閔現(xiàn)東 ，高 遠(yuǎn) ，錢長照 ，趙衛(wèi)光 ，劉 建

（1.費(fèi)縣國有塔山林場，山東 費(fèi)縣 273400；2.山東省水土保持與環(huán)境保育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/臨沂大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，山東 臨沂 276005；3.臨沂市科學(xué)探索實(shí)驗(yàn)室，山東 臨沂 276037）

鵝耳櫪屬植物為第三紀(jì)始新世古老殘遺種，在植物系統(tǒng)發(fā)育、古植物區(qū)系、瀕危機(jī)制和生物多樣性等方面有著較高研究價(jià)值[1-2]。陳貝貝等基于ITS序列曾分析了天臺山4種鵝耳櫪屬植物的進(jìn)化關(guān)系[3]，蒙山鵝耳櫪(Carpinus Mengshanensis)是 1991 年梁書賓和趙法珠[4]發(fā)表的新種，已被《山東植物精要》和中國數(shù)字植物標(biāo)本館收錄，但并未被中國植物志收錄，

植物中nrDNA為高度重復(fù)串聯(lián)序列，由于其轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS進(jìn)化速度快且片段長度不大，以及協(xié)調(diào)進(jìn)化的緣故，導(dǎo)致大多數(shù)物種中這些重復(fù)單元已發(fā)生純合或接近純合，在植物個體內(nèi)和群體間均具有高度均質(zhì)性，因此nrDNA ITS已被廣泛用于被子植物科內(nèi)以及屬內(nèi)、種內(nèi)系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的研究[5-8]，將具有細(xì)胞核遺傳特點(diǎn)的ITS序列用于鑒定植物物種是進(jìn)化遺傳學(xué)研究的熱點(diǎn)之一[9-12]。本研究分析蒙山鵝耳櫪和鵝耳櫪(Carpinus turczaninowii)ITS序列，以期為蒙山鵝耳櫪的鑒定以及與鵝耳櫪的親緣關(guān)系提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 樣品

試驗(yàn)所用蒙山鵝耳櫪和鵝耳櫪的植物材料均取自蒙山，每種均選取5株獨(dú)立植株，植株長勢良好且無病蟲害，植株間距約500 m，海拔高度約800 m，2015年10月選取新鮮枝葉封裝后冷凍保存。

1.2 DNA提取

采用改良的CTAB法[13]從蒙山鵝耳櫪和鵝耳櫪的葉片中提取植物總DNA。

(1)首先選擇有效的植物材料3 g，用液氮研磨成粉，將粉末轉(zhuǎn)移至裝有18 mL 65℃預(yù)熱的2×CTAB緩沖液的50 mL離心管中，混勻。置于65℃水浴90分鐘，期間不時(shí)搖動。

(2)取出離心管，冷卻至室溫后加入等體積的苯酚：氯仿：異戊醇(25：24：1)，輕輕震蕩混勻至少 20分鐘。室溫離心6000 rpm，15分鐘。

(3)將上層水相轉(zhuǎn)移至另一個干凈的50 mL離心管中，加入等體積的氯仿：異戊醇(24：1)輕輕震蕩混勻至少20分鐘。室溫離心6000 rpm，15分鐘。

(4)同樣將上層水相轉(zhuǎn)移至另一個干凈的50 mL離心管中，加入等體積的異丙醇，混勻。-20℃放置30分鐘或更長時(shí)間，沉淀DNA。

(5)4℃離心6000 rpm，15分鐘，小心倒掉上清液，不要把DNA沉淀倒出來。

(6)將DNA轉(zhuǎn)移至1.5 mL的離心管中，用75%的乙醇洗滌重懸沉淀，4℃離心12000 rpm，2分鐘，倒掉上清。重復(fù)2次。

(7)吸凈乙醇后，室溫晾干DNA沉淀。加入大約500 μL TE緩沖液，溶解 DNA。同時(shí)加入 5 μL RNase A，37℃消化RNA 15分鐘。

(8)-20℃保存溶解后的DNA，備用。

1.3 PCR

1.3.1 引物設(shè)計(jì)ITS P1：5’-AACAAGGTTTCCGTAGGTGA-3’ITS P2：5’-TATGCTTAAATTCAGCGGGT-3’

1.3.2 PCR反應(yīng)體系(50 μL)

ddH2O，32 μL；10×KOD buffer，5 μL；MgSO4(25 mM)，3 μL；dNTPs(2 mM)，5 μL；正向引物(10 μM)，1 μL；反 向引物(10 μM)，1 μL；KOD plus(5 U/μL)，1 μL；模板 DNA，2 μL

1.3.3 PCR反應(yīng)程序

94℃，2 min；98℃，10 s；55℃，30 s；68℃，1 min；擴(kuò)增循環(huán)數(shù)：32；68℃，10 min；4℃，保存。

1.3.4 DNA回收

(1)在紫外燈下，將含有目的DNA片段的瓊脂糖凝膠切下，放進(jìn)1.5 mL離心管，估算切下的凝膠塊重量。

(2)加入3倍膠體積的DE-A溶液，混合后在75℃加熱，每隔幾分鐘顛倒混勻，直到凝膠完全融化(約 10 min)。

(3)加0.5個DE-A溶液體積的DE-B溶液，混合均勻。

(4)吸取上一步中的混合溶液轉(zhuǎn)移到DNA制備管中，12000 g離心1 min，棄濾液。

(5)將制備管放回2.0 mL離心管中，加500 μL W1溶液，12000 g離心1 min，棄濾液。

(6)將制備管放回2.0 mL離心管中，加700 μL W2溶液，12000 g離心1 min，棄濾液。重復(fù)1次。

(7)將制備管放回2.0 mL離心管中，12000 g離心1 min。

(8)將制備管放到新的1.5 mL離心管中，在制備膜上加30 μL ddH2O，室溫靜止1 min，12000 g離心1 min洗脫DNA。

1.4 測序

DNA片段回收以后直接送到Invitrogen公司測序，測序引物為：

1.5 主要儀器設(shè)備

NanoDrop 2000分光光度計(jì)(Thermo Fisher，USA)、C1000 Thermal Cycler 基因擴(kuò)增儀 (BIO-RAD)、Sub-Cell GT cell核酸電泳槽 (BIO-RAD)、DYY-7C型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、Molecular Imager凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD)、CENTRIFU GE 5810R高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf)、CENTRIFU GE 5417R高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf)，Thermo Scientific Legend Micro 17 微量臺式離心機(jī)。

2 結(jié)果與分析

2.1 ITS序列

2.1.1 鵝耳櫪ITS序列

2.1.2 蒙山鵝耳櫪ITS序列

我們將采集的野外鵝耳櫪與蒙山鵝耳櫪樣品通過DNA提取、PCR、DNA回收和DNA測序，實(shí)測鵝耳櫪與蒙山鵝耳櫪ITS序列均為601個堿基序列，兩者間有1個堿基差別。

2.1.3 蒙山鵝耳櫪ITS與NCBI數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果

我們將實(shí)測蒙山鵝耳櫪ITS序列導(dǎo)入NCBI數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行比對，結(jié)果顯示蒙山鵝耳櫪ITS序列與Carpinus sp.Wen 9187(編號 EJ011711729.1)序列相似度為100%，與同屬近緣種鵝耳櫪序列相似度為99%。

3 結(jié)論與討論

本研究以采自蒙山的兩種鵝耳櫪屬植物鵝耳櫪和蒙山鵝耳櫪為材料，克隆到了各自的ITS序列，盡管兩種植物都來自5個不同樣點(diǎn)，但每種植物來自各樣點(diǎn)的ITS序列完全相同，這表明了同一物種在地理分布與親緣關(guān)系的一致性。

鵝耳櫪與蒙山鵝耳櫪ITS測序結(jié)果顯示，兩物種ITS序列高度相似，601個堿基序列中只有1個堿基差別。將蒙山鵝耳櫪ITS序列導(dǎo)入NCBI數(shù)據(jù)庫，比對后發(fā)現(xiàn)，蒙山鵝耳櫪ITS序列與Carpinus sp.Wen 9187(編號 EJ011711729.1)序列相似度為100%，與同屬近緣種鵝耳櫪序列相似度為99%。蒙山鵝耳櫪是獨(dú)立物種，建議《中國植物志》以及電子數(shù)據(jù)庫承認(rèn)其新種地位并進(jìn)行收錄。蒙山鵝耳櫪的分布區(qū)[4,14]不僅限于蒙山，韓國也可見其分布，表明其不再屬山東特有物種[15]。

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