張彬彬，趙曉雨，張凱倫，徐后娟，夏曉明

山東農(nóng)業(yè)大學，植物保護學院，山東 泰安 271000

煙草赤星?。ˋlternɑriɑ ɑlternɑtɑ(Fries)Keissler）是煙草生長中、后期發(fā)生的一種重要的真菌性葉斑類病害，在世界各煙草產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生[1-2]。該病潛伏期短、發(fā)病快，在外部條件適宜時，短時間內(nèi)便可造成大面積流行，給煙葉生產(chǎn)帶來巨大經(jīng)濟損失[3]?；瘜W防治是該病主要防治措施，由于殺菌劑的長期使用，煙草赤星病菌的抗藥性問題越來越嚴重[4]。多項研究表明，煙草赤星病菌已對菌核凈、甲基硫菌靈和腐霉利等表現(xiàn)出不同程度的抗性[5-7]。

嘧菌酯（azoxystrobin）是甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑（QoIs類）的典型代表[8]。主要作用于細胞色素b的Qo中心，阻斷電子從細胞色素b轉(zhuǎn)移到細胞色素c1，阻止ATP的產(chǎn)生，干擾真菌線粒體呼吸，從而抑制真菌生長或殺死真菌[9-11]。由于其作用位點單一，殺菌劑抗性委員會（FRAC）將其歸為高抗性風險農(nóng)藥[12]。隨著嘧菌酯的推廣應用，出現(xiàn)了多例田間病原菌對嘧菌酯產(chǎn)生抗性的報道。黃瓜霜霉病菌[13]、番茄葉霉病菌[14]和果樹灰霉病菌[15]均已對嘧菌酯產(chǎn)生了不同程度的抗性。

真菌體內(nèi)存在旁路氧化途徑，當真菌的正常呼吸被QoIs類殺菌劑抑制后，能夠誘導啟動旁路氧化途徑獲取能量，從而導致病原真菌對QoIs類殺菌劑敏感性降低或不敏感[16-17]。水楊肟酸（salicylhydroxamic acid，SHAM）是旁路氧化酶的專一性抑制劑，可抑制旁路氧化酶活性從而使旁路氧化途徑無法正常進行。在使用QoIs類殺菌劑過程中，水楊肟酸可能會增強QoIs類殺菌劑對病原真菌的抑菌效果[18]。在離體條件下，添加一定濃度的水楊肟酸能夠顯著提高多種植物病原真菌對QoIs類殺菌劑的敏感性[19-20]。但不同病原菌對添加水楊肟酸后的敏感性存在明顯差異[21-23]，且同一病原菌不同菌株對添加水楊肟酸后的敏感性差異也較大[24]。已有研究表明添加水楊肟酸能提高嘧菌酯對煙草赤星病菌的毒力[25-26]，但這些研究所采用的菌株數(shù)量相對較少，供試菌株均來自于貴州地區(qū)，不同煙草赤星病菌對添加水楊肟酸后的敏感性是否存在差異尚不明確。本研究擬采用菌絲生長速率法，檢測從山東和湖北煙區(qū)采集的33株煙草赤星病菌對嘧菌酯的敏感性，研究添加水楊肟酸對煙草赤星病菌對嘧菌酯敏感性的影響，以期為不同煙區(qū)應用嘧菌酯防治煙草赤星病提供參考。

1 材料與方法

1.1 病原菌采集和培養(yǎng)

供試的山東煙草赤星病菌菌株分離自2016年采集于青島、濰坊、臨沂和日照等煙區(qū)的發(fā)病煙葉。參照方中達[27]的組織分離法在實驗室進行赤星病菌的分離和純化。病菌單孢純化后置于4 ℃ 條件下保存?zhèn)溆?。湖北菌株由山東省煙草病蟲害研究中心提供。

1.2 供試藥劑

用萬分之一電子天平分別準確稱取95%嘧菌酯（山東濰坊潤豐化工股份有限公司）和99%水楊肟酸（上海麥克林生化科技有限公司）各1.0526 g和1.0101 g，分別溶于丙酮和甲醇中，配成10000 mg·L-1的母液，備用。

1.3 試驗方法

1.3.1 藥液配制

在預試驗的基礎上，將嘧菌酯按有效成分含量分別設定 5、10、20、40、80、160、320 mg·L-17 個系列質(zhì)量濃度處理。用含有0.1%吐溫80的水溶液將嘧菌酯母液分別稀釋至上述設計濃度的10倍濃度（即50、100、200、400、800、1600和3200 mg·L-1），備用。

1.3.2 含藥PDA培養(yǎng)基的制備

在超凈工作臺中，將預先融化、滅菌的90 mL馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基加入已滅菌錐形瓶中，冷卻至45 ℃，然后用移液槍分別加入1.3.1中配好的各處理藥液10 mL，充分搖勻后等量倒入直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中，制備成相應濃度的含藥PDA平板。以不含藥劑的0.1%的吐溫80水溶液處理作空白對照。

1.3.3 煙草赤星病菌對嘧菌酯的敏感性測定

采用菌絲生長速率法測定煙草赤星病菌對嘧菌酯的敏感性。先將煙草赤星病菌在PDA培養(yǎng)基上活化7 d，然后在超凈工作臺內(nèi)，用內(nèi)徑為7.0 mm的滅菌打孔器從菌落邊緣打取菌餅，并用接種器將菌餅接種于1.3.2中制備好的含藥平板中央，菌絲面朝下，蓋上皿蓋，放入28℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)黑暗培養(yǎng)。每處理4個重復。連續(xù)培養(yǎng)7 d 后，用直尺采用十字交叉法垂直測量各處理菌落直徑各1次，求其平均值，減去7.0 mm菌餅直徑，即為菌落增長直徑。測量每個重復試驗結果，然后求出每個處理濃度的菌落增長直徑平均值，并計算每個處理對病原菌的菌絲增長抑制率。

菌絲增長抑制率（%）=[（對照菌落生長直徑-處理菌落生長直徑）/對照菌落生長直徑]×100

1.3.4 水楊肟酸協(xié)同下煙草赤星病菌對嘧菌酯的敏感性測定

參照上述方法在PDA培養(yǎng)基上采用菌絲生長速率法測定加入水楊肟酸的煙草赤星病菌對嘧菌酯的敏感性。根據(jù)預備試驗結果選定水楊肟酸的協(xié)同作用濃度為100 mg·L-1。然后參照1.3.1和1.3.2描述的方法配制含100 mg·L-1水楊肟酸的嘧菌酯系列濃度的PDA平板。水楊肟酸協(xié)同嘧菌酯的最終試驗濃度（有效成分含量）為 5、10、20、40、80、160 和 320 mg·L-1。然后按照1.3.3描述的方法測定水楊肟酸協(xié)同下煙草赤星病菌對嘧菌酯的敏感性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計分析軟件，以藥劑濃度對數(shù)值為橫坐標，菌絲增長抑制率幾率值為縱坐標，進行回歸分析，求出殺菌劑對病原菌的EC50、相關系數(shù)、回歸方程以及95%置信限。

2 結果與分析

2.1 煙草赤星病菌對嘧菌酯敏感性測定

采用菌絲生長速率法測定了33株煙草赤星病菌對嘧菌酯的敏感性，結果表明（表1，表3），嘧菌酯對供試煙草赤星病菌毒力的EC50值介于60.5230～111.7918 mg·L-1， EC50平 均 值 為 83.9068±2.4339 mg·L-1。 其中，山東沂南菌株YN-02對嘧菌酯最敏感（EC50為60.5230 mg·L-1），山東諸城菌株ZC-01敏感性最低（EC50為 111.7918 mg·L-1），兩者相差 0.85倍。嘧菌酯對山東菌株毒力的EC50值介于60.5230～111.7918 mg·L-1，平均為 82.7986±2.5515 mg·L-1；對湖北菌株毒力的 EC50值介于 61.5468～110.6608 mg·L-1，平均為88.0230±6.6785 mg·L-1。

2.2 水楊肟酸協(xié)同作用下煙草赤星病菌對嘧菌酯敏感性測定

采用菌絲生長速率法測定了水楊肟酸協(xié)同作用下33株煙草赤星病菌對嘧菌酯的敏感性，結果（表2，表3）表明，在100 mg/L 水楊肟酸協(xié)同作用下，嘧菌酯對33株煙草赤星病菌菌絲生長的毒力均顯著增強。EC50值介于 19.9090～35.6684 mg·L-1，平均為29.2007±0.7801 mg·L-1，與不添加水楊肟酸相比，毒力提高了0.70～2.98倍，平均提高了1.87倍。其中對山東沂水的YS-07菌株的增效作用最明顯，毒力提高了2.98倍，對山東沂南的YN-02菌株的增效作用最低，毒力提高了0.70倍。

在100 mg/L水楊肟酸協(xié)同作用下，嘧菌酯對山東省煙草赤星病菌的EC50值介于19.9090～35.6684 mg·L-1，平均為 28.5494±0.8914 mg·L-1，毒力平均提高了1.90倍；對湖北省煙草赤星病菌的EC50值介于26.2377～35.2025 mg·L-1，平均為 31.6197±1.3290 mg·L-1，毒力平均提高了1.78倍。

表1 煙草赤星病菌對嘧菌酯的敏感性Tab.1 The sensitivities of Alternɑriɑ ɑlternɑtɑ to azoxystrobin

表3 煙草赤星病菌對嘧菌酯及其添加水楊肟酸后的敏感性比較Tab.3 The sensitivity of Alternɑriɑ ɑlternɑtɑ to azoxystrobin in the presence or absence of SHAM

3 討論與結論

黃艷飛等研究表明[26]，嘧菌酯對煙草赤星病菌具有較好的室內(nèi)活性，嘧菌酯抑制病原菌菌絲生長的EC50值為25.8300 mg·L-1。但隨后研究又發(fā)現(xiàn)，嘧菌酯抑制4株煙草赤星病菌菌絲生長的EC50值介于129.6～278.2 mg·L-1， 平 均 為 203.95 mg·L-1[25]。 雷 飛斌[7]研究發(fā)現(xiàn)，嘧菌酯抑制2株煙草赤星病菌菌絲生長的EC50值分別為88.178和172.912 mg·L-1。本研究在離體條件下，采用菌絲生長速率法，檢測了采自山東和湖北兩省的33株煙草赤星病菌對嘧菌酯的敏感性。結果表明，嘧菌酯對供試煙草赤星病菌 的 EC50值 介 于 60.5230～111.7918 mg·L-1，EC50平均值為83.9068±2.4339 mg·L-1， 嘧菌酯對煙草赤星病菌具有一定的菌絲生長抑制活性。與前人研究結果相比，供試33株煙草赤星病菌對嘧菌酯相對較為敏感。

水楊肟酸能夠通過抑制病原菌的旁路氧化途徑而增強QoIs類殺菌劑對部分病原真菌的抑菌效果，但對部分病原真菌的增加效果不明顯[22-23]。研究表明，煙草赤星病菌中同樣存在線粒體電子傳遞的旁路氧化途徑，加入旁路氧化途徑專性抑制劑水楊肟酸，能顯著增強嘧菌酯對煙草赤星病菌的毒力[25-26]。本研究發(fā)現(xiàn)，加入100 mg·L-1水楊肟酸后，嘧菌酯對33株煙草赤星病菌菌絲生長的毒力均顯著增強，EC50值介于19.9090～35.6684 mg·L-1，毒力提高了 0.70～2.98 倍，平均提高了1.87倍，表現(xiàn)明顯的增效作用，但不同菌株對嘧菌酯加入水楊肟酸的敏感性差異較大。韓路等[24]發(fā)現(xiàn)，加入100 mg·L-1水楊肟酸后，在供試的91個水稻稻瘟病菌中，有78.02%的菌株對嘧菌酯的敏感性增強，但只有31.87%的菌株增效倍數(shù)大于1.5倍，表現(xiàn)明顯增效效果，這種差異可能與不同菌株的旁路氧化酶活性有關[24]。

事實上，嘧菌酯對煙草赤星病菌的孢子萌發(fā)和菌絲生長均有抑制活性，但對孢子萌發(fā)的抑制活性要高于菌絲生長[25-26,28]。因此，田間施用嘧菌酯對煙草赤星病可能同時表現(xiàn)出保護和治療活性，且可能保護作用要優(yōu)于治療作用[26]。在離體條件下，由于培養(yǎng)基平板上沒有抑制病原菌旁路呼吸代謝途徑的物質(zhì)，減弱了嘧菌酯對煙草赤星病菌菌絲生長的活性[25]。而在植物體內(nèi)存在抑制旁路氧化酶（AOX）的（類）黃酮類物質(zhì)，因此嘧菌酯在植物體上的實際活性要高于室內(nèi)活性，并具有優(yōu)良的防治效果[28]。

本研究結果表明，可以將水楊肟酸與嘧菌酯結合應用于田間煙草赤星病的防治。但本研究結果均是采用菌絲生長速率法獲得的結果，后續(xù)仍需采用孢子萌發(fā)法進行全面驗證，并通過離體葉片試驗和田間試驗證明嘧菌酯對煙草赤星病的治療和保護作用。此外，將嘧菌酯和水楊肟酸結合應用于煙草赤星病的田間防治技術，有待于進一步研究。

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