enriched microRNAs regulate angiotensin Ⅱinduced endothelial inflammation and migration[J]. Atherosclerosis， 2011，215（2）：286293.

[18]DADAMO S， CETRULLO S， MINGUZZI M， et al. MicroRNAs and autophagy： fine players in the control of chondrocyte homeostatic activities in osteoarthritis[J]. Oxid Med Cell Longev， 2017， 2017（10）：3720128. doi：10.1155/2017/3720128.

[19]GOZUACIK D， AKKOC Y， OZTURK D G， et al. Auto

phagyregulating microRNAs and cancer[J]. Frontiers in Oncology， 2017，7：65.

[20]AREDIA F， SCOVASSI A I. A new function for miRNAs as regulators of autophagy[J]. Future Medicinal Chemistry， 2017，9（1）：2536.

[HJ2mm]

[21]SUN X H， ICLI B， WARA A K， et al. MicroRNA181b regulates NFkappa Bmediated vascular inflammation[J]. Journal of Clinical Investigation， 2012，122（6）：19731990.

[22]DI GREGOLI K， MOHAMAD ANUAR N N， BIANCO R， et al. MicroRNA181b controls atherosclerosis and aneurysms through regulation of TIMP3 and elastin[J]. Circulation Research， 2017，120（1）：4965.

[23]HARTMANN P， SCHOBER A，