楊暉，柯樂芹，舒若男，陳雨薇，朱婷瑜，王俊，范錦濤，汪亮亮

（麗水學(xué)院生態(tài)學(xué)院，浙江麗水323000）

食用菌多糖不僅在抗氧化、抗腫瘤和抗病原體等方面有顯著作用[1-2]，還是一種很好的免疫調(diào)節(jié)增強(qiáng)劑[3]。近年來，食用菌多糖在抗氧化和抗腫瘤方面的研究越來越受到關(guān)注[4-8]。然而，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，食用菌多糖的含量和生物活性會(huì)發(fā)生變化。張佳欣[9]指出，茯磚茶中多糖的抗氧化能力隨著貯藏年限的增加先升后降，并在第3年達(dá)到最佳。

HepG2細(xì)胞是廣泛應(yīng)用于癌癥機(jī)制、遺傳學(xué)和營養(yǎng)學(xué)等研究的一類細(xì)胞株，其分化程度高，具有相對(duì)正常肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的表型，還能夠行使正常肝細(xì)胞的代謝解毒功能，分泌正常肝細(xì)胞特征的蛋白[9-10]。此外，HepG2細(xì)胞増殖能力強(qiáng)，易于獲得且多次傳代后仍能保持原有的生理狀態(tài)，可被用作替代肝細(xì)胞的理想細(xì)胞系[11]。過氧化氫（H2O2）是氧氣的二電子還原產(chǎn)物，是一種氧化性很強(qiáng)的活性氧[12]，可以穿透大部分細(xì)胞膜，增加細(xì)胞毒性，如乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase,LDH）滲漏顯著，脂質(zhì)過氧化，DNA損傷增加及還原型谷胱甘肽（glutathione reduced,GSH）水平降低[13]，而且還有易于獲得、性質(zhì)比較穩(wěn)定等特點(diǎn)；因此，H2O2氧化損傷模型已成為目前應(yīng)用最廣泛的一種細(xì)胞損傷模型[14]。

之前人們對(duì)于食用菌多糖的研究主要側(cè)重于提取、純化和分離[5-6,15-17]，而很少涉及不同貯藏時(shí)間對(duì)食用菌多糖提取率和多糖生物活性影響的研究。因此，本文以香菇、杏鮑菇和黑木耳為研究對(duì)象，初步研究不同貯藏時(shí)間對(duì)食用菌多糖提取率的影響，并建立H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞氧化損傷模型對(duì)HepG2細(xì)胞預(yù)保護(hù)再損傷，從細(xì)胞學(xué)的角度探究不同貯藏時(shí)間對(duì)食用菌多糖抗氧化活性的影響，為合理確定不同食用菌貯藏年限提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

3種試驗(yàn)材料香菇808、黑木耳916和杏鮑菇kE015均由浙江百興食品有限公司提供。

1.1.2 細(xì)胞與試劑

人肝癌HepG2細(xì)胞系購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、青霉素/鏈霉素雙抗溶液、0.25%胰蛋白酶[含0.5%乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA）]及磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution,PBS）購自美國GIBICO公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁研究所；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、丙二醛（malondialdehyde,MDA）和乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；其余藥品、試劑均為國產(chǎn)，分析純。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 食用菌多糖的提取

設(shè)置3×4雙因子試驗(yàn)，即3種食用菌材料（香菇808、杏鮑菇kE015、黑木耳916）、4種貯藏時(shí)間（1、2、3和4年），每組試驗(yàn)重復(fù)3次。食用菌多糖含量的提取采用超聲輔助復(fù)合酶法[17]。

具體步驟為：稱取3.00 g食用菌干粉，加入60 mL蒸餾水混合均勻，進(jìn)行超聲波細(xì)胞破碎（超聲工作5 s，間隙5 s，超聲波功率720 W，總工作時(shí)間20 min）后，置于50℃水浴0.5 h；稱取果膠酶和纖維素酶，按料液比1∶21.17、復(fù)合酶比1.96∶1加入食用菌溶液中，反應(yīng)1 h后抽濾，濾液于沸水中滅酶10 min，溫度降至室溫后，將酶提取液于5 000 r/min條件下離心5 min，取上清液，于75℃、0.09 Pa條件下濃縮到總上清液體積的2/5～1/2；加入3倍體積的95%乙醇溶液，置于4℃冰箱中靜置24 h后，取出，以4 000 r/min離心20 min；將沉淀溶解、定容、稀釋后，采用蒽酮-硫酸法測(cè)定多糖總量。

1.2.2 食用菌多糖對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞存活率影響的測(cè)定[18-21]

設(shè)置3×4×4三因子試驗(yàn)，即：3種食用菌材料（香菇808、杏鮑菇kE015和黑木耳916）；4種貯藏時(shí)間（1、2、3和4年）；給藥組（4種食用菌多糖提取物終質(zhì)量濃度為0.25、0.5、1和2 mg/mL的完全培養(yǎng)液）；H2O2誘導(dǎo)的對(duì)照組（加入完全培養(yǎng)液）。每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。

望虞河常熟水利樞紐于2010年11月起開始實(shí)施更新改造工作，改造工程于2011年3月10日前完成。改造期間常熟水利樞紐泵站無法正常投入運(yùn)用，僅能通過節(jié)制閘自引。望虞河望亭水利樞紐更新改造工程于2010年11月28日正式開工。根據(jù)施工期工程運(yùn)行維護(hù)要求，望亭水利樞紐需開展水下檢查暫停運(yùn)用。同時(shí)，施工期間望亭水利樞紐閘門也無法全部投入運(yùn)用。

具體操作參照CCK-8試劑盒的說明書進(jìn)行。將HepG2細(xì)胞以6×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板上，培養(yǎng)24 h后，換成含有食用菌多糖提取物，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，經(jīng)PBS洗滌2次后加入60 μmol/L H2O2培養(yǎng)液作用2 h；根據(jù)CCK-8法測(cè)定各組的細(xì)胞存活率。

1.2.3 食用菌多糖對(duì)H2O2氧化損傷的HepG2細(xì)胞中SOD、MDA、LDH水平影響的測(cè)定[19,21-23]

設(shè)置3×4×3三因子試驗(yàn)，即：3種食用菌材料（香菇808、杏鮑菇kE015和黑木耳916）；4種貯藏時(shí)間（1、2、3和4年）；正常對(duì)照組（加入完全培養(yǎng)液）；模型組（H2O2誘導(dǎo)組，加入完全培養(yǎng)液）；給藥組（食用菌多糖質(zhì)量濃度為0.5、1和2 mg/mL）。每組3個(gè)重復(fù)。

酶活性的測(cè)定參照SOD、MDA和LDH試劑盒的說明書進(jìn)行，具體操作方法如下。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞按5×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板上，按上述設(shè)置的試驗(yàn)分組培養(yǎng)24 h；將苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF）加入細(xì)胞裂解液中，使裂解液中的PMSF最終濃度為1 mmol/L；將各組細(xì)胞消化收集到EP管中，2 000 r/min離心5 min，然后放入冰盒；棄上清液，再加入1 mL PBS，離心以去除胰酶；每管加入100 μL裂解液，渦旋混勻；于4℃、1×104g條件下離心5 min，取上清液用于各類酶活性的測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用單因素方差分析（one-way ANOVA）和因子方差分析（factorial ANOVA）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性分析，采用STATISTICA 8.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，顯著性水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同貯藏時(shí)間對(duì)食用菌多糖提取率的影響

由圖1和表1可知：香菇多糖的提取率最高[貯藏3年的提取率為（6.92±0.18）%]，杏鮑菇多糖次之，黑木耳多糖的提取率最低，且不同食用菌類型的多糖提取率存在顯著差異（P＜0.05）；不同貯藏時(shí)間對(duì)香菇、杏鮑菇多糖提取率的影響沒有顯著差異，但貯藏1年的黑木耳多糖提取率[（2.61±0.73）%]和貯藏3年的黑木耳多糖提取率[（1.72±0.09）%]之間差異達(dá)顯著水平（P＜0.05）。

圖1 不同貯藏時(shí)間的食用菌粗多糖的提取率Fig.1 Extraction rate of polysaccharide from edible fungi at different storage time

表1 食用菌類型、貯藏時(shí)間及兩者的交互作用對(duì)食用菌多糖提取率的影響Table 1 Effects of edible fungi variety,storage time and their interaction on extraction rate of polysaccharides from edible fungi

2.2 不同貯藏時(shí)間的食用菌多糖對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響

由圖2A可知，隨著質(zhì)量濃度的增加，香菇多糖對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響總體呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)。而杏鮑菇和黑木耳多糖對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)（圖2B和2C）。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，香菇多糖在0.25 mg/mL時(shí)對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)，但在高質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響變化不大。貯藏時(shí)間為3年、4年的香菇多糖在質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL時(shí)，HepG2細(xì)胞存活率最低；貯藏時(shí)間為2年、3年的杏鮑菇多糖對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響最為明顯，均和對(duì)照存在顯著差異（P＜0.05），其中以貯藏時(shí)間為3年、多糖質(zhì)量濃度為1 mg/mL處理組的HepG2細(xì)胞存活率最高，為（99.37±8.23）%，是對(duì)照組 HepG2細(xì)胞存活率[（51.98±7.10）%]的1.91倍，表明杏鮑菇多糖可以有效降低經(jīng)H2O2誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞產(chǎn)生的氧化損傷作用。黑木耳多糖組的HepG2細(xì)胞存活率受貯藏時(shí)間變化的影響并不明顯，但不同多糖質(zhì)量濃度間存在顯著差異（P＜0.05）。貯藏時(shí)間為1年的黑木耳多糖處理組的HepG2細(xì)胞存活率較低，其中1 mg/mL多糖處理組的HepG2細(xì)胞存活率最低，僅為（35.43±12.8）%；隨著貯藏年限的增加，HepG2細(xì)胞存活率有所增加，當(dāng)貯藏時(shí)間為4年、黑木耳粗多糖質(zhì)量濃度為1 mg/mL時(shí)，HepG2細(xì)胞的存活率最高，達(dá)（104.85±4.08）%，顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。

圖2 不同貯藏時(shí)間的食用菌多糖（EFP）對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響Fig.2 Effects of edible fungi polysaccharides(EFP)of different storage time on survival rate of HepG2 cells

以上結(jié)果結(jié)合表2可知，杏鮑菇多糖作用的HepG2細(xì)胞存活率最高，其次是黑木耳多糖，而香菇多糖組的HepG2細(xì)胞存活率最低，且三者之間存在顯著差異（P＜0.05）。不同貯藏時(shí)間的食用菌多糖處理對(duì)HepG2細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)效果存在顯著差異，其中以貯藏1年的食用菌多糖處理的HepG2細(xì)胞存活率最低，且與其他貯藏時(shí)間間差異顯著（P＜0.05）。不同的多糖質(zhì)量濃度對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響差異不顯著。

2.3 不同貯藏時(shí)間的食用菌多糖對(duì)HepG2細(xì)胞中SOD、MDA和LDH水平的影響

由圖3可知，不同貯藏時(shí)間的香菇多糖顯著提高了SOD、MDA和LDH的水平，表現(xiàn)出良好的抗氧化活性（P＜0.05）。貯藏時(shí)間為1年的香菇多糖對(duì)氧化損傷的保護(hù)能力優(yōu)于2年、3年和4年，其中：貯藏時(shí)間為1年、香菇多糖質(zhì)量濃度為1 mg/mL時(shí)，HepG2細(xì)胞中SOD活性最高，達(dá)（2.37±0.13）U/mg；在質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時(shí)，HepG2細(xì)胞中MDA含量最接近空白對(duì)照組[（8.08±0.43）mmol/mg]，為（8.19±0.16）mmol/mg；在質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時(shí)，HepG2細(xì)胞中LDH活性最接近對(duì)照組[（40.02±3.19）U/mg]，為（46.29±4.48）U/mg。貯藏時(shí)間為3年的杏鮑菇多糖對(duì)HepG2細(xì)胞的保護(hù)能力最佳，當(dāng)質(zhì)量濃度為2 mg/mL時(shí)，HepG2細(xì)胞的SOD活性最高，達(dá)（1.50±0.06）U/mg，明顯高于模型組[（0.46±0.01）U/mg]；貯藏時(shí)間為3年、4年的杏鮑菇多糖組的MDA含量比1年、2年組高；但杏鮑菇多糖對(duì)LDH活性的影響不顯著。在黑木耳組中，貯藏時(shí)間為4年的黑木耳多糖在質(zhì)量濃度為1 mg/mL時(shí)，HepG2細(xì)胞的SOD活性達(dá)到最高[（0.93±0.10）U/mg]，MDA含量為[（10.93±0.30）mmol/mg]，最接近對(duì)照組[（10.68±0.88）mmol/mg]，而LDH活性最低，為[（78.11±1.57）U/mg]?？傮w而言，貯藏時(shí)間為4年的黑木耳粗多糖對(duì)HepG2細(xì)胞的保護(hù)能力優(yōu)于其他3個(gè)貯藏年限。

表2 食用菌類型、貯藏時(shí)間、多糖質(zhì)量濃度及其相互作用對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響Table 2 Effects of edible fungi variety,storage time,polysaccharide concentrations and their interactions on survival rate of HepG2 cells

從表3可知，食用菌類型、貯藏時(shí)間和多糖質(zhì)量濃度均對(duì)HepG2細(xì)胞中SOD、MDA、LDH水平的影響具有顯著差異（P＜0.05）。香菇處理組的SOD活性顯著高于杏鮑菇和黑木耳，但其MDA、LDH水平顯著低于杏鮑菇和黑木耳（P＜0.05），表明香菇多糖對(duì)H2O2氧化損傷作用的降低效果顯著高于杏鮑菇多糖和黑木耳多糖。在不同貯藏時(shí)間的食用菌多糖組中，HepG2細(xì)胞的MDA含量存在顯著差異（P＜0.05），且以貯藏3年的最高。不同多糖質(zhì)量濃度處理組的SOD活性和MDA含量存在顯著差異（P＜0.05），其中高質(zhì)量濃度（1、2 mg/mL）多糖處理組的HepG2細(xì)胞的SOD活性顯著高于低質(zhì)量濃度處理組，表明高質(zhì)量濃度多糖比低質(zhì)量濃度多糖具有更佳的抗氧化效果。

3 討論和結(jié)論

多糖類物質(zhì)在食用菌中普遍存在，其在生物活性方面的作用越來越受到人們的重視。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，食用菌多糖不僅具有抗癌、抗感染、抗病毒、抗衰老等多方面的藥理活性[24-26]，而且具有較好的抗氧化活性，對(duì)物理、化學(xué)及生物來源的多種活性氧簇（reactive oxygen species,ROS）具有良好的清除作用。而抗氧化作用是一些多糖抗衰老、降血脂、降血糖的作用機(jī)制之一[27-28]。近年來，國內(nèi)外已將抗氧化水平的檢測(cè)用于抗衰老等保健食品的評(píng)價(jià)中。

本研究結(jié)果表明，在香菇、杏鮑菇和黑木耳3種食用菌中，香菇多糖的提取率顯著高于其他2種，且貯藏3年的香菇多糖提取率最高，為（6.92±0.18）%。杏鮑菇多糖降低H2O2誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞的氧化損傷作用最佳，且貯藏時(shí)間為2年和3年的杏鮑菇多糖的保護(hù)效果優(yōu)于其他2個(gè)年限；不同質(zhì)量濃度的杏鮑菇多糖處理對(duì)細(xì)胞的保護(hù)效果都顯著高于對(duì)照，其中以貯藏時(shí)間3年、質(zhì)量濃度為1 mg/mL的杏鮑菇多糖的抗氧化效果最佳，其HepG2細(xì)胞存活率為（99.37±8.23）%，是模型組的1.91倍，這與杏鮑菇多糖顯著提高了SOD活性、降低了MDA含量的結(jié)果一致。在黑木耳組中，貯藏時(shí)間為1年的黑木耳多糖提取率最高[（2.61±0.73）%]，貯藏3年的最低[（1.72±0.09）%]；在抗氧化活性方面，貯藏4年、質(zhì)量濃度為1 mg/mL的黑木耳多糖對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞保護(hù)作用顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），此條件還顯著提高了SOD活性、降低了MDA和LDH的水平，表現(xiàn)出最強(qiáng)的抗氧化作用。

圖3 不同貯藏時(shí)間的食用菌多糖（EFP）對(duì)HepG2細(xì)胞中SOD、MDA和LDH水平的影響Fig.3 Effect of edible fungi polysaccharides(EFP)of different storage time on SOD,MDAand LDH levels in HepG2 cells

張佳欣[9]在細(xì)胞抗氧化活性的研究中發(fā)現(xiàn)，茯磚茶多糖表現(xiàn)出陳化時(shí)間的規(guī)律，且陳化3年對(duì)PC12細(xì)胞的保護(hù)作用最強(qiáng)；本研究結(jié)果與其一致。說明食用菌多糖具有抗氧化活性，而且其活性隨著貯藏時(shí)間的不同而變化。另外，與韓飛等[23]（100 μmol/L H2O2，4 h）、羅春麗等[21]（400 μmol/L H2O2，2 h）構(gòu)建的模型不同，本試驗(yàn)在建模時(shí)選取的是使HepG2細(xì)胞達(dá)到半抑制時(shí)的H2O2濃度（60 μmol/L，2 h），在此濃度下細(xì)胞處于氧化損傷而又未被完全殺死的狀態(tài)，這時(shí)有損傷修復(fù)的可能性[19]。

然而，食用菌貯藏改變其多糖活性成分的形成機(jī)制尚未見有相關(guān)報(bào)道，推測(cè)可能與多糖的一級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而影響有效多糖的比例，進(jìn)而造成生物活性的差異有關(guān)。較早的研究表明：食藥用真菌的多糖結(jié)構(gòu)與功能存在一定的關(guān)系；此類多糖中活性成分的主鏈由β-（1-3）糖苷鍵相連接，側(cè)鏈由β-（1-6）糖苷鍵相連接，且該類型的多糖具有抗菌、抗腫瘤和抗病毒功效[29]。此外，多糖分子的結(jié)構(gòu)修飾可能對(duì)其生物學(xué)活性產(chǎn)生重要影響，如糖殘基上的羥基、羧基、氨基等基團(tuán)經(jīng)磺化后可增加抗人類獲得性免疫缺陷病毒（HIV）和抗腫瘤的效果[30]。

綜上所述，食用菌多糖的提取率、抗氧化活性等會(huì)隨著食用菌的種類及貯藏年限的不同而發(fā)生改變。對(duì)于不同的食用菌多糖，在貯藏過程中發(fā)生的物質(zhì)變化及有效成分的生物活性機(jī)制還需進(jìn)一

步深入研究。本研究為香菇、杏鮑菇、黑木耳等食用菌在生產(chǎn)實(shí)踐中優(yōu)化貯藏時(shí)間及條件、獲得良好的生產(chǎn)工藝提供了一定的參考，也為獲得更大生產(chǎn)收益提供了理論支持。

表3 食用菌類型、貯藏時(shí)間、多糖質(zhì)量濃度及其交互作用對(duì)HepG2細(xì)胞中SOD、MDA和LDH水平的影響Table 3 Effects of edible fungi variety,storage time,polysaccharide concentrations and their interactions on SOD,MDA,and LDH levels in HepG2 cells

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