于淑娟，陳　寬，汪　豐，朱永飛

(廣西師范學(xué)院化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，廣西南寧　530001)

1　引　言

熒光碳點(diǎn)是一種新型熒光碳納米材料，由于具有良好的水溶解性、生物相容性和低細(xì)胞毒性及穩(wěn)定的光致發(fā)光性等優(yōu)異性能，使其在生物成像、生物標(biāo)記、光學(xué)催化、生物傳感器等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用前景［1-3］。碳點(diǎn)的原料來(lái)源廣泛，如:葡萄糖、檸檬酸、牛奶、柑橘等均可作為原料。隨著碳點(diǎn)的不斷深入研究，以非共軛線性聚合物如聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、高分子多糖等為碳源制備的聚合物碳點(diǎn)及其應(yīng)用成為另一研究熱點(diǎn)［4-7］。聚合物碳點(diǎn)與碳點(diǎn)相比具有易于提純、可保留聚合物的某些官能團(tuán)、易于分子修飾，且與共軛熒光聚合物相比，具有水溶性好，制備簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。殼聚糖是一類天然高分子氨基多糖，具有無(wú)毒、成膜性好、易于分子修飾等諸多優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于傳感器、生物醫(yī)用材料等方面。以殼聚糖為碳源合成聚合物碳點(diǎn)的研究也逐漸見諸報(bào)道，如文獻(xiàn)［8］通過水熱法合成了表面含有氨基的殼聚糖基聚合物碳點(diǎn)，熒光量子產(chǎn)率為7.8%。Xiao等［9］也利用殼聚糖為原料，采用微波法合成了殼聚糖基聚合物碳點(diǎn)。關(guān)于殼聚糖基聚合物碳點(diǎn)的應(yīng)用范圍也在不斷擴(kuò)大，如應(yīng)用于熒光薄膜［10］、熒光涂層［11］，光學(xué)催化［12］、離子檢測(cè)［13］等方面，但在藥物輸送研究中較少，另外，上述殼聚糖基聚合物碳點(diǎn)存在量子產(chǎn)率不高、活性位點(diǎn)相對(duì)較少、選擇性差等不足［14］，這些缺陷也限制了它的應(yīng)用性能。高量子產(chǎn)率是熒光材料的應(yīng)用關(guān)鍵，設(shè)計(jì)合成高量子產(chǎn)率的聚合物碳點(diǎn)并進(jìn)一步擴(kuò)大其應(yīng)用范圍具有重要意義。

熒光納米微球?qū)τ诒O(jiān)測(cè)細(xì)胞識(shí)別腫瘤部位、監(jiān)測(cè)藥物在組織內(nèi)的運(yùn)輸、確定治療等有重要作用［15］，目前研究較多的一類是聚合物-無(wú)機(jī)雜化熒光納米微球，即聚合物包封半導(dǎo)體量子點(diǎn)，然而用于封裝的聚合物有導(dǎo)致量子點(diǎn)熒光消失的可能［16］。另一類是聚合物接枝熒光有機(jī)分子，但熒光有機(jī)分子通常有一定毒性。對(duì)于有實(shí)用價(jià)值的熒光納米微球，除了具有優(yōu)良的熒光特性外，粒徑大小、分散性、表面修飾、生物毒性和生物相容性都是需要考慮的問題［17］。針對(duì)上述存在的不足，本研究首先合成了辛基化殼聚糖衍生物，然后接枝可以形成高量子產(chǎn)率碳點(diǎn)的檸檬酸小分子，并添加氮摻雜試劑N-(2-羥乙基)乙二胺，通過水熱法合成了具有高熒光量子產(chǎn)率(42.9%)的兩親性殼聚糖衍生物基聚合物碳點(diǎn)。并以阿霉素為模型藥物，將該聚合物碳點(diǎn)應(yīng)用于藥物載體方面，對(duì)載藥及藥物釋放性能進(jìn)行了研究，通過MTT法評(píng)價(jià)了載藥納米膠束的毒性以及對(duì)鼻咽癌的抑制效果。

2　實(shí)　驗(yàn)

2.1　辛基殼聚糖(CS-g-OC)的制備

將2.0 g殼聚糖與一定量的辛醛加入到250 mL三口瓶中，加入50 mL甲醇，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌12 h，取1.5倍殼聚糖氨基物質(zhì)量的硼氫化鉀溶于50 mL水中，滴加到上述混合溶液中，繼續(xù)反應(yīng)12 h，結(jié)束后真空抽濾，用水和甲醇混合溶劑洗滌3次，冷凍干燥得到產(chǎn)物。辛基接枝率采用元素分析法進(jìn)行計(jì)算。

2.2　辛基-檸檬酸殼聚糖(CS-g-OC-CA)的合成

取4.5 g檸檬酸溶于50 mL去離子水，加入1 g辛基殼聚糖攪拌12 h，然后加入0.02 mol的EDC。攪拌10 min 后，加入0.02mol的NHS，避光反應(yīng)48 h，所得產(chǎn)物用去離水透析72 h(MWCO=8 000～14 000 u)，然后冷凍干燥得到目標(biāo)產(chǎn)物，合成路線如圖1(a)所示。

2.3　辛基-檸檬酸殼聚糖基兩親性聚合物碳點(diǎn)P(CS-g-OC-CA)Ds的制備

分別取上述不同辛基取代度的CS-g-OC-CA 0.25 g于水熱反應(yīng)釜中，依次加入0.25 g無(wú)水檸檬酸、1 mL N-(2-羥乙基)乙二胺、8 mL去離子水進(jìn)行充分混合，180℃反應(yīng)3 h，結(jié)束后用去離子水透析72 h(MWCO=8 000～14 000 u)，所得產(chǎn)物冷凍干燥。熒光量子產(chǎn)率測(cè)定根據(jù)參考文獻(xiàn)［18］的方法，以硫酸奎寧(0.05 mol/L H2SO4溶液中，360 nm激發(fā)光下，量子產(chǎn)率為0.54)為標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定P(CS-g-OC-CA)Ds的量子產(chǎn)率，按式(1)進(jìn)行計(jì)算:

其中Φ是量子產(chǎn)率，F(xiàn)為測(cè)量的積分發(fā)射強(qiáng)度，A為光密度，η是溶劑的折射率。下標(biāo)“s”是指具有已知量子產(chǎn)率的參考，“x”表示測(cè)定的P(CS-g-OC-CA)Ds。測(cè)得3種不同聚合物碳點(diǎn)Ⅰ、Ⅱ、Ⅱ的量子產(chǎn)率分別為 22.7%、42.9%、38.3%。

2.4　聚合物碳點(diǎn)載阿霉素(P(CS-g-OC-CA)Ds/DOX)納米膠束的制備

采用超聲法制備載藥納米膠束［19］，取一定量P(CS-g-OC-CA)Ds溶于HCl與DMSO的混合溶液中(VHCl∶VDMSO=3∶7)，超聲 30 min 后，40 ℃保溫12 h，加入一定量DOX的DMSO溶液，避光振蕩24 h后，用超純水透析72 h(MWCO=1 000 u)(每2 h換水一次)，透析結(jié)束，用低溫10 000 r/min高速離心30 min除去上清液，得到P(CS-g-OC-CA)Ds/DOX納米膠束，其路線如圖1(b)所示。

圖1　CS-g-OC-CA的合成路線(a)和P(CS-g-OC-CA)Ds/DOX的納米膠束示意圖(b)

采用IS10型FT-IR儀(美國(guó)NICOLET)，以溴化鉀壓片法測(cè)定產(chǎn)物在500～4 000 cm－1范圍內(nèi)的紅外光譜;采用美國(guó)Thermo Electron 250Xi型X射線光電子能譜分析P(CS-g-OC-CA)Ds表面化學(xué)組分，束斑尺寸為500μm。以日本島津公司RF-53-01對(duì)P(CS-g-OC-CA)Ds水溶液進(jìn)行熒光光譜掃描，激發(fā)狹縫為3 nm，發(fā)射狹縫為3 nm。將P(CS-g-OC-CA)Ds/DOX納米膠束通過超聲分散后，采用英國(guó)馬爾文公司Zetasizer Nano ZS90動(dòng)態(tài)光散射粒度儀測(cè)量其水合粒徑和電勢(shì)。采用美國(guó)TecnaiG2 F20 S-TWIN型透射電子顯微鏡觀察P(CS-g-OC-CA)Ds的形貌。采用日本JEOL公司JEM-2100高分辨率透射電子顯微鏡觀察P(CS-g-OC-CA)Ds/DOX的形貌。采用X射線衍射儀測(cè)定樣品的晶型結(jié)構(gòu)，管壓為40 kV，掃描速率為2(°)/min，2θ為10°～45°。

3　結(jié)果與討論

殼聚糖衍生物及聚合物點(diǎn)的紅外譜圖如圖2所示。圖2(b)中CS-g-OC在2 926 cm－1和2 853 cm－1處特征峰與原料CS(圖2(a))對(duì)比明顯增強(qiáng)，為辛基中的亞甲基—CH2的特征吸收峰，說明辛基已經(jīng)成功接到CS分子鏈上。圖2(c)中CS-g-OC-CA的紅外譜圖在3 465 cm－1與1 641 cm－1處吸收峰均明顯變寬，分別為檸檬酸中羧基—OH締合吸收峰與羰基C O的伸縮振動(dòng)吸收峰，說明在辛基殼聚糖分子鏈上引入了檸檬酸。P(CS-g-OC-CA)Ds譜圖(圖2(d))中3 389 cm－1處寬峰為—OH、—NH2的伸縮振動(dòng)特征峰，1 660 cm－1處為殼聚糖中酰胺—NH2的特征峰，1 590 cm－1為 N—H 的彎曲振動(dòng)峰，1 076 cm－1處為—C—O—C的特征峰，從以上的分析中可知聚合物碳點(diǎn)表面含有—OH、環(huán)氧基、C O、—NH2等極性基團(tuán)。

圖2　CS(a)、CS-g-OC(b)、CS-g-OC-CA(c)、P(CS-g-CA)Ds(d)的紅外光譜。

圖3　CS(a)、CS-g-OC-CA(b) 和 P(CS-g-OC-CA)Ds(c)的XRD圖。

圖4　P(CS-g-OC-CA)Ds的 XPS圖譜及 C1s、N1s、O1s分峰。

為了進(jìn)一步確定所合成的兩親性聚合物碳點(diǎn)結(jié)構(gòu)并了解其晶型，采用X射線衍射(XRD)圖譜進(jìn)行表征，如圖3所示。CS(圖3(a))在2θ=10.4°與20.1°處有強(qiáng)衍射峰，說明 CS具有高結(jié)晶性［20］。CS-g-OC-CA(圖3b)因辛基與檸檬酸的引入破壞了CS分子鏈的規(guī)整性，使結(jié)晶峰明顯減弱，在 11.8°和 18.5°處有弱結(jié)晶峰。在聚合物碳點(diǎn)P(CS-g-OC-CA)Ds(圖3(c))中，雖然檸檬酸發(fā)生了碳化分解，但辛基破壞CS分子鏈的規(guī)整性不變，使結(jié)晶峰成為漫散射衍射峰，說明聚合物碳點(diǎn)為無(wú)定型結(jié)構(gòu)。

圖4為P(CS-g-OC-CA)Ds的X射線光電子能譜(XPS)，圖4(a)中285.4，400.4，532.4 eV 分別為 C1s、N1s、O1s的 XPS譜，表明 P(CS-g-CA)Ds含有C、N、O 3種元素。在 C1s分峰譜圖中，285.4，286.7，288.4 eV 分別為 C—N、C—O、C O /C N的峰。N1s分峰中，400.4，401.5 eV分別為C—N、C N/N—H特征峰。O1s分峰中532.4 eV與533.4 eV分別為C O、C—OH/C—O—C的峰。以上分析表明該聚合物碳點(diǎn)表面含有—COOH、—OH、—NH2、環(huán)氧基等的功能基團(tuán)，這與紅外譜圖信息一致，另外也正是因這些親水基團(tuán)的存在使聚合物碳點(diǎn)表現(xiàn)出良好的水溶性。

P(CS-g-OC-CA)Ds的熒光光譜及紫外吸收光譜如圖5所示。P(CS-g-OC-CA)Ds在232 nm與348 nm處有紫外吸收，分別歸屬于聚合物碳點(diǎn)中 sp2碳的 π-π*躍遷和羰基的 n-π*躍遷［21］，P(CS-g-OC-CA)Ds的最佳熒光激發(fā)峰與發(fā)射峰分別為376 nm和455 nm(圖5(a))。當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)從280～400 nm以間隔20 nm增加時(shí)，其發(fā)射光譜熒光表現(xiàn)出先增強(qiáng)后減弱的變化趨勢(shì)(圖5(b))。激發(fā)波長(zhǎng)為360 nm時(shí)，熒光強(qiáng)度達(dá)到最大值，而且在整個(gè)過程中有紅移的現(xiàn)象，說明該聚合物碳點(diǎn)具有多色熒光性。熒光激發(fā)依賴發(fā)射行為可能歸因于聚合物碳點(diǎn)不同的表面態(tài)和尺寸［22］，不同的表面態(tài)提供了多種電子遷移途徑和能級(jí)差［23］。另外尺寸的不同決定了其能量帶隙的不同，進(jìn)而決定了聚合物碳點(diǎn)的發(fā)射位點(diǎn)也不同，多種不同發(fā)光中心使聚合物碳點(diǎn)具有熒光激發(fā)依賴性［24］。以硫酸奎寧為參比，測(cè)試了 P(CS-g-OCCA)Ds的熒光量子產(chǎn)率最高為42.9%，與純殼聚糖聚合物碳點(diǎn)［8-9］的量子產(chǎn)率相比明顯提高，可能歸因于殼聚糖分子與氮摻雜試劑在熱解過程中對(duì)檸檬酸碳點(diǎn)起到了鈍化作用，增加了聚合物碳點(diǎn)表面的缺陷，另外殼聚糖也是碳源材料，在熱解過程中也有部分殼聚糖基聚合物點(diǎn)的生成，以上綜合結(jié)果導(dǎo)致了熒光量子產(chǎn)率的增加。

圖5　(a)P(CS-g-OC-CA)Ds的紫外吸收、熒光光譜，插圖:356 nm紫外光下的數(shù)碼照片;(b)不同激發(fā)波長(zhǎng)下的發(fā)射光譜。

圖6　載藥納米膠束P(CS-g-OC-CA)Ds/DOX的高分辨透射電鏡圖(a)和流體力學(xué)粒徑分布曲線(b)

表1　不同取代度納米膠束的臨界膠束濃度、載藥量和包封率Tab.1　Criticalmicelle concentration，drug loading and encapsulation efficiency for differentmicelles

圖7　P(CS-g-OC-CA)Ds/DOX納米膠束的體外釋藥曲線(pH=7.4)

圖8　添加不同濃度P(CS-g-OC-CA)Ds/DOX對(duì)CNE-2細(xì)胞活性的影響

圖6為P(CS-g-OC-CA)Ds/DOX高分辨透射電鏡(圖6(a))與流體力學(xué)粒徑及其分布(圖6(b))，從HRTEM圖中可見P(CS-g-OC-CA)Ds/DOX在溶液中呈近似球型分布，粒徑約為80～90 nm，流體力學(xué)粒徑為114.3 nm，比透射電鏡測(cè)得的粒徑要大，可能是因?yàn)榫酆衔锾键c(diǎn)表面含有羥基，羧基、氨基等官能團(tuán)，導(dǎo)致納米膠束吸附在一起形成較大的團(tuán)聚體使DLS的值較大。PDI為0.087，說明粒徑分布較窄，表面電勢(shì)為+5.72mV。對(duì)聚合物碳點(diǎn)載藥與釋藥性能進(jìn)行了研究，其中聚合物碳點(diǎn)的臨界膠束濃度、以及對(duì)DOX的載藥量與包封率數(shù)據(jù)如表1所示。聚合物碳點(diǎn)當(dāng)辛基取代度為76.42%時(shí)，有最佳的對(duì)DOX的載藥量和包封率，分別為49.6%與47.4%。藥物的體外釋放性能如圖7所示?？梢钥闯?，不同辛基取代度的聚合物碳點(diǎn)納米膠束中DOX的釋放行為均具有初期爆釋、后期緩慢釋放的雙相特點(diǎn)，在50 h釋放率分別為7.92%、10.64%、14.63%，隨后藥物釋放率有所減緩，不同辛烷基取代度對(duì)釋藥性能影響明顯，隨著辛烷基取代度的增加，釋藥性能增加，150 h后，3種取代度的聚合物碳點(diǎn)膠束的釋藥率分別達(dá)到11.77%、14.09%、17.31%。DOX 的緩慢釋放與包封機(jī)理相關(guān)，可能有部分DOX是吸附在聚合物碳點(diǎn)納米膠束表面，最初的10 h的爆釋歸因于吸附在納米膠束表面的DOX發(fā)生的解吸附。隨后DOX隨納米粒子的溶脹逐漸從內(nèi)部擴(kuò)散出來(lái)。后續(xù)的緩慢釋放可能是因?yàn)镈OX被殼聚糖聚合物碳點(diǎn)中辛烷基的纏繞、包裹等結(jié)合得比較緊密導(dǎo)致，另外釋藥性也與載藥量有關(guān)，隨著載藥量的增加，DOX的釋放量也隨之增加。

將不同 DOX 含量(0，5，10，20，25，50 μg/mL)的載藥納米膠束P(CS-g-OC-CA)Ds/DOX與人鼻咽癌細(xì)胞CNE-2共同培養(yǎng)72 h，觀察其對(duì)細(xì)胞活性的影響，結(jié)果如圖8所示。未載藥納米膠束處理72 h后，細(xì)胞存活率仍在85%以上，表明辛基殼聚糖聚合物碳點(diǎn)基本沒有毒性。而負(fù)載DOX的納米膠束對(duì)鼻咽癌細(xì)胞表現(xiàn)出了明顯增強(qiáng)抑制效果，說明該載藥納米膠束在癌癥治療方面具有潛在的應(yīng)用前景。

4　結(jié)　論

通過水熱法制備了一種辛基化殼聚糖基兩親性聚合物碳點(diǎn)熒光材料，發(fā)現(xiàn)檸檬酸的接枝可以明顯提高聚合物點(diǎn)的量子產(chǎn)率。該聚合物碳點(diǎn)以無(wú)毒生物相容性良好的殼聚糖為主要原料，使碳點(diǎn)保留了部分殼聚糖的性能。在阿霉素載藥方面的應(yīng)用結(jié)果表明，該聚合物碳點(diǎn)在辛基取代度為76.42%時(shí)，其最大載藥量和包封率分別為49.6%與47.4%。另外我們還發(fā)現(xiàn)，通過控制辛基取代度可以對(duì)藥物的載藥量和包封率進(jìn)行調(diào)控。MTT性能研究發(fā)現(xiàn)，未載藥納米膠束處理72 h后，細(xì)胞存活率仍在85%以上，表明辛基殼聚糖聚合物碳點(diǎn)基本沒有毒性，載藥納米膠束對(duì)鼻咽癌細(xì)胞有一定的抑制作用。由此可見，該聚合物碳點(diǎn)熒光材料不僅可以載藥還具有熒光示蹤的性能，是一類良好可示蹤的藥物載體材料。該聚合物碳點(diǎn)材料在生物醫(yī)學(xué)成像方面也將有很好的應(yīng)用前景，可以為疾病診斷與治療提供支持，同時(shí)還可以利用聚合物碳點(diǎn)易于修飾的優(yōu)點(diǎn)在表面連接靶向分子制備多功能醫(yī)用納米粒子，進(jìn)一步擴(kuò)大其應(yīng)用范圍。