陳 佩,黨 輝,郭紅軍,翟彩寧

(1.陜西廣播電視大學,益生菌功能及應用協(xié)同創(chuàng)新中心,陜西西安 710062;2.陜西師范大學食品工程與營養(yǎng)科學學院,陜西西安 710062)

正常狀態(tài)下,人體中自由基的產(chǎn)生和清除處于動態(tài)平衡狀態(tài),但由于種種原因?qū)е聶C體自由基產(chǎn)量升高或者機體清除自由基的能力下降時,機體就會出現(xiàn)氧化應激,這種狀態(tài)會使機體受到一定的損傷,引發(fā)機體功能障礙,可導致腸道組織損傷[1],動脈粥樣硬化[2]、肝病[3]、糖尿病和癌癥[4]等疾病的發(fā)生。目前,可通過抗氧化劑來清除活性氧,但是人工合成的抗氧化劑大多數(shù)為芳胺類或苯酚類,均具有一定的毒性,長期使用會給機體帶來一系列的副作用,例如對肝、脾和肺均有不利的影響[5-6]。因此尋求更為安全天然的抗氧化劑是非常必要的[7]。

乳酸菌是一類能夠發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生主要終產(chǎn)物為乳酸的革蘭氏陽性菌,在自然界分布廣泛,具有調(diào)節(jié)人體腸道微生態(tài)[8]、調(diào)節(jié)免疫力[9]、降低血糖[10]和延緩衰老[11]等功能,是公認的安全級微生物[12],被廣泛地應用于食品生產(chǎn)工業(yè)和發(fā)酵領域。近年來,乳酸菌在體內(nèi)外的抗氧化能力得到了廣泛的研究。劉宏宇等[13]對25株乳酸菌進行體外抗氧化研究發(fā)現(xiàn)不同來源乳酸菌的抗氧化活性存在種間和種內(nèi)差異。Ji等[14]從奶牛糞便中分離出四種乳酸菌,經(jīng)測定發(fā)現(xiàn)都具有很好的抗氧化活性,可用于開發(fā)抗氧化劑。余芳等[15]從傳統(tǒng)發(fā)酵食品中分離得到10株乳酸菌,發(fā)現(xiàn)其都具有一定的抗氧化活性。

本研究以前期從陜南泡菜中篩選出的一株高產(chǎn)胞外多糖的戊糖片球菌P36為研究對象[16],擬通過H2O2誘導的HepG2細胞氧化損傷模型對乳酸菌抗氧化能力進行評價,研究該菌株對HepG2細胞抗氧化能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

戊糖片球菌P36 分離自陜南地區(qū)農(nóng)戶自制泡菜;人肝癌細胞系HepG2細胞株 中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心;4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI) 美國sigma公司;DMEM低糖培養(yǎng)基、雙抗(青、鏈霉素)、0.25%胰酶(含0.02% EDTA)、胎牛血清、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸(NEAA) 美國Gibico公司;MRS液體培養(yǎng)基 青島海博生物技術有限公司;總抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)、超氧化物岐化酶(superoxide dismutase,SOD)、還原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、過氧化氫酶(catalase,CAT)、過氧化物酶(peroxidase,POD)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)測定試劑盒 武漢博士德生物工程有限公司。

LRH-150型恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司;HEPA Class 100型CO2細胞培養(yǎng)箱 美國Thermo公司;SW-CJ-1CV超凈臺蘇州安泰空氣技術有限公司;5415R 冷凍離心機 德國Eppendorf公司;VCX500超聲波破碎儀 美國Sonics公司;UV-2450紫外可見分光光度計 日本島津公司;CX41-12C02倒置顯微鏡 日本Olympus公司;DM2000型熒光顯微鏡 德國Leica公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳酸菌菌種的培養(yǎng) 將凍存于-80 ℃的乳酸菌接入MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)18 h,連續(xù)活化三代后用于后續(xù)實驗。

1.2.2 乳酸菌的菌液制備 將培養(yǎng)好的乳酸菌在4 ℃條件下,以6000 r/min離心10 min,棄上清液,菌體用磷酸鹽緩沖液(pH7.2)離心洗滌3次,菌液濃度調(diào)節(jié)為1×109CFU/mL。

1.2.3 細胞培養(yǎng) 將HepG2細胞按常規(guī)方法復蘇后,置于含有10%胎牛血清、1%非必需氨基酸(NEAA)、1% L-谷氨酰胺和1%雙抗的低糖DMEM培養(yǎng)液中,37 ℃,5% CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng),隔天更換一次培養(yǎng)液,待細胞貼壁融合率達80%左右時,用含0.02% EDTA 的0.25%胰酶消化細胞,按1∶3傳代。取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.2.4 H2O2對HepG2細胞氧化損傷模型的建立 參照文獻[17]的方法有所改動,將對數(shù)生長期中的HepG2細胞按照2×105個/mL接種到96孔板中,每孔100 μL,37 ℃,5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,加入100 μL含H2O2終濃度為0.10 mmol/L的DMEM培養(yǎng)液,作用2 h,以此建立氧化損傷模型。

1.2.5 MTT法檢測細胞存活率 參照文獻[18]的方法有所改動,96孔板中每孔加入5 g/L 的MTT 40 μL,置入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中,孵育4 h,吸出培養(yǎng)液,每孔加入150 μL的DMSO溶解結晶,37 ℃培養(yǎng)箱中放置10 min,確保紫色結晶充分溶解,振蕩混勻后,酶標儀測定各孔在570 nm處的吸光度值。按公式計算細胞存活率:

細胞存活率(%)=(實驗組A570/對照組A570)×100

1.2.6 實驗分組 參照文獻[19]的方法有所改動,用0.25%的胰酶消化收集生長處于對數(shù)生長期的HepG2細胞,以2×105個/mL的細胞密度接種于6孔培養(yǎng)板,每孔2 mL培養(yǎng)液,置入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)24 h后,分組處理:空白對照組,加入2 mL DMEM完全培養(yǎng)液;模型組,加入2 mL含H2O2的DMEM培養(yǎng)液;乳酸菌組,同時加入含H2O2的DMEM培養(yǎng)液和戊糖片球菌P36(1×109CFU/mL)2 mL,繼續(xù)培養(yǎng)12和24 h。

1.2.7 樣品收集 細胞繼續(xù)培養(yǎng)12和24 h后吸取培養(yǎng)上清液裝入離心管,-80 ℃凍存?zhèn)溆?。每孔用PBS(pH7.2)洗滌3次,然后每孔加1 mL 1%的Triton X-100用吸管充分吹勻,2000 r/min 離心15 min,收集上清即為細胞裂解液,-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.8 指標測定 T-AOC、SOD、GSH、GSH-Px、CAT、POD、LDH和MDA指標測定方法均按照試劑盒說明書進行。

1.2.9 細胞形態(tài)觀察 參照文獻[20]的方法有所改動,將HepG2細胞以2×105個/mL的密度接種于6孔培養(yǎng)板,培養(yǎng)24 h使細胞爬片,后進行實驗(造模及乳酸菌處理),實驗結束后,PBS(pH7.2)洗滌3次,避光加入DAPI工作液(1 μg/mL)淹沒平皿底部,染色20 min后,PBS(pH7.2)漂洗3次后封片,避光用熒光顯微鏡觀察。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用SPSS 16.0進行one-way ANOVA,Tukey’s多重檢驗(p<0.05),數(shù)值以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 戊糖片球菌P36對HepG2細胞培養(yǎng)上清液抗氧化能力的影響

從表1可以看出,12 h時,與對照組相比,模型組細胞上清液中的GSH-Px的活力顯著增加了74.24%(p<0.05),POD活力顯著降低24.38%(p<0.05),SOD、GSH、CAT和MDA的含量無顯著性差異(p>0.05),表明此時模型組細胞還未進入氧化應激狀態(tài)。與模型組相比,添加戊糖片球菌P36 12 h后,細胞上清液中的T-AOC、SOD、GSH-Px和CAT活力都有顯著提高,分別顯著提高了58.78%、22.63%、27.59%和125.93%(p<0.05),POD的活力顯著降低了44.10%(p<0.05),MDA含量增加了19.05%,此與崔志文等[21]研究結果一致,表明戊糖片球菌P36可以提高細胞抗氧化能力,但是對細胞也有一定的刺激作用。24 h后,與對照組相比,模型組細胞上清液中的T-AOC顯著降低了43.41%(p<0.05),SOD、GSH-Px和CAT的活力分別顯著降低11.43%、51.85%和46.86%(p<0.05),同時POD活力顯著增加32.22%(p<0.05),MDA含量顯著增加80.93%(p<0.05),表明此時細胞已表現(xiàn)為氧化應激狀態(tài)。與模型組相比,添加戊糖片球菌P36 24 h后,細胞上清液中的T-AOC和SOD的活力顯著增加了145.34%和122.54%(p<0.05),GSH-Px、CAT和POD的活力顯著增加(p<0.05),GSH和MDA的含量分別顯著降低了27.71%和49.43%(p<0.05)。王玉華等[22]研究表明鼠李糖乳桿菌具有高效清除羥自由基和超氧化陰離子自由基的能力,其抗氧化作用的活性成分可能與活細胞和細胞內(nèi)活性成分有關。Kullisaar 等[23]研究表明益生菌發(fā)酵的山羊乳可以提高人體SOD和GSH-Px活力,降低腸道氧化應激,增強抗氧化能力。

表1 細胞上清液在12和24 h時的抗氧化活性Table 1 Antioxidative activities of cells supernatant at 12 and 24 h

綜上所述,P36提高了抗氧化酶SOD、GSH-Px、CAT和POD的合成和分泌效率,增強了細胞的抗氧化能力。

2.2 戊糖片球菌P36對HepG2細胞裂解液抗氧化活性的影響

由表2可知,12 h后,與對照組相比,模型組細胞裂解液中SOD活力含量有所降低,但差異不顯著(p>0.05),GSH含量顯著降低(p<0.05),POD的活力顯著提高了92.34%(p<0.05)。結果表明此時細胞剛開始受到刺激,胞內(nèi)POD活力增加以保護細胞免受損傷。添加戊糖片球菌P36 12 h后,乳酸菌組的細胞裂解液中SOD活力與對照組和模型組相比分別顯著增加了14.32%和17.49%(p<0.05);POD的活力與對照組相比顯著增加了101.62%(p<0.05),和模型組相比也有所增加;GSH的含量與模型組相比顯著增加(p<0.05)。表明此時細胞受到乳酸菌的氧化刺激作用,胞內(nèi)的氧化酶含量隨之升高。24 h后,與對照組相比,模型組細胞裂解液中的SOD活力和GSH含量分別顯著增加了43.79%和60.81%(p<0.05);POD活力也有所增加。

表2 細胞裂解液在12和24 h時的抗氧化活性Table 2 Antioxidative activities of cells lysate at 12 and 24 h

添加戊糖片球菌P36組的SOD活力比對照組有所增加,但比模型組顯著降低了19.76%(p<0.05);POD活力比對照組和模型組分別顯著增加了114.46%和93.63%(p<0.05);GSH含量比對照組顯著增加了72.01%(p<0.05),與模型組相比也有所增加。

綜上所述,此時模型組的細胞已受到強烈的氧化應激,細胞內(nèi)的抗氧化物SOD開始大量合成,以保護細胞免受損傷。另外,戊糖片球菌P36通過刺激提高細胞內(nèi)POD的活力,增強了細胞的抗氧化作用,對細胞有一定的保護作用。有研究表明植物乳桿菌可以提高Caco-2細胞的抗氧化酶活性,具有很強的抗氧化活性[24],本研究與此結果一致。

2.3 戊糖片球菌P36對HepG2細胞形態(tài)的影響

DAPI是一種熒光染料,它可以穿透完整的細胞膜,與細胞內(nèi)的DNA強力結合,在熒光顯微鏡下觀測呈現(xiàn)藍色至青綠色。如圖1所示,HepG2細胞經(jīng)過不同處理后,再進行DAPI染色,在熒光顯微鏡下可以明顯看出其細胞形態(tài)的變化情況。圖1A顯示正常HepG2細胞的核DNA與DAPI特異性結合后,細胞核的輪廓清晰可見,呈圓形或橢圓形,核內(nèi)呈現(xiàn)均勻彌漫的熒光,細胞質(zhì)無熒光。圖1B所示,經(jīng)過H2O2損傷后的HepG2細胞形態(tài)明顯改變,細胞核皺縮,體積變小呈不規(guī)則形狀,核內(nèi)呈現(xiàn)致密濃染的塊狀凝聚強熒光。圖1C所示,加入戊糖片球菌P36后,細胞受損程度明顯低于圖1B中模型組細胞,少數(shù)細胞發(fā)生凋亡,其細胞核皺縮,體積變小,但大部分細胞形態(tài)正常,呈現(xiàn)均勻彌漫的熒光。此結果與上文結果相符,即反映出戊糖片球菌P36具有抗氧化的能力,能夠減少H2O2對HepG2細胞的損傷。

圖1 熒光顯微鏡下HepG2細胞核形態(tài)(400×)Fig.1 Morphology of nucleus in HepG2 cells with fluorescence microscope(400×)注:A:正常組；B:模型組；C:乳酸菌組。

3 結論

本文對一株高產(chǎn)胞外多糖的戊糖片球菌P36對HepG2細胞的抗氧化能力進行了研究。將HepG2細胞分為空白對照組、模型組和乳酸菌組。細胞培養(yǎng)至12和24 h時分別測定其上清液和細胞裂解液的抗氧化活性。并利用DAPI對HepG2細胞進行染色后觀測不同組細胞核形態(tài)的變化。結果表明,戊糖片球菌P36與經(jīng)H2O2誘導的HepG2細胞共培養(yǎng)24 h后表現(xiàn)出一定的抗氧化作用。細胞上清液中的抗氧化酶活力均顯著增加(p<0.05),GSH和MDA的含量均顯著降低(p<0.05),細胞裂解液中的SOD活力顯著降低(p<0.05)。因此,戊糖片球菌P36能夠明顯減輕H2O2對細胞的氧化損傷,使HepG2細胞受損程度降低。為了更深入探討戊糖片球菌P36的抗氧化能力,后續(xù)將進一步開展相應的動物實驗研究。