李小靜 李志鋒 韓昭 燕霞 李顯平 劉保國(guó) 劉志軍056002河北邯鄲，河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科

皮膚鱗狀細(xì)胞癌（簡(jiǎn)稱鱗癌）組織中生長(zhǎng)抑制和DNA損傷誘導(dǎo)45蛋白α（growth arrest and DNA damage inducible 45α，Gadd45α）表達(dá)升高，且高分化組織中表達(dá)高于低分化癌組織，推測(cè)Gadd45α異常表達(dá)可能參與鱗癌發(fā)病過(guò)程［1］。為進(jìn)一步探討Gadd45α在皮膚鱗癌中參與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的作用，我們利用小RNA干擾技術(shù)下調(diào)皮膚鱗癌細(xì)胞株A431細(xì)胞Gadd45α基因表達(dá)，從而觀察Gadd45α對(duì)A431細(xì)胞侵襲和遷移等生物學(xué)行為的影響。

一、材料與方法

1.Trizol、G418產(chǎn)自美國(guó)Invitrogen公司，A431、Colon16細(xì)胞產(chǎn)自美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心（ATCC），兔抗人Gadd45α多克隆抗體為美國(guó)Santa Cruz公司產(chǎn)品，實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒產(chǎn)自美國(guó)Promega公司，CytoSelect 24孔細(xì)胞移行試驗(yàn)試劑盒為美國(guó)Cell Biolabs公司產(chǎn)品，Transwell小室為美國(guó)Corning公司產(chǎn)品。

2.細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染：皮膚鱗癌細(xì)胞株A431細(xì)胞、Colon16細(xì)胞均采用含10%胎牛血清的Dulbecco極限必需培養(yǎng)基（Dulbecco′s minimum essential medium，DMEM），培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2。選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于24孔板，按照Lipofectamine2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū)轉(zhuǎn)染操作。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后繼續(xù)孵育48 h后接種于培養(yǎng)瓶。利用1 000 mg/L G418篩選2周。將篩選的細(xì)胞接種形成克隆，在尚未發(fā)生融合時(shí)，熒光顯微鏡下用刮刀挑取克隆，繼續(xù)培養(yǎng)于含G418（500 mg/L）的培養(yǎng)基中。

3.引物設(shè)計(jì)：在基因庫(kù)中查找Gadd45α基因序列，用Primer zpremier5.0軟件設(shè)計(jì)引物，使用核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)檢索程序排除其他的可能同源序列。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。上游引物：5′?GCGTCCAACAATGA GACCTACTG?3′，下游引物：5′?GGCAAAGCCCAAGACAACG GAGA?3′，目的產(chǎn)物302 bp。

4.siRNA序列設(shè)計(jì)：用美國(guó)Ambion公司和德國(guó)Qiagen公司的siRNA設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)4條siRNA序列（表1），由南京金斯特公司合成雙鏈siRNA編碼序列。將A431細(xì)胞隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組：實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染Gadd45α?siRNA，陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA，空白對(duì)照組不做任何處理。

5.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)A431細(xì)胞、Colon16細(xì)胞及A431細(xì)胞轉(zhuǎn)染后Gadd45α mRNA的表達(dá)水平：應(yīng)用Trizol試劑提取各細(xì)胞總RNA，測(cè)定總RNA質(zhì)量和濃度，A260/A280比值在1.9～2.1之間為合格，各樣本取大致等量的總RNA，按說(shuō)明書(shū)推薦條件將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR擴(kuò)增目的基因片段，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性2 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)30次，最后72℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定凝膠紫外線成像儀下觀察、拍照，檢驗(yàn)各電泳條帶的灰度值，計(jì)算Gadd45α與β肌動(dòng)蛋白灰度比值。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

6.Western印跡檢測(cè)A431、Colon16細(xì)胞株及A431細(xì)胞轉(zhuǎn)染后Gadd45α蛋白表達(dá)：分別提取各細(xì)胞總蛋白，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌細(xì)胞后，加入預(yù)冷的蛋白裂解液，收集上清液，提取細(xì)胞總蛋白，Brodford法測(cè)定蛋白含量。取70 μg蛋白上樣進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS?PAGE）垂直電泳、聚亞乙烯雙氧化物（PVDF）轉(zhuǎn)膜，加入一抗（兔抗人Gadd45α抗體）、二抗（辣根過(guò)氧化物酶羊抗兔抗體，1∶5 000），X線曝光、顯影及定影，用各抗體灰度值與3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）灰度值的比值代表各目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。所有內(nèi)參均使用β肌動(dòng)蛋白。每組樣本各重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

7.Transwell實(shí)驗(yàn)測(cè)定轉(zhuǎn)染對(duì)A431細(xì)胞侵襲能力的影響：先在每個(gè)Transwell小室的多聚碳酸酯膜上鋪人工基底膜膠（Matrigel），制成人工基底膜。分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，胰蛋白酶消化后，以無(wú)血清培養(yǎng)基調(diào)整濃度為0.6×106/ml，將Transwell小室置入24孔板中，加入無(wú)血清培養(yǎng)基，室溫放置2 h，在小室外部加入含10%血清的培養(yǎng)基500 μl，棄去小室內(nèi)部的無(wú)血清培養(yǎng)基，加入300μl細(xì)胞懸液，孵育48 h后，將小室置入含500 μl染液的培養(yǎng)孔中染色20 min，干燥后顯微鏡下計(jì)數(shù)高倍（×200）視野下穿過(guò)小室的細(xì)胞數(shù)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

8.細(xì)胞劃痕法測(cè)定轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞的遷移能力：制備轉(zhuǎn)染前后A431單層細(xì)胞，用10 μl移液槍槍頭在單層細(xì)胞上呈“一”字劃痕，用PBS清洗3次，孵育24 h后換成含10%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液孵育24 h，吸去培養(yǎng)液，用PBS清洗3次，高倍鏡下計(jì)數(shù)遷移到劃痕區(qū)的細(xì)胞數(shù)目。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

9.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用以±s表示，作方差齊性檢驗(yàn)，采用方差分析統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，組間比較采用LSD?T檢測(cè)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 針對(duì)Gadd45α基因的轉(zhuǎn)染序列

二、結(jié)果

1.Gadd45α在兩種皮膚鱗癌細(xì)胞株中的表達(dá)：Gadd45α基因在A431和Colon16細(xì)胞中均有表達(dá)，表達(dá)水平分別為0.985±0.017和0.480±0.016；Gadd45α蛋白在2株細(xì)胞中均有表達(dá)（圖1），表達(dá)水平分別為0.433±0.035和0.070±0.021。因此后續(xù)研究選取高表達(dá)Gadd45α基因和蛋白的A431細(xì)胞。

2.siRNA抑制Gadd45α mRNA的表達(dá)：實(shí)時(shí)PCR顯示，陰性對(duì)照組Gadd45α mRNA表達(dá)水平為1.028±0.183，空白對(duì)照組為1.001±0.057，實(shí)驗(yàn)組siRNA?1干擾組表達(dá)水平為0.286± 0.013，siRNA?2干擾組為0.553±0.042，siRNA?3干擾組為0.484±0.027，siRNA?4干擾組為0.683± 0.015，siRNA?1干擾效果最好，故作為實(shí)驗(yàn)組。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=5 893.857，P＜0.001），實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001）。

3.siRNA抑制Gadd45α蛋白的表達(dá)：Western印跡檢測(cè)顯示，實(shí)驗(yàn)組條帶明顯變窄（0.33±0.007），與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組（0.87±0.002、0.86±0.004）比較，3組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2 763.000，P＜0.001）；組間比較顯示，實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001）。見(jiàn)圖2。

4.A431細(xì)胞體外侵襲能力的變化：Transwell小室實(shí)驗(yàn)顯示（圖3），培養(yǎng)48 h后，每高倍視野下遷移穿過(guò)聚碳酸酯膜的細(xì)胞數(shù)實(shí)驗(yàn)組為66.33±3.79，陰性對(duì)照組為26.00±4.36，空白對(duì)照組為28.33±4.16，3組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=20.084，P=0.002）；組間兩兩比較顯示，實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值分別為0.001、0.002）。

圖1 皮膚鱗癌細(xì)胞株A431和Colon16細(xì)胞Gadd45α蛋白表達(dá)

圖2 免疫印跡法檢測(cè)siRNA干擾后A431細(xì)胞Gadd45α蛋白表達(dá)

圖3 Transwell小室實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)siRNA干擾后A431細(xì)胞侵襲和遷移能力

5.細(xì)胞劃痕損傷實(shí)驗(yàn)：?jiǎn)螌蛹?xì)胞劃痕24 h后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞遷移數(shù)為315.33±6.66，陰性對(duì)照組154.67±2.08，空白對(duì)照組130.67±3.51，3組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1676.255，P＜0.001）；組間比較顯示，實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值為0.001）。見(jiàn)圖3。

三、討論

Gadd45在腫瘤細(xì)胞中參與多種細(xì)胞信號(hào)通路的調(diào)控，其表達(dá)缺失與腫瘤形成及進(jìn)展密切相關(guān)。Gadd45α是Gadd45家族新近發(fā)現(xiàn)的一類細(xì)胞功能調(diào)節(jié)基因，參與多種惡性腫瘤細(xì)胞侵襲過(guò)程的調(diào)節(jié)［2］，該基因最早在紫外線照射和甲磺酸甲酯處理的倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，隨后研究認(rèn)為，放射線、氧化應(yīng)激、無(wú)血清饑餓等損傷因素會(huì)增加Gadd45α的表達(dá)［3］。Gadd45α基因在乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)水平較正常組織中的表達(dá)均下調(diào)，并且在前列腺癌中也發(fā)現(xiàn)其表達(dá)被抑制［4?7］。Gadd45α基因在惡性涎腺腫瘤中低表達(dá)可能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的惡性增殖［8］。因此認(rèn)為，Gadd45α是一個(gè)腫瘤抑制因子，在多種惡性腫瘤中呈低表達(dá)的趨勢(shì)，過(guò)表達(dá)該基因能夠抑制癌細(xì)胞的遷移與侵襲［9］。

為了明確Gadd45α基因表達(dá)異常是否通過(guò)影響鱗癌細(xì)胞的侵襲過(guò)程來(lái)參與皮膚鱗癌的惡性生物學(xué)行為，我們利用高表達(dá)Gadd45α的A431細(xì)胞株作為研究對(duì)象，通過(guò)轉(zhuǎn)染siRNA的方式來(lái)下調(diào)Gadd45α基因的表達(dá)，進(jìn)而檢測(cè)細(xì)胞的侵襲和遷移能力。轉(zhuǎn)染Gadd45α siRNA后，A431細(xì)胞株中Gadd45α蛋白含量和mRNA含量均顯著降低，說(shuō)明轉(zhuǎn)染siRNA能夠有效降低Gadd45α的表達(dá)。進(jìn)一步采用Transwell小室和細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染A431細(xì)胞侵襲和遷移能力的變化。結(jié)果顯示，干擾Gadd45α表達(dá)后，A431細(xì)胞侵襲能力明顯增強(qiáng)。說(shuō)明Gadd45α在皮膚鱗癌中可能起到抑制腫瘤侵襲的作用。

綜上，皮膚鱗癌A431細(xì)胞株高表達(dá)Gadd45α基因與蛋白水平，下調(diào)A431細(xì)胞Gadd45α表達(dá)能夠促進(jìn)癌細(xì)胞侵襲與遷移，但Gadd45α對(duì)皮膚鱗癌的抑制作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

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