陽(yáng)衛(wèi)立 劉 清 劉址忠 王 偉 羅永勝 胡雙成

復(fù)方苦參注射液 （Compound kushen injection,CKI）是由苦參、白土苓兩味中藥精制而成。中醫(yī)認(rèn)為，苦參具有清熱燥濕之功效?？鄥⒑锌鄥A、氧化苦參堿、槐果堿、氧化槐果堿等多種活性抗癌成分[1-2]，具有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，止痛，抗炎，增加機(jī)體免疫力等作用。Zhang等[3]研究者在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)苦參堿可誘導(dǎo)大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的自噬作用。自噬作為一種細(xì)胞死亡過(guò)程，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，在抑制腫瘤細(xì)胞方面起著很大作用。肝癌作為中國(guó)發(fā)病率較高的腫瘤，也是中國(guó)惡性腫瘤病死的主要原因，近年來(lái)肝癌的發(fā)病率逐年升高，肝癌已經(jīng)成為腫瘤領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。本研究旨在探討復(fù)方苦參注射液對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721增殖及自噬的影響，為進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

一、材料

人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞資源平臺(tái)。復(fù)方苦參注射液購(gòu)于山西振東制藥公司，LC3兔抗人單克隆抗體購(gòu)于sigma公司，SOSTEM1兔抗人單克隆抗體購(gòu)于CST公司。RNA提取試劑盒購(gòu)自QIAGEN公司。

二、MTT法測(cè)定細(xì)胞活力

將肝癌細(xì)胞SMMC-7721以1×104/cm2的密度接種到96孔培養(yǎng)板中，每孔接種100μL，每組5個(gè)平行孔。接種24 h后，加入不同濃度的復(fù)方苦參注射液繼續(xù)培養(yǎng)48 h。采用MTT法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，每孔加入終濃度為0.5 mg/mL的MTT。繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄去上清，每孔加150μL DMSO，30 min后用自動(dòng)酶標(biāo)儀于490 nm測(cè)定各孔吸光度。

三、RT-PCR法測(cè)定自噬相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平

按照Trizol試劑盒的說(shuō)明書(shū)，從處理后不同時(shí)間收集的SMMC-7721細(xì)胞中提取RNA并檢測(cè)其濃度。然后，用RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA的試劑盒（Applied Biosystems，4387406）將 2 μg 總 RNA 反應(yīng)得到cDNA。再將50 ng的cDNA用于qRTPCR。其中引物以300 nm的濃度加入到PCR反應(yīng)中。PCR反應(yīng)的所有其他組分來(lái)自SYBR Premix Ex TaqTM II試劑盒（TaKaRa，DRR820A）。用 ABI 7500系統(tǒng)（Applied Biosystems,USA）進(jìn)行 PCR反應(yīng)，然后進(jìn)行熔解曲線分析。使用閾值循環(huán)（Ct）值通過(guò)比較Ct方法評(píng)估具有不同處理和暴露時(shí)間的樣品中RNA表達(dá)的相對(duì)差異。通過(guò)使用3種不同的RNA樣品的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)，結(jié)果取平均值。

四、Western blot法測(cè)定自噬相關(guān)基因的蛋白水平

肝癌細(xì)胞SMMC-7721以1×105/cm2的密度接種到6孔培養(yǎng)板中，24 h后，加入不同濃度復(fù)方苦參注射液作用不同時(shí)間。按照RIPA蛋白裂解液的說(shuō)明書(shū)，于冰上提取肝癌細(xì)胞SMMC-7721蛋白，經(jīng)BCA法進(jìn)行蛋白定量后上樣，SDS-PAGE電泳對(duì)蛋白進(jìn)行分離，PVDF膜，轉(zhuǎn)膜條件為70 V，1 h，5%牛血清白蛋白封閉 1 h，加一抗 GAPDH（1:5 000）、LC3（1:3 000）、SQSTM1（1:10 000）4 ℃ 過(guò)夜，加二抗（羊抗兔 IgG 1:10 000）室溫孵育 1 h，TBST洗膜，用Biorad凝膠成像系統(tǒng)成像。以目的蛋白與內(nèi)參蛋白GAPDH吸光度值的比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

五、統(tǒng)計(jì)方法

運(yùn)用SPSS 20.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料以x±s表示，采用單因素方差分析（oneway ANOVA），兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、復(fù)方苦參注射液對(duì)細(xì)胞增殖的影響

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，復(fù)方苦參注射液對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖的抑制呈濃度依賴性。不同濃度的復(fù)方苦參注射液作用48 h后，0.5 mg/mL復(fù)方苦參注射液作用于SMMC-7721細(xì)胞的活力是對(duì)照組的92.0%，而1 mg/mL時(shí)是85.1%；2 mg/mL是對(duì)照組的59.3%，而4 mg/mL時(shí)僅為37.9%。方差分析結(jié)果顯示，不同濃度組與對(duì)照組的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05），見(jiàn)圖 1。

圖1 復(fù)方苦參注射液對(duì)SMMC-7721細(xì)胞活動(dòng)的影響（*與0 mg/mL 比較，P＜0.05）

二、復(fù)方苦參注射液對(duì)自噬相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

我們研究了復(fù)方苦參注射液對(duì)自噬相關(guān)基因MAP1LC3B及SQSTM1的轉(zhuǎn)錄水平的影響。根據(jù)MTT的結(jié)果，分別選取了1 mg/mL和2 mg/mL 2個(gè)劑量及6 h，12 h 2個(gè)時(shí)間點(diǎn)來(lái)提取RNA進(jìn)行RTPCR。與正常對(duì)照組比，復(fù)方苦參注射液處理后的SMMC-7721細(xì)胞MAP1LC3B及SQSTM1的轉(zhuǎn)錄水平均有增高，且呈劑量和時(shí)間依賴。相對(duì)來(lái)說(shuō)，MAP1LC3B增加的幅度更高，SQSTM1增加的幅度較小。方差分析結(jié)果顯示，不同濃度不同時(shí)間的數(shù)據(jù)間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖2和圖3。

三、復(fù)方苦參注射液對(duì)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

我們研究了復(fù)方苦參注射液對(duì)自噬相關(guān)蛋白MAPILC3B及SQSTM1表達(dá)水平的影響。為了和RT-PCR實(shí)驗(yàn)一致，分別選取了1 mg/mL和2 mg/mL 2個(gè)劑量及6 h，12 h 2個(gè)時(shí)間點(diǎn)來(lái)提取蛋白進(jìn)行Western blot。與正常對(duì)照組比，復(fù)方苦參注射液處理后的SMMC-7721細(xì)胞MAP1LC3B蛋白增高，無(wú)劑量和時(shí)間依賴。而SQSTM1蛋白呈劑量依賴的減少，和時(shí)間關(guān)系不明顯。方差分析結(jié)果顯示，不同濃度的數(shù)據(jù)間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖4。

圖2 復(fù)方苦參注射液對(duì)MAP1LC3B基因轉(zhuǎn)錄的影響（*與 0 h比較，P＜0.05）

圖3 復(fù)方苦參注射液對(duì)SQSTM1基因轉(zhuǎn)錄的影響（*與 0 h比較，P＜0.05）

圖4 復(fù)方苦參注射液對(duì)LC3及SOSTM1蛋白表達(dá)的影響

討 論

復(fù)方苦參注射液是由苦參和白茯苓經(jīng)過(guò)提取分離而成的注射劑，其主要成分為苦參堿、氧化苦參堿、槐定堿、氧化槐定堿等[4]。既往研究顯示的研究，苦參堿具有良好的抗人肝癌細(xì)胞增殖的作用[5-7]。本研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)方苦參注射液也能顯著抑制人肝癌細(xì)胞SMMC-7721的增殖，與文獻(xiàn)報(bào)道相符。但究竟是哪一種成分還是這些成分協(xié)同作用起到了抗腫瘤的作用，尚需進(jìn)一步研究。

正常生理狀態(tài)時(shí)，自噬在細(xì)胞中處于一個(gè)較低的基線水平，清除細(xì)胞內(nèi)受損或無(wú)功能的長(zhǎng)壽命蛋白質(zhì)和細(xì)胞器，將其消化為小分子物質(zhì)供細(xì)胞重新利用進(jìn)而維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)。過(guò)度激活的自噬則參與細(xì)胞死亡的過(guò)程，也就是說(shuō)當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)自噬后，如果過(guò)多的細(xì)胞器或蛋白質(zhì)進(jìn)入自噬小泡而被降解，細(xì)胞的功能就會(huì)嚴(yán)重受損出現(xiàn)不可逆的改變，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。LC3是參與自噬發(fā)生的關(guān)鍵基因，其表達(dá)產(chǎn)物包括LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ，當(dāng)自噬發(fā)生時(shí)，LC3-Ⅰ與磷脂酰乙醇胺結(jié)合形成LC3-Ⅱ，LC3含量與自噬活性密切相關(guān)，是自噬的標(biāo)志分子[8]。本文結(jié)果顯示，復(fù)方苦參注射液作用于人肝癌細(xì)胞SMMC-7721后，自噬相關(guān)基因LC3及SQSTM1轉(zhuǎn)錄明顯增加，蛋白LC3b－Ⅱ表達(dá)明顯上調(diào)，SQSTM1蛋白表達(dá)明顯下調(diào)。SQSTM1的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平是不一致的，但LC3才是金標(biāo)準(zhǔn)，SQSTM1是輔助標(biāo)準(zhǔn)，轉(zhuǎn)錄和表達(dá)不一致也是可能的。

綜上所述，復(fù)方苦參注射液可通過(guò)抑制人肝癌細(xì)胞SMMC-7721增殖并能誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。但復(fù)方苦參注射液抑制人肝癌細(xì)胞SMMC-7721增殖和細(xì)胞自噬之間有什么樣的信號(hào)通路在起作用，值得進(jìn)一步研究。

[1]Zhao Z,Fan H,Higgins T,et al.Fufang Kushen injection inhibits sarcoma growth and tumor induced hyperalgesia via TRPV1 signaling pathways[J].Cancer Lett,2014,355(2):232-241.

[2]Xu W,Lin H,Zhang Y,et al.Compound Kushen Injection suppresses human breast cancer stem-like cells by down-regulating the canonical Wnt/β-catenin pathway[J].JExp Clin Cancer Res,2011,30:103.

[3]Zhang S,Qi J,Sun L,et al.Matrine induces programmed cell death and regulates expression of relevant genes based on PCR array analysis in C6 glioma cells[J].Mol Biol Rep,2009,36(4):791-799.

[4]Wang W,You RL,Qin WJ,et al.Anti-tumor activitiesof activeingredientsin Compound Kushen Injection[J].Acta Pharmacol Sin,2015,36(6):676-679.

[5]Liu Y,Xu Y,Ji W,et al.Anti-tumor activities of matrine and oxymatrine:literaturereview[J].Tumour Biol,2014,35(6):5111-5119.

[6]Yu HB,Zhang HF,Li DY,et al.Matrine inhibits matrix metalloproteinase-9 expression and invasion of humanhepatocellular carcinomacells[J].JAsian Nat Prod Res,2011,13(3):242-250.

[7]雷娜,樊慧婷,李杰,等.苦參堿和氧化苦參堿對(duì)人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721凋亡的影響[J].國(guó)際中醫(yī)中藥雜志,2014,36(11):1017-1020.

[8]Mizushima N,Yoshimori T,Levine B.Methods in mammalian autophagy research[J].Cell,2010,140(3):313-326.