馮皓 宋慧云 祝一鳴 吳文佳 李亭潞 徐春玲 單體江

摘 要 羊蹄甲是我國華南地區(qū)重要的園林景觀樹種，近年來隨著栽培面積的不斷擴(kuò)大，白粉病的發(fā)生也越來越嚴(yán)重。通過對羊蹄甲白粉病的癥狀及病原菌分生孢子形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行描述，根據(jù)核糖體DNA-ITS序列發(fā)現(xiàn)，羊蹄甲白粉病病原菌與Erysiphe lespedezae（登錄號：KP794926）相似性為100%，初步鑒定該菌為子囊菌門白粉菌屬（Erysiphe sp.）真菌（登錄號：KX960783），目前在野外尚未發(fā)現(xiàn)該病原菌的有性世代。該研究結(jié)果為羊蹄甲白粉病的首次報(bào)道，為羊蹄甲白粉病的鑒定及防治提供了重要的理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 羊蹄甲；白粉??；病原鑒定

中圖分類號 S436.8 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2018.01.017

Abstract Bauhinia purpurea Linn. was an important landscape tree species in the southern China. In recent years， with the growing hectare of planting，the occurrence of powdery mildew had become more and more serious. This study described the symptoms of powdery mildew and the morphological characteristics of conidia. The ribosomal DNA-ITS sequence was 100% similar to Erysiphe lespedezae （accession number was KP794926）， which was identified as Erysiphe sp. （accession number was KX960783）At present， the sexual generation had not found in the wild. This study was the first report on the powdery mildew of Bauhinia purpurea Linn.， which provided important theoretical basis for the identification and control of powdery mildew.

Keywords Bauhinia purpurea Linn. ； powdery mildew ； pathogen identification

羊蹄甲屬是紫荊族中最大的一個屬，全世界約有300種，在我國主要分布在廣東、廣西、海南、福建等省[1-2]。羊蹄甲屬植物花朵繁盛，花色艷麗，具有很強(qiáng)的空氣凈化能力，是華南地區(qū)優(yōu)質(zhì)的庭蔭樹、行道樹和園林綠化樹種[3]。隨著廣東省四大重點(diǎn)林業(yè)生態(tài)工程建設(shè)工作的不斷推進(jìn)以及人們對觀賞植物需求量的日益增多，羊蹄甲屬植物開始在華南地區(qū)尤其是廣州市大面積種植[4]。然而，單一品種大面積連片種植往往會誘發(fā)病蟲害的發(fā)生和流行，嚴(yán)重危害城市綠化和生態(tài)文明建設(shè)，因而，研究羊蹄甲屬植物病害具有重要的理論和實(shí)踐意義[5]。當(dāng)前，有關(guān)羊蹄甲屬植物病害的研究較少，主要集中在灰斑?。≒hyllosticta bauhiniae Cooke）、褐斑?。≒seudocercospora bauhiniicola （Yen）Yen）和葉霉?。–ladosporium cladosporioides）等[6-7]。羊蹄甲（Bauhinia purpurea Linn. Sp.），又名玲甲花，隸屬蘇木科（Caesalpiniaceae）羊蹄甲屬（Bauhinia）常綠喬木。調(diào)查顯示，白粉病是一種危害羊蹄甲葉片和嫩枝的病害。隨著羊蹄甲的大面積種植，白粉病發(fā)病程度在逐年加重，嚴(yán)重影響羊蹄甲的觀賞價(jià)值。目前尚未見羊蹄甲白粉病的任何研究和報(bào)道。本研究描述了羊蹄甲白粉病的危害癥狀，并結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)對羊蹄甲白粉病的病原菌進(jìn)行鑒定，為羊蹄甲白粉病的鑒定以及綜合防控提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病害標(biāo)本采集

病害標(biāo)本采自廣州市天河區(qū)華南農(nóng)業(yè)大學(xué)校園，將標(biāo)本置于自封袋中，置于4℃保存，備用。

1.1.2 儀器與試劑

光學(xué)顯微鏡（蔡司金相顯微鏡Axio Scope A1）；SW-CJ-2G型超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司，蘇州）；0.2%氯化汞（廣逸化工有限公司）；Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒（上海生工生物工程有限公司）；引物ITS4（上海生工生物工程有限公司）；引物ITS5（上海生工生物工程有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)病癥狀及病原菌形態(tài)觀察

觀察羊蹄甲白粉病的發(fā)病癥狀，包括病斑的形狀、大小、色澤及病害對羊蹄甲植株的危害（枯萎、凋謝、畸形、變色、生長習(xí)性變化等）。用滅菌針挑取新鮮病葉表面的白色粉層少許，做成臨時(shí)玻片，用光學(xué)顯微鏡仔細(xì)觀察病原菌的形態(tài)特征，測量50個病原菌分生孢子大小并顯微拍照[8-9]。

1.2.2 病原菌ITS序列測定

用滅菌的挑針輕輕刮取白色粉狀物，液氮研磨，采用試劑盒法（上海生工DNA抽提取試劑盒）提取DNA。用真菌通用引物ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）和ITS5（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′）對DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：PCR反應(yīng)混合液總體積為50 μL，包括DNA Mix 25 μL，上下游引物各1 μL，DNA模版3 μL，雙蒸水補(bǔ)足到50 μL混勻，離心后放入PCR儀擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為94℃變性3 min，94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30個循環(huán)，最后72℃延伸8 min，4℃保存[10]。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，委托上海生工生物工程有限公司測序。所得序列使用DNAMAN軟件進(jìn)行互補(bǔ)，將正向與反向引物互補(bǔ)序列兩端加上引物序列拼接成完整序列，所得的rDNA-ITS序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫（National Center for Biotechnology Information website [http：//www.ncbi.nlm.nih.gov]），利用Blast工具進(jìn)行序列比對，找出與該序列相似度最高的病菌序列信息，對該病菌樣本進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊蹄甲白粉病癥狀

羊蹄甲白粉病菌為專性寄生菌，在羊蹄甲屬的其他種尚未見白粉病的發(fā)生。據(jù)調(diào)查，羊蹄甲白粉病在華南地區(qū)2月下旬開始發(fā)病，一直持續(xù)到6月份，發(fā)病時(shí)間受溫度以及降雨量的不同會有所變化，一般3～4月份發(fā)病最為嚴(yán)重。該病害主要為害羊蹄甲葉片和葉柄，嚴(yán)重時(shí)可危害新發(fā)嫩枝。葉片正反面皆可侵染，發(fā)病初期葉面出現(xiàn)褪綠小點(diǎn)，隨后擴(kuò)展為不規(guī)則形水漬狀病斑，當(dāng)條件適宜時(shí)，葉片表面放射狀的白色菌絲會不斷生長并產(chǎn)生大量白色粉末狀的分生孢子，覆蓋整個葉片。感病葉片輕者褪綠、黃化、卷曲、皺縮，嚴(yán)重時(shí)葉片畸形，質(zhì)地變硬，失去光澤（見圖1）。

2.2 病原菌形態(tài)特征

病原菌分生孢子呈圓筒形或橢圓形，兩端圓，單胞，無色，表面不光滑，大小為長32.0～46.0 μm，寬13.0～20.0 μm，平均長×寬為39.5 μm×16.5 μm（見圖2）。分生孢子內(nèi)含明顯的纖維狀體，纖維狀體盤狀。

2.3 病原菌ITS序列測定

利用真菌核糖體DNA-ITS區(qū)通用引物 ITS4和ITS5，以羊蹄甲白粉病病原菌總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得一條長度為672 bp大小的目的片段。將ITS序列提交至GenBank 數(shù)據(jù)庫中，獲得羊蹄甲白粉病菌ITS序列的登錄號為KX960783 。在NCBI中進(jìn)行BLAST，與其他同源序列比對分析后發(fā)現(xiàn)，羊蹄甲白粉病病原菌與Erysiphe lespedezae（登錄號為KP794926）核糖體DNA-ITS序列的相似性高達(dá)100%。Erysiphe lespedezae屬于子囊菌門白粉菌屬，為有性態(tài)，但目前在野外尚未發(fā)現(xiàn)羊蹄甲白粉病菌的有性世代。

3 討論

目前在園林應(yīng)用中常見的品種主要包括洋紫荊、羊蹄甲、白花洋紫荊、紅花羊蹄甲、嘉氏羊蹄甲等。除嘉氏羊蹄甲外，其他幾種植物較為相似，不易區(qū)別，導(dǎo)致常混種[3]。調(diào)查顯示，白粉病只危害羊蹄甲，在羊蹄甲屬的其他植物上尚未發(fā)現(xiàn)。由于白粉病菌屬于典型的活體寄生， 即菌絲體只能存活在活的寄主組織內(nèi)，無法用培養(yǎng)基離體培養(yǎng)[11-12]，因此，給病原菌形態(tài)學(xué)、生物學(xué)和分子生物學(xué)等方面的研究帶來了一定的困難。本研究通過分子生物學(xué)方法將羊蹄甲白粉病病原菌鑒定為子囊菌門白粉菌屬（Erysiphe sp.），但目前在野外尚未發(fā)現(xiàn)羊蹄甲白粉病菌的有性世代，而白粉病菌的無性態(tài)多屬于半知菌類粉孢屬（Oidium sp.）真菌。本研究僅從白粉病癥狀和白粉病病原菌分生孢子的顯微圖片方面不足以鑒定該病原菌無性態(tài)的分類地位，因此，在今后的研究中還需對分生孢子以及分生孢子梗的著生方式等方面做進(jìn)一步研究。

白粉菌屬（Erysiphe）真菌廣泛分布于世界各地，是危害農(nóng)林作物的一種重要病原物。相比瓜果蔬菜、小麥大豆等經(jīng)濟(jì)作物，由于其不進(jìn)行系統(tǒng)侵染，特別是很少侵染根部，病害發(fā)展緩慢，寄主死亡率低，往往在林業(yè)生產(chǎn)實(shí)際中不受重視[13]。華南地區(qū)觀賞植物種類繁多，白粉菌的侵染無需特定的溫度、濕度[12]，當(dāng)病害流行時(shí)，亦會造成嚴(yán)重的損失[14]。比如，常見的馬占相思白粉病[11]、九里香白粉病[15]、橡膠樹白粉病[16]、玫瑰白粉病[17]等。因此，準(zhǔn)確鑒定白粉病病原菌是開展抗病育種工作的首要問題。本研究通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法對羊蹄甲白粉病病原物進(jìn)行了鑒定，這是我國首次關(guān)于羊蹄甲白粉病病原菌的報(bào)道，為今后進(jìn)一步研究羊蹄甲白粉病病原菌的生物學(xué)特性、發(fā)生規(guī)律、抗病育種以及篩選有針對性的高效藥物提供了一定的理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1] 鄒 璞，廖景平，張奠湘. 羊蹄甲屬植物種子表面微形態(tài)觀察[J]. 廣西植物，2008，28（1）：24-32.

[2] Wunderlin R P， Larsen K， Larsen S S. Reorganization of the Cercideae （Fabaceae： Caesalpinioideae）[J]. Biologiske Skrifter， 1987（28）： 1-40.

[3] 楊之彥，馮志堅(jiān)，曹忠元. 羊蹄甲屬觀賞植物的辨別及其園林應(yīng)用[J]. 廣東園林，2011，33（1）：47-51.

[4] 唐洪輝，魏 丹，趙 慶，等. 羊蹄甲屬景觀樹種在廣州市3種綠地類型中的應(yīng)用[J]. 林業(yè)與環(huán)境科學(xué)，2016，32（6）：63-69.

[5] 王曉陽. 14種觀賞植物17種真菌病害的病原鑒定[D]. 廣州：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016.

[6] 雷增普. 中國花卉病蟲害診治圖譜[M]. 北京：中國城市出版社，2005.

[7] 劉曉妹，丁曉帆，楊國慶，等. 紅花羊蹄甲新病害葉霉病病原菌鑒定[J]. 中國植保導(dǎo)刊，2013，33（8）：5-8.

[8] 魏景超. 真菌鑒定手冊[M]. 上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1979.

[9] 王應(yīng)清，蘇琳琳，胡永亮，等. 瑞麗辣木白粉病病原初步鑒定及田間藥效試驗(yàn)[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，37（2）：48-51.

[10] 艾彩霞，單體江，馮 皓，等. 大果紫檀葉斑病的病原鑒定[J]. 湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，9（9）：47-48.

[11] 劉運(yùn)華，陳振寧，馮嬌銀，等. 馬占相思白粉病發(fā)生規(guī)律及其防治的初步研究[J]. 廣西林業(yè)科學(xué)，2003，3（32）：138-140.

[12] Gao Y， Han Y， Zhao F， et al. Identification and utilization of a new Erysiphe necator isolate NAFU1 to quickly evaluate powdery mildew resistance in wild Chinese grapevine species using detached leaves[J]. Plant Physiology and Biochemistry，2016 （98）： 12-24.

[13] Gafni A， Calderon C E， Harris R， et al. Biological control of the cucurbit powdery mildew pathogen Podosphaera xanthii by means of the epiphytic fungus Pseudozyma aphidis and parasitism as a mode of action[J]. Frontiers in Plant Science，2015（6）： 132.

[14] 阮成俊. 南京市林木白粉病種類調(diào)查和病原鑒定[D]. 南京：南京林業(yè)大學(xué)，2010.

[15] 郭源振. 九里香白粉病發(fā)病規(guī)律及其防治[J]. 花卉園藝，2005（2）：28-29.

[16] 劉 靜. 橡膠樹白粉病的研究進(jìn)展[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科技，2010，33（3）：1-5.

[17] Qiu X， Wang Q， Zhang H， et al. Antisense RhMLO1 Gene Transformation Enhances Resistance to the Powdery Mildew Pathogen in Rosa multiflora[J]. Plant Molecular Biology Reporter， 2015， 33（6）： 1 659-1 665.