余 瑛，劉志云，余 磊，魯秀敏

(重慶理工大學 藥學與生物工程學院， 重慶 400054)

蛋白質(zhì)是現(xiàn)代分子生物學中最重要的研究對象之一。蛋白質(zhì)研究過程中通常需要通過紫外分析、同位素標記、酶標記等方法進行跟蹤檢測，過程繁瑣。熒光蛋白由于檢測方便且不影響蛋白質(zhì)生物學活性，在分子生物學領域得到越來越廣泛的應用，如在基因功能鑒定中用于基因定位[1-2]、基因調(diào)節(jié)[3-4]、蛋白質(zhì)相互作用[5]研究等，在醫(yī)藥研發(fā)中用于腫瘤檢測[6-8]、藥物篩選[9-10]等。熒光蛋白通常需要特定波長的光源激發(fā)才能發(fā)出熒光，檢測過程仍需要依賴昂貴的儀器。

mRuby2由斯坦福大學的Lin等[11]設計，是最明亮的單體紅色熒光蛋白之一。在雙熒光報告系統(tǒng)中利用Clover 和mRuby2替換CFP和YFP，可顯著提高檢測的靈敏性[11-12]。mRuby2作為熒光標記還用于觀察真核活細胞遷移過程以及蛋白質(zhì)在細胞中的分布、轉(zhuǎn)移等現(xiàn)象[13]。

最近研究發(fā)現(xiàn)，熒光蛋白mRuby2能在原核系統(tǒng)中高效表達，產(chǎn)生穿透力極強的紅色熒光。這種熒光蛋白在活細胞中的表達及體外純化過程都能在日光下直觀地呈現(xiàn)，方便隨時對目的蛋白進行跟蹤檢測。本研究構(gòu)建了mRuby2的原核表達菌株，觀察了該基因在大腸桿菌中隨誘導時間表達水平發(fā)生變化的過程，采用Ni親和層析對mRuby2編碼的重組紅色熒光蛋白進行了純化。mRuby2編碼的紅色熒光蛋白在表達及純化過程中均呈現(xiàn)出極好的可視性和指示性，特別適合作為生化、分子生物學實驗教學和蛋白標記的候選基因。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株及質(zhì)粒

菌株DH5α、BL21(DE3)，質(zhì)粒pET30a(+)、pcDNA3-mRuby2由本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑

限制性內(nèi)切酶BamHI、EcoRI，T4 DNA 連接酶、LA Taq DNA聚合酶、DNA 分子量marker 100 bp Ladder、DL2000購自TaKaRa 公司；蛋白質(zhì)分子量標準購自碧云天生物技術有限公司；DNA片段瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、PCR 產(chǎn)物純化試劑盒、IPTG 等購自 Omega生物技術有限公司。Ni親和層析預裝柱購自上海生工生物工程有限公司。

1.1.3 主要溶液

① LB液體培養(yǎng)基:NaCl 5 g/L,酵母提取物5 g/L,胰蛋白胨 10 g/L，滅菌備用。

② LB固體培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基中加入1.5%瓊脂，滅菌備用。

③ 卡拉霉素溶液：30 mg/mL，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌。

④ 細胞裂解液:50 mmol/L Tris-HCl (pH值為8.0)，0.1mol/L NaCl，0.1 mmol/L PMSF。

⑤ 平衡溶液:50 mmol/L Tris-HCl (pH值為8.0)，0.1 mol/L NaCl。

⑥ 50 mmol/L咪唑溶液:50 mmol/L Tris-HCl (pH值為8.0)，0.1 mol/L NaCl,50 mmol/L咪唑。

⑦ 200 mmol/L咪唑溶液:50 mmol/L Tris-HCl (pH值為8.0)，0.1 mol/L NaCl，200 mmol/L咪唑。

1.1.4 主要設備

PCR儀、電泳儀、蛋白純化儀。

1.2 方法

1.2.1大腸桿菌DH5α，BL21(DE3)感受態(tài)細胞的制備

采用CaCl2法[14]制備DH5α，BL21(DE3)感受態(tài)細胞。

1.2.2pET30a(+)-mRuby2原核表達載體的構(gòu)建

1) 引物設計和合成

根據(jù)載體pcDNA3-mRuby2序列和pET30a(+)多克隆位點信息，利用Primer5.0設計了一對特異引物F1、R1，兩條引物上下游分別帶有BamHI或EcoRI識別的酶切位點，引物序列見表1。

表1 PCR引物

2) mRuby2基因片段的獲得

mRuby2基因片段采用PCR方法獲得，擴增反應體系如下：引物F1(10 μmol/L) 2 μL，R1(10 μmol/L) 2 μL，LA DNA polymerase 1u，10×LA Reaction Buffer 5 μL，dNTP(2.5 μmol/L)2 μL，pcDNA3-mRuby2(2 ng/μL)1 μL，加超純水至50 μL。反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s,57 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s，35個循環(huán);72 ℃ 5 min。反應結(jié)束后，進行瓊脂糖凝膠電泳，用膠回收試劑盒純化目的基因片段。

3) pET30a(+)與 mRuby2的酶切處理

質(zhì)粒pET30a(+)及回收后的mRuby2分別用BamHI和EcoRI進行雙酶切處理，然后回收純化。酶切體系為：pET30a(+) 4 μg (或全部回收后的mRuby2)，EcoRI(15 U/μL)0.5 μL，BamHI(15 U/μL)0.5 μL，10×H buffer 2 μL，加超純水至20 μL。37 ℃，1 h孵育后，在1.5%瓊脂糖凝膠中進行電泳，用膠回收試劑盒回收酶切片段。

4) 連接與轉(zhuǎn)化

經(jīng)酶切、回收處理后的pET30a(+)、mRuby2按以下體系進行連接：pET30a(+)(60 ng/μL) 1μL，mRuby2 (20 ng/μL) 1 μL，T4DNA ligase (350 u/μL) 1 μL，10×T4DNA ligase buffer 1 μL，加超純水至10 μL。16 ℃連接1 h，然后用CaCl2法轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化液涂布含有卡拉霉素的LB平板，37 ℃倒置培養(yǎng)。

1.2.3 pET30a(+)-mRuby2重組子的鑒定

1) 菌落PCR鑒定

從轉(zhuǎn)化平板上挑取轉(zhuǎn)化子，制成菌懸液作為PCR反應模板。按本文1.2.2節(jié)PCR反應條件進行擴增。擴增完成后，進行電泳檢測。

2) 酶切鑒定

取PCR結(jié)果呈陽性的克隆接種于含有卡拉霉素的LB液體培養(yǎng)基，200 r/min，37 ℃過夜培養(yǎng)。提取質(zhì)粒，進行酶切。酶切體系為：質(zhì)粒DNA 2 μg，EcoRI(15 U/μL)0.5 μL，BamHI(15 U/μL)0.5 μL，10×H buffer 2 μL，加超純水至20 μL。37℃，1 h孵育，電泳，觀察酶切結(jié)果。

1.2.4 mRuby2蛋白的誘導表達

取PCR及酶切驗證均為陽性的質(zhì)粒測序。測序正確的pET30a(+)-mRuby2質(zhì)粒以CaCl2法轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細胞。次日，挑取轉(zhuǎn)化子接種含有卡拉霉素的LB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)至OD600=0.8時加入終濃度為1 mmol/L的IPTG進行表達誘導，間隔1 h收集菌液，比較觀察不同誘導時間菌液顏色的變化。并于熒光顯微鏡下觀測mRuby2熒光蛋白表達情況。用SDS-PAGE電泳[14]分析不同誘導時間目的蛋白表達的情況。

1.2.5 鎳螯合親和層析法純化mRuby2蛋白

1) 細胞裂解液的制備

將1 L誘導后的菌液離心，收集菌體。按細菌濕重∶細胞裂解液(g/g)=1∶5加入裂解液，重懸細胞。用超聲法破碎細胞，條件為：功率400 W，超聲3 s，間隔2 s，重復180次；4 ℃，16 000 r/min， 15 min離心收集裂解上清；裂解上清用微孔濾膜過濾，冰上放置。

2) Ni親和層析純化目的蛋白

用5倍介質(zhì)體積的平衡溶液平衡層析柱上樣，使細胞裂解液隨流動相進入層析柱；用5倍介質(zhì)體積的平衡溶液平衡層析柱，洗去未與介質(zhì)結(jié)合的雜質(zhì)；用5倍介質(zhì)體積的50 mmol/L咪唑溶液洗柱去除非特異結(jié)合的雜蛋白；用10倍介質(zhì)體積的200 mmol/L咪唑洗脫目標蛋白，按每管 1 mL收集所有流出液，保存?zhèn)溆?。純化過程流速為15 mL/h。用SDS-PAGE檢測mRuby2蛋白純化情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 pET30a(+)-mRuby2重組質(zhì)粒的構(gòu)建

采用PCR方法以pcDNA3-mRuby2質(zhì)粒為模板成功擴增出了mRuby2基因片段(見圖1)，其相對分子質(zhì)量大小為730 bp。分別將mRuby2與pET30a(+)用BamHI和EcoRI進行酶切，然后連接、轉(zhuǎn)化，在轉(zhuǎn)化平板上挑取5個轉(zhuǎn)化子進行菌落PCR鑒定，1#、2#、5#克隆呈陽性(圖2(a)，選取1#、2#克隆培養(yǎng)提取質(zhì)粒進行酶切，產(chǎn)物中均含有大小為730 bp的目的條帶(圖2(b))，結(jié)果顯示1#、2#均呈陽性。

1.PCR擴增的mRuby2片段; M.DL2000

1～5.轉(zhuǎn)化子的PCR擴增產(chǎn)物； M.DL2000(a) 菌落PCR鑒定結(jié)果

1～2.BamHI、EcoRI雙酶切處理重組質(zhì)粒； M.DL2000(b) pET30a(+)-mRuby2重組質(zhì)粒的酶切

2.2 pET30a(+)-mRuby2/BL21DE3的培養(yǎng)與mRuby2蛋白的表達

用1#克隆的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21DE3，獲得pET30a(+)-mRuby2/BL21DE3菌株。培養(yǎng)pET30a(+)-mRuby2/BL21DE3至OD600達到0.8時加入IPTG誘導目的蛋白表達，間隔1 h收集菌液。觀察發(fā)現(xiàn)隨著誘導時間的增加，發(fā)酵液的顏色逐漸轉(zhuǎn)紅、加深(圖3(a))。誘導后的菌液離心獲得的菌體呈較深的粉紅色(圖3(b))，在熒光顯微鏡下觀察可見菌體整體出現(xiàn)極強的紅色熒光(圖3(c))，提示mRuby2基因在BL21DE3中得到成功表達。

取不同誘導時間發(fā)酵菌液的裂解上清進行SDS-PAGE電泳，結(jié)果提示目的蛋白濃度隨誘導時間延長表達量增加，誘導4～6 h表達水平達到峰值，與發(fā)酵液的顏色變化一致(見圖4)。

2.3 mRuby2蛋白的純化

將1 L誘導6 h的發(fā)酵液進行離心，收集mRuby2/BL21DE3菌體，經(jīng)超聲裂解、離心、微孔過濾獲得裂解上清。因mRuby2插入pET30a(+)后帶有his-tag，可以用Ni親和層析方法純化目的蛋白。目的蛋白吸附到Ni親和柱上使介質(zhì)由藍綠色(圖4(a1))轉(zhuǎn)變?yōu)樽霞t色(圖4(a2))，隨著咪唑溶液對目的蛋白洗脫，含有目的蛋白的紅色洗脫液流出，親和柱中的介質(zhì)又重新恢復呈藍綠色。

圖4 不同誘導時間mRuby2蛋白表達情況的檢測

圖5 Ni螯合親和層析純化目的蛋白

在進行鎳螯合親和層析純化目的蛋白的過程中，用50 mmol/L咪唑洗脫時，收集到的溶液為淺紅色，用200 mmol/L咪唑洗脫時，初期流出液顏色呈較深的枚紅色，然后顏色逐漸變淺，最后至無色。SDS-PAGE電泳結(jié)果(圖4(b))顯示50 mmol/L咪唑洗脫的流出液中目的蛋白較少，200 mmol/L咪唑洗脫液中含有大量的目的蛋白，純度在80%以上。結(jié)果表明：純化過程中流出液顏色的變化與目的蛋白濃度變化一致，說明mRuby2編碼的熒光蛋白其顏色艷麗、可視，對純化過程具有很好的指示作用。

3 討論

在高校生物化學、分子生物學的實驗教學中,基因的克隆、重組表達載體構(gòu)建、目的蛋白在宿主細胞中的表達及純化常常作為經(jīng)典的實驗項目開設。在有限的課時內(nèi)，要達到較好的教學效果,就要求實驗過程要易于操作、省時且結(jié)果直觀。

mRuby2是目前已知的發(fā)光強度最大的紅色熒光蛋白之一。在LB液體培養(yǎng)基中，接種大腸桿菌BL21(DE3)/pET30a(+)-mRuby2，37 ℃誘導培養(yǎng)后，發(fā)酵菌液呈橙紅色，離心沉淀的菌體在日光下就可以顯現(xiàn)為明顯的紅色，與轉(zhuǎn)入空載質(zhì)粒的BL21(DE3)/pET30a(+)比較有明顯差異。

在Ni親和層析實驗中，超聲破碎、離心后得到的含有重組mRuby2蛋白的裂解液上清為粉紅色。當帶有His-tag的重組mRuby2蛋白隨流動相進入固相時，能清晰地觀察到mRuby2重組蛋白吸附在固相上，使層析柱中的Ni親和介質(zhì)逐漸由藍綠色變?yōu)槊导t色，這一過程中流出的穿柱液顏色幾乎無色。隨著咪唑溶液的加入，流出液的顏色變?yōu)榧t色，目的蛋白得到洗脫。將收集的裂解液上清、穿柱液、洗脫液進行SDS-PAGE電泳，凝膠染色，觀察目的蛋白條帶的含量。結(jié)果提示層析過程中流動相、固相顏色的變化規(guī)律與SDS-PAGE檢測的結(jié)果一致。因此，mRuby2蛋白不僅可以作為理想的原核表達報告基因，而且在實驗教學中能明確、直觀地顯示目的基因表達的情況。在課時有限時，可以直接根據(jù)發(fā)酵液或裂解液上清的顏色，判斷目的蛋白的存在，也可與菌落PCR鑒定，SDS-PAGE等常規(guī)方法配合使用，相互印證。

本文所建立的實驗方案包括了完整的mRuby2基因克隆，重組子鑒定，目的蛋白表達、純化等過程，涉及PCR、酶切、連接、轉(zhuǎn)化、微生物培養(yǎng)、顯微觀察、超聲破碎、SDS-PAGE、親和層析等實驗操作,目測顏色變化可以與常規(guī)實驗方法相互結(jié)合，使學生能直觀地觀察實驗結(jié)果,便于對實驗方法、原理進行正確理解和掌握。本文建立的研究內(nèi)容和方法為生物化學實驗、分子生物學實驗等實踐教學提供了一個很好的教學參考方案。

[1] JAMES E R,DAVID M C.A PAL1 Gene Promoter-Green Fluorescent Protein Reporter System to Analyse Defence Responses in Live Cells of Arabidopsis thaliana[J].European Journal of Plant Pathology,2003,109(1):83-94.

[2] GRIMALDI B,DE RAAF M A,FILETICI P.Agrobacterium-mediated gene transfer and enhanced green fluorescent protein visualization in the mycorrhizal ascomycete Tuber borchii:a first step towards truffle genetics[J].Current Genetics.2005,48(1):69-74.

[3] VAN R P,BRAND A H.Imaging into the future:visualizing gene expression and protein interactions with fluorescent proteins[J].Nature Cell Biology.2002,4 (1):E15-20.

[4] CHO J H,EOM S H,AHNN J.Analysis of calsequestrin gene expression using green fluorescent protein in Caenorhabditis elegans[J].Molecules And Cells,1999,9 (2):230-234.

[5] DUNN A R,FRY B A,LEE T Y,et al.Transformation of Phytophthora capsici with genes for green and red fluorescent protein for use in visualizing plant-pathogen interactions[J].Australasian Plant Pathology,2013,42(5):583-593.

[6] KAN Zuxing,LIU Tajen.Video microscopy of tumor metastasis:using the green fluorescent protein (GFP) gene as a cancer-cell-labeling system[J].Clinical & Experimental Metastasis.1999,17(1):59-66.

[7] HOFFMAN R M.Use of fluorescent proteins and color-coded imaging to visualize cancer cells with different genetic properties[J].Cancer and Metastasis Reviews,2016,35(1):5-19.

[8] YAMAMOTO N,TSUCHIYA H.Tumor imaging with multicolor fluorescent protein expression[J].International Journal of Clinical Oncology,2011,16(2):84-91.

[9] LYU Fengting,LIU Libing,WANG Shu.Logic-signal output of fluorescent proteins for screening antibiotic combinations[J].Science China Chemistry,2014,57(12):1696-1702.

[10] CHEN Feng,TU Jiaojiao,LIANG Caishuang,et al.Fluorescent drug screening based on aggregation of DNA-templated silver nanoclusters,and its application to iridium (III) derived anticancer drugs[J].Microchimica Acta,2016,183(5):1571-1577.

[11] LAM A J,ST-PIERRE F,GONG Y,et al.Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins[J].Nat Methods， 2012,9(10):1005-1012.

[12] BAJAR B T,WANG E S,LAM A J,et al.Improving brightness and photostability of green and red fluorescent proteins for live cell imaging and FRET reporting[J].Sci Rep，2016(6):20889.

[13] KER D F E,SHARMA R,WANG E T H,et al.Development of mRuby2-Transfected C3H10T1/2 Fibroblasts for Musculoskeletal Tissue Engineering[J].PLoS One， 2015,10(9):e0139054.

[14] 奧斯伯.精編分子生物學實驗指南[M].北京：科學出版社，2008.