張楠，李江波，王惠玲，肖玲，魏艷艷，何靜，王高華,*

1. 引言

胃癌是臨床最常見的惡性腫瘤之一，胃癌合并抑郁癥的發(fā)病率高達27%～44%，遠遠高于其他癌癥，且其中往往女性癌癥患者抑郁癥的發(fā)生率要高于男性[1,2]。研究表明，抑郁的負性情緒可通過神經(jīng)內(nèi)分泌功能的紊亂和機體免疫功能的降低從而增加癌癥的發(fā)病率，促進腫瘤的進展，然而其具體機制尚未明確[3]。近年來，Nesfatin-1作為一種新發(fā)現(xiàn)的食欲抑制因子，在胃癌及抑郁癥的研究中得到了廣泛的關(guān)注，研究發(fā)現(xiàn)其在中樞及外周均有廣泛表達， 且不僅僅在抑制攝食中起重要作用，在癌癥及抑郁的發(fā)病中也發(fā)揮一定的作用[4-6]。

Nesfatin-1是日本學(xué)者OH-I在2006年新發(fā)現(xiàn)的食欲抑制因子，在攝食、糖代謝及能量平衡中具有重要作用，大鼠腦室注射Nesfatin-1后6 h內(nèi)NUCB2 mRNA的表達呈劑量依賴性降低，6 h內(nèi)大鼠采食量呈劑量依賴性減少，而再注射Nesfatin-1抗體Ab24后大鼠攝食恢復(fù)正常[7,8]。研究已發(fā)現(xiàn)Nesfatin-1在情緒調(diào)節(jié)及癌癥中具有重要作用。抑郁癥的臨床研究表明抑郁癥患者的血漿Nesfatin-1水平較正常對照組顯著升高，并且與HAM-D分數(shù)呈正相關(guān)[9]。我們研究組前期研究也表明，抑郁癥模型大鼠的血漿Nesfatin-1比正常大鼠顯著增高[4]。其他動物研究表明側(cè)腦室內(nèi)注射Nesfatin-1可明顯誘發(fā)大鼠的抑郁情緒，劑量依賴性的增加焦慮、恐懼樣行為，減少探索行為[10,11]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，伴有體重下降的中晚期肺癌患者血清Nesfatin-1濃度低于正常人及不伴有體重下降的肺癌患者[12]。Nesfatin-1可以通過mTOR和Rho/ROCK信號通路誘導(dǎo)細胞凋亡來抑制人卵巢癌細胞的增殖[13]。而我們研究組前期臨床研究發(fā)現(xiàn)胃癌合并抑郁癥患者的血漿Nesfatin-1濃度顯著降低，并與胃癌合并抑郁癥的發(fā)病、以及抑郁嚴重程度相關(guān)[5]。然而，該研究尚未在動物實驗中得到驗證，且具體機制尚未明確。本研究擬通過動物實驗來探索小鼠胃癌模型血漿及腦組織中Nesfatin-1水平及其在胃癌共病抑郁發(fā)病中的作用機制。

2. 材料與方法

2.1 實驗動物

近交系615小鼠18只，雌性，SPF級，平均體重18(2)g，6-7周齡，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病研究所。實驗動生產(chǎn)許可證：SCXK（津）2015-0001。實驗期間喂養(yǎng)于武漢大學(xué)人民醫(yī)院實驗動物房，自由供給標(biāo)準(zhǔn)飼料和清潔自來水，維持12 h光照: 12 h黑暗晝夜節(jié)律，室溫23-25℃，濕度為(55±10)%。所有操作均被武漢大學(xué)人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

2.2 主要試劑與材料

小鼠前胃癌細胞(MFC)購自中國科學(xué)院細胞庫。RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，胎牛血清購自杭州四季青公司，胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素均購自上海吉諾生物科技有限公司，小鼠 Nesfatin-1 Elisa試劑盒 (CEA242Mu)購自武漢優(yōu)爾生優(yōu)爾生科技發(fā)展有限公司,兔抗Nesfatin-1多克隆抗體購自Sigma公司,辣根過氧化物酶（HPR）標(biāo)記羊抗兔二抗購自Biosharp公司。

2.3 主要儀器

動物運動軌跡記錄分析儀（ethovision 3.0 Netherlands）、CO2培養(yǎng)箱（CB150 德國Binder）、超凈工作臺（AIRTECH）、倒置顯微鏡（IX51 日本奧林巴斯）、ChemiDoc Touch成像系統(tǒng)（Bio-Rad）。

2.4 動物分組

18只小鼠隨機分成3組，分別為正常對照組（NCG）、胃癌不合并應(yīng)激抑郁模型組（GCNS）、胃癌合并應(yīng)激抑郁模型組（GCS），每組6只。NCG普通飼養(yǎng)，GCNS組小鼠普通飼養(yǎng)5周后于皮下接種小鼠前胃癌細胞（MFC）建立皮下移植瘤模型1周，GCS組給以5周慢性不可預(yù)見應(yīng)激（CUMS）后，皮下接種MFC建立皮下移植瘤模型1周。

2.5 試驗方法

2.5.1 慢性不可預(yù)見性應(yīng)激（CUMS）

在Willner應(yīng)激的基礎(chǔ)上改進，GCS組接受包括禁食24小時，禁水24小時，隔離24小時，冰水（4℃）5分鐘，熱水（43℃）5分鐘，束縛10分鐘，震蕩10分鐘，夾尾1分鐘（夾子位置放置于距離小鼠尾尖末端1cm處）、潮濕24小時[4]。每天隨機抽取1-2種刺激，相同刺激不連續(xù)給以，7天為一個周期[14]。當(dāng)GCS與其他兩組行為差異有統(tǒng)計學(xué)意義時，表明抑郁模型小鼠成功建立。之后接種腫瘤，觀察1周。

2.5.2 腫瘤細胞體外培養(yǎng)與接種

小鼠胃癌細胞MFC以適量濃度接種于培養(yǎng)瓶中，加入RMPI-1640培養(yǎng)液（含10%胎牛血清，1%青、鏈霉素），置于5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔天換液一次，每3-4天傳代一次。傳代時加入0.2 ml胰蛋白酶及1.8 mlPBS消化30s，用含胎牛血清培養(yǎng)液吹打制成細胞懸液，離心后加PBS稀釋到（1x107/ml）的濃度接種。取MFC細胞懸液0.2 ml(含胃癌細胞2 x 106個),種植于GCNS組及GCS組小鼠背部皮下。

2.5.3 行為學(xué)檢測

(1)糖水偏好試驗：在造模前后均給以糖水消耗試驗。所有小鼠在實驗前給予 1%的蔗糖溶液（W/V）飲用24小時（每籠內(nèi)2個瓶子），隨后其中一瓶1%的蔗糖溶液被替換為正常飲用水飲用12小時，然后兩瓶水互換位置12小時，最后24小時內(nèi)禁食水。實驗開始時一個瓶子內(nèi)放置1%的蔗糖溶液、另一個放置正常飲用水，1小時之后兩個瓶子互換（消除小鼠對位置的單側(cè)偏好）。計算2 h蔗糖偏好值（%）=蔗糖溶液消耗量/總液體消耗 100%。(2)曠場試驗：曠場長50 cm，寬50 cm，高35 cm，底部被涂成灰白色，四壁白色透明，將小鼠緩慢放入曠場中心。Ethovision 3.0記錄和分析小鼠5分鐘內(nèi)的運動軌跡。(3)強迫游泳試驗：將小鼠放入圓柱形水桶（高50 cm，直徑20 cm，水深25 cm）中，溫度（25±2℃）[15]，進行6分鐘強迫游泳，在最后4分鐘記錄不動時間。

2.5.4 標(biāo)本采集與ELISA

行為學(xué)檢測結(jié)束后，將小鼠用1%戊巴比妥（35 mg/kg）腹腔麻醉。心臟取血后置于EDTA抗凝管，然后離心以獲得血漿樣本，置于-80℃超低溫冰箱保存。按照ELISA試劑說明書來測定血漿Nesfatin-1濃度。

2.5.5 Western Blot

心臟取血后立即斷頭取腦，在冰上快速剝離海馬及中腦。取適量腦組織加入RIPA蛋白裂解液，在冰上進行勻漿，提取組織總蛋白。BCA法檢測蛋白濃度后，加入上樣緩沖液，沸水浴10min使蛋白變性，取20ug總蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳（濃縮膠5%，分離膠10%），電泳結(jié)束后進行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜后將PVDF膜轉(zhuǎn)移至含5%脫脂奶粉的TBST封閉液中，在室溫搖床上封閉1h，TBST洗滌后將膜浸泡于一抗中（兔抗Nesfatin-1 1:1000稀釋），4℃搖床上孵育過夜后，TBST洗膜3次，每次10min,再孵育至HPR標(biāo)記的二抗中（1:10000稀釋），室溫孵育1h，洗膜后用ECL化學(xué)發(fā)光法進行曝光顯影，蛋白條帶經(jīng)Image lab軟件進行灰度值分析，Nesfatin-1/GAPDH灰度值比即表示Nesfatin-1的相對表達量。

2.5.6 剝?nèi)×鼋M織

取腦后剝?nèi)×鼋M織，稱重 。

2.6 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)用SPSS 19.0處理。用Kolmogorov Smirnov檢驗測量測量數(shù)據(jù)的正態(tài)性。符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)的形式用X(S）來表示。兩組間比較采用獨立樣本T檢驗，三組間及以上比較采用單因素方差分析(多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗)。以p＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3. 結(jié)果

3.1 行為學(xué)檢測結(jié)果

造模前，三組體重、糖水偏好試驗之間未見顯著性差異（F=0.11,p=0.896；F=0.78,p=0.476）（表1）。在GCNS及GCS造模結(jié)束后，GCS組體重增量、水平距離、直立次數(shù)顯著低于GCNS組（t=-3.39,p＜0.001;t=-2.50,p=0.025;t=-2.61,p=0.02），且GCS、GCNS兩組均低于NCG組(GCS&NCG:t=-6.33,p＜0.001;t=-5.87,p＜0.001;t=-5.59,p＜0.001;GCNS&NCG:t=-2.94,p=0.01t=-3.38,p=0.004;t=-2.98,p=0.009)；GCS組不動時間長于GCNS組與NCG組(t=2.56,p=0.022;t=3.84,p=0.002)，而GCNS組與NCG組相比僅有增高的趨勢，并無顯著性差異（t=1.27,p=0.222）（表2）。

3.2 血漿、海馬及中腦Nesfatin-1表達及瘤重在各組間的比較

血漿、海馬及中腦Nesfatin-1濃度NCG組與GCS組顯著高于GCNS組(NCG&GCNS:t=3.46,p=0.003;t=4.58,p＜0.001;t=4.18,p=0.001; GCS&GCNS:t=6.04,p＜0.001;t=8.84,p＜0.001;t=8.16,p＜0.001)，而 GCS 組血漿、海馬及中腦Nesfatin-1濃度顯著高于正常對照組(t=2.58,p=0.021;t=4.26,p=0.001;t=3.97,p=0.001)（見圖2，表3）。而GCS組與GCNS組相比，瘤重沒有顯著性差異(t=-0.301,p=0.770)。

圖1. 流程圖

表1. 造模前小鼠行為學(xué)評價 (X±S)

表2. 造模后小鼠行為評價(X±S)

圖1. 3組小鼠在海馬、中腦蛋白表達條帶圖

4 討論

4.1 主要發(fā)現(xiàn)

本研究發(fā)現(xiàn)，GCS組的小鼠表現(xiàn)出抑郁狀態(tài)(探究活動減少、運動遲緩、行為絕望狀態(tài))與人抑郁癥中的精神運動改變、興趣或快感喪失一致。Nesfatin-1無論在中腦、海馬還是血漿中，GCS組顯著高于NCG組和GCNS組，且GCNS組顯著低于NCG組，提示Nesfatin-1在癌癥及癌癥共病應(yīng)激抑郁的發(fā)病中具有一定作用。

GCNS組小鼠曠場實驗也與NCG組小鼠有顯著差異，可能是由于胃癌引起的神經(jīng)內(nèi)分泌紊亂導(dǎo)致癌性疲乏出現(xiàn)。Nesfatin-1無論在中腦、海馬還是血漿中，GCS組顯著高于NCG組和GCNS組，且GCNS組顯著低于NCG組，這表明Nesfatin-1在癌癥及癌癥共病抑郁癥的發(fā)病中具有一定意義。

與本研究組前期研究既往CUMS慢性應(yīng)激所致的抑郁大鼠血漿中Nesfatin-1水平升高一致，說明慢性應(yīng)激所致的抑郁狀態(tài)與血漿Nesfatin-1水平相關(guān)[4]。本研究GCNS組小鼠曠場實驗也與NCG組小鼠有顯著差異，可能是由于胃癌引起的神經(jīng)內(nèi)分泌紊亂導(dǎo)致癌性疲乏有關(guān)，也不排除癌癥共病抑郁的可能。然而，我們研究組前期臨床研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)胃癌合并抑郁癥患者的血漿Nesfatin-1濃度顯著降低，推測其原因為該臨床研究胃癌患者多為進展期胃癌，其病理狀態(tài)有可能打破了抑郁與Nesfatin-1之間的關(guān)系[5]，而這一結(jié)果與本研究GCNS組的結(jié)果相一致，這是巧合還是胃癌因素本身也可以導(dǎo)致共病抑郁且不僅僅患胃癌這一應(yīng)激因素可以導(dǎo)致共病抑郁呢？原因也可能是由于本研究的Nesfatin-1如果在胃癌合并抑郁小鼠和胃癌患病同時受到狀態(tài)是由應(yīng)激所致抑郁，這與胃癌所致的情緒障礙的作用機制不同，是非常值得深入研究的。GCNS組血漿Nesfatin-1顯著低于NCG組，與之前研究結(jié)果一致，可能是由于癌癥往往導(dǎo)致攝食量下降，體重降低，體內(nèi)脂肪組織減少，而脂肪組織中表達Nesfatin-1，是循環(huán)Nesfatin-1的來源之一[5,16]，這可能導(dǎo)致胃癌組中Nesfatin-1降低。本研究GCNS組體重增量低于NCG，提示有這種可能性，但是GCNS體重增量高于GCS。應(yīng)激不僅阻止了胃癌小鼠Nesfatin-1水平的降低，反而使其升高，所以單用脂肪量的多少來解釋它對Nesfatin-1的影響還不確切，還有待進一步研究。有研究證明NUCB2/Nesfatin-1可以通過LKB1、AMPK/TORC1/ZEB通路促進結(jié)腸癌細胞遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[17]。Yoo等研究發(fā)現(xiàn)Nesfatin-1能通過自分泌的方式誘導(dǎo)前列腺癌細胞的轉(zhuǎn)移[18]。本研究GCNS組中樞和周圍Nesfatin-1下調(diào)可能也對防止轉(zhuǎn)移具有保護意義，然而，有研究證實Nesfatin-1可以通過mTOR和Rho/ROCK信號通路誘導(dǎo)細胞凋亡來抑制人卵巢癌細胞株HO-8910細胞的增殖[13]。這樣說來胃癌導(dǎo)致的Nesfatin-1下調(diào)不利于抑制癌細胞增殖，說明它在胃癌發(fā)生發(fā)展中也可能起一定作用。在我們的研究中，GCS組中樞和外周Nesfatin-1的顯著升高，有可能會導(dǎo)致癌細胞侵襲和遷移。然而，我們造模的時間相對較短，卻并沒有發(fā)現(xiàn)有癌癥轉(zhuǎn)移，而且兩組瘤重也沒有顯著性差異，是否應(yīng)激導(dǎo)致的Nesfatin-1升高也對抑制癌瘤增殖有益值得進一步研究。

表3. 血漿、腦組織Nesfatin-1及瘤重在各組間的水平(X±S)

研究表明Nesfatin-1在中腦中縫核5-羥色胺（5-HT）及去甲腎上腺素（NE）存在共表達[6]。Yoshida等認為Nesfatin-1可激活對應(yīng)激敏感的中縫核內(nèi)的5-HT神經(jīng)元和藍斑中NE能神經(jīng)元，從而刺激室旁核的促皮質(zhì)激素釋放激素（CRF）神經(jīng)元，激活HPA軸，有研究表明HPA軸紊亂可能與癌癥患者抑郁、焦慮情緒的發(fā)生有關(guān)[19,20]。前期臨床研究表明，胃癌共病抑郁患者體內(nèi)血漿皮質(zhì)醇明顯高于胃癌不伴抑郁組患者，胃癌不伴抑郁組明顯低于健康組，與本研究中腦及血漿中Nesfatin-1的變化趨勢一致，這進一步表明了Nesfatin-1可能通過5-HT、NE及HPA軸參與胃癌及胃癌共病抑郁的發(fā)病[5]。有研究表明，3周內(nèi)連續(xù)腹腔內(nèi)注射Nesfatin-1導(dǎo)致大鼠海馬和PFC中的BDNF蛋白的表達減少，而本研究結(jié)果也表明在CUMS所致的胃癌合并應(yīng)激抑郁小鼠海馬中Nesfatin-1的表達增高，這些結(jié)果表明，Nesfatin-1能夠減少動物模型的探索行為和誘發(fā)焦慮樣行為，其機制可能與海馬中BDNF蛋白有關(guān)[11]。

4.2 研究局限

本研究有以下局限性：(a)樣本量較小，均為雌性，無法得出Nesfatin-1在胃癌共病抑郁的作用中是否具有性別差異性,實驗結(jié)果還需進一步驗證研究。(b)由于實驗條件限制，我們在造模前后分別使用了不同的行為學(xué)指標(biāo)測量，因此無法比較造模前后行為學(xué)的變化。(c)本研究僅設(shè)立了正常對照組、胃癌不伴應(yīng)激組、胃癌伴應(yīng)激組，而沒有設(shè)立單純抑郁組，因此難以證明胃癌伴應(yīng)激組及單純抑郁組中Nesfatin-1的變化，需進一步深入研究。

4.3 研究意義

綜上所述，本研究表明中腦、海馬及血漿Nesfatin-1在胃癌合并應(yīng)激抑郁癥或不合并應(yīng)激抑郁的小鼠模型中均有改變，這表明其在胃癌共病應(yīng)激及抑郁和胃癌的發(fā)病中均具有一定作用，這對癌癥及其共病應(yīng)激抑郁的發(fā)病研究提供了一個新的線索，臨床上癌癥共病抑郁的患病率較高[21]，胃癌是一種危及生命的疾病，癌癥本身就是重大的應(yīng)激因素，那么癌癥共病抑郁是癌癥的病理所致還是應(yīng)激因素的結(jié)果，臨床難以鑒別，本研究那么Nesfatin-1在GCNS和GCS的不同變化是否可以作為鑒別癌癥共病應(yīng)激性抑郁還是非應(yīng)激抑郁的標(biāo)志物，給今后研究提供了參考，然而Nesfatin-1與癌癥共病抑郁的因果關(guān)系及其作用機制尚未明確，還需進一步的深入研究。

資金來源

國家自然科學(xué)基金(81571325)。

利益沖突

所有作者聲明與該論文無相關(guān)利益沖突。

倫理審批

所有操作均被武漢大學(xué)人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

作者貢獻

張楠負責(zé)本研究的設(shè)計和執(zhí)行，包括后期數(shù)據(jù)的統(tǒng)計和文章撰寫；王惠玲、肖玲為文章提供修改意見；魏艷艷、何靜參與本研究動物的飼養(yǎng)及取材；王高華、李江波為研究的設(shè)計及文章撰寫提供意見和修改。

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