艾子凌++高鵬++杜黎黎++欒非時(shí)

摘要：從國際生理小種鑒別寄主中選取甜瓜抗病自交系MR-1為母本，感病自交系Topmark為父本，構(gòu)建F2代群體。對354株F2代群體進(jìn)行田間甜瓜白粉病抗病性調(diào)查并分析其遺傳規(guī)律，發(fā)現(xiàn)甜瓜白粉病的抗性基因?yàn)閱物@性基因；根據(jù)兩親本基因組重測序數(shù)據(jù)，自行開發(fā)設(shè)計(jì)CAPS分子標(biāo)記，將具有多態(tài)性的標(biāo)記應(yīng)用于F2代基因分型以構(gòu)建遺傳連鎖圖譜。圖譜內(nèi)含142個(gè)CAPS標(biāo)記，分布于12個(gè)連鎖群上。圖譜總長度2 065.47 cM，平均距離14.55 cM；標(biāo)記最多的為第四連鎖群，分布22個(gè)標(biāo)記，標(biāo)記間平均距離為11.61 cM；最長的為第五連鎖群，總長277.98 cM；最短的為第三連鎖群，總長65.6 cM。得到1個(gè)甜瓜白粉病抗性相關(guān)基因位點(diǎn)，該位點(diǎn)在第七連鎖群上，位于CAPS標(biāo)記7-4E和7-1H之間。

關(guān)鍵詞：甜瓜；白粉??；生理小種；CAPS；遺傳圖譜

中圖分類號： S436.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2016）06-0066-05

收稿日期：2015-03-11

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號：31301791）；農(nóng)業(yè)部“948”項(xiàng)目（編號：2014-S15）。

作者簡介：艾子凌（1988—），女，黑龍江齊齊哈爾人，碩士研究生，主要從事甜瓜分子育種。 E-mail：linglingfighting@126.com。

通信作者：欒非時(shí)，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事西甜瓜分子遺傳育種。 E-mail：luanfeishi@sina.com。甜瓜白粉病別稱白毛病、粉霉病，常在坐果期發(fā)生，是一種世界性病害，嚴(yán)重威脅葫蘆科作物生長[1]。病菌侵染到葉片表面，起初葉片上只是有水滴大小的白色圓形粉狀霉點(diǎn)，在高溫潮濕的環(huán)境里迅速布滿葉片，蔓延至葉柄、莖蔓，濃厚的白粉菌不僅降低感病植株的光合效能，還能增加植株的蒸騰效能，長時(shí)間呼吸作用強(qiáng)于光合作用導(dǎo)致植株萎黃干枯，提早衰亡，嚴(yán)重影響甜瓜產(chǎn)量和品質(zhì)[2]。甜瓜白粉病致病菌有3個(gè)屬，6個(gè)種，瓜單囊殼白粉菌分化出生理小種0、1、2（2U.S、2France）、3、4、5[3]、6、7、N3和N4[4]；二孢白粉菌衍生出生理小種0和生理小種1[5]。諸多病原菌僅僅依靠化學(xué)制劑已不能根除白粉病，且隨著時(shí)間增長病原菌已產(chǎn)生耐藥性，即使加大用藥劑量也難以獲得好的效果，這對甜瓜白粉病防治工作造成了極大的困難[6]。面對白粉病對甜瓜造成的重大危害，外界施藥又困難重重，培育抗病新品種成為杜絕白粉病的不二方法。然而傳統(tǒng)的育種方法極易受環(huán)境因素、基因表達(dá)、基因顯隱性、目標(biāo)基因與不利基因的連鎖等影響，使得育種周期長，選擇目標(biāo)性狀困難，很難培育出優(yōu)良品種[7-8]。分子標(biāo)記輔助育種可以有針對性的培育出所含目標(biāo)性狀的新品種，首先要明確致病菌類型研究抗病規(guī)律進(jìn)而獲得抗病基因 [9]。本試驗(yàn)以甜瓜高抗白粉病品系MR-1（P1）和甜瓜高感白粉病品系Topmark（P2）為親本配制雜交組合，探索抗源MR-1對瓜單囊殼白粉菌生理小種1的抗性遺傳規(guī)律。以F2群體為作圖群體，利用CAPS技術(shù)，定位抗性基因，為甜瓜抗白粉病基因的精細(xì)定位和分子克隆奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1供試甜瓜品種試驗(yàn)所用母本為抗性材料MR-1，對白粉病菌不同的生理小種普遍具有抗性，父本Topmark為感病材料，不含抗病基因。采用國際通用13個(gè)生理小種的鑒別寄主，分別是PMR45、Topmark、PI124111、IranH、PI24112、MR-1、Nantais Oblong、Edisto47、PI414723、WMR29、PMR5、PMR6、Vedrantais。

1.1.2供試菌株2013年7月采集于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)基地感白粉病嚴(yán)重的葫蘆科病葉，隔離保存菌株并對病原菌進(jìn)行顯微鏡鏡檢，確定病原菌類型。將菌株接種到感病植株上進(jìn)行純化后接種到13個(gè)鑒別寄主上鑒定生理小種。

1.2田間試驗(yàn)

1.2.1田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)2013年3月將6世代群體浸種，催芽，單粒播種于缽中。5月將20株長勢良好的MR-1（P1）、Topmark（P2）、F1，100株BC1P1（F1與P1回交），100株BC1P2（F1與P2回交）及354株F2代定植于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)香坊農(nóng)場5號溫室中，株行距50 cm×80 cm，待植株長到3葉1心時(shí)去掉生長點(diǎn)，采取雙蔓綁枝法將植株吊起，施肥、殺蟲、灌溉等進(jìn)行日常田間管理。2013年夏季將鑒別寄主播種在 8 cm×8 cm 的營養(yǎng)缽中，采用對角線種植。收集充分發(fā)病的葫蘆科蔬菜病葉，輕輕抖下白粉病菌進(jìn)行純化配制菌液，噴霧接種到13個(gè)鑒別寄主上，設(shè) 3次重復(fù)，1次重復(fù)10株。

1.2.2田間接種試驗(yàn)采用風(fēng)媒接種法，即模仿田間自然發(fā)病條件，在高溫高濕下白粉病病原菌最易侵染甜瓜，將其他溫室成株期充分發(fā)病的甜瓜品種移植到試驗(yàn)溫室中，白粉病菌的分生孢子隨著空氣從發(fā)病植株落到需要進(jìn)行抗病調(diào)查6世代群體上，達(dá)到接種目的。為確保高溫高濕條件，白天在溫室地面上多次澆水，適時(shí)封閉溫室[10]。

1.2.3田間調(diào)查試驗(yàn)白粉病調(diào)查方法依照《中國蔬菜病蟲預(yù)測預(yù)報(bào)》，根據(jù)感染程度即葉面菌落多少進(jìn)行分級，共分6級。6世代群體每株由下而上調(diào)查10張葉片記錄病級。按病情指數(shù)（DI）=∑ [（病級的代表值該病發(fā)病葉片數(shù)）/（調(diào)查單株總?cè)~片數(shù)×最高病級的代表值）]×100計(jì)算病情指數(shù)。根據(jù)病指（DI）確定父本、母本、F1、F2、BC1P1、BC1P2的抗感表現(xiàn)型。將病情指數(shù)小于等于11.11定義為抗病，病情指數(shù)大于11.11定義為感病（表1）。

參照上述方法記錄鑒別寄主5張葉片的病級，計(jì)算病情指數(shù)，對照表2的抗感反應(yīng)，確定試驗(yàn)地的優(yōu)勢生理小種。

1.3CAPS分子標(biāo)記

1.3.1CAPS引物開發(fā)CAPS標(biāo)記的開發(fā)以2個(gè)親本材料的基因組重測序數(shù)據(jù)為依據(jù)，以已經(jīng)發(fā)布的甜瓜基因組數(shù)據(jù)為參考，自編perl語言腳本提取位于SNP 位點(diǎn)前后約500 bp的片段序列作為候選SNP位點(diǎn)序列。通過SNP2CAPS軟件分析酶切位點(diǎn)信息，在候選SNP序列中篩選存在CAPS突變的位點(diǎn)，用4種不同的限制性內(nèi)切酶（EcoRⅠ、HindⅢ、 PstⅠ和BamHⅠ）設(shè)計(jì)引物進(jìn)行酶切驗(yàn)證。在甜瓜基因組的每條染色體上平均選取30～40個(gè)存在CAPS 位點(diǎn)的序列，用Primer 5軟件設(shè)計(jì)引物[11]，控制退火溫度55～58 ℃，G+C比例在40%～60%，得到長度為19～25 bp的引物。（M/A）酶切位點(diǎn)所在連鎖群號+引物編號+酶簡寫進(jìn)行引物命名。

1.3.2CAPS引物篩選CAPS標(biāo)記 PCR反應(yīng)體系（20μL）：2.0 μL模版DNA，2.0 μL引物，0.3 μL dNTPs，0.2 μL Taq酶，13.5 μL ddH2O，2.0 μL 10×Buffer。

采用梯度PCR反應(yīng)程序，即94 ℃預(yù)變性7 min；94 ℃變性 20 s，60 ℃退火 20 s，72 ℃延伸 30 s；30 個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)降 0.5 ℃；94 ℃變性 20 s，45 ℃退火20 s，72 ℃延伸 30 s，10個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 7 min，4 ℃保存[12]。酶切體系是1 μL 限制性內(nèi)切酶緩沖液，0.5 μL 限制性內(nèi)切酶（10 U/μL，THERMO），9 μL 超純水，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL，37 ℃水浴 2 h。酶切產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠在250 V高壓下電泳，25～35 min后紫外照射凝膠拍照。

1.3.3F2群體分子數(shù)據(jù)記錄分析F2群體擴(kuò)增的CAPS 條帶和白粉病抗性基因之間的遺傳關(guān)系，同P1帶型一致的標(biāo)記記為2，同P2的帶型一致的標(biāo)記記為0，同F(xiàn)1帶型一致的則記為1，缺失或者模糊不清楚的帶型記作-1，將所有條帶類型記錄在Microsoft Excel 2003。

1.3.4遺傳圖譜構(gòu)建利用QTL IciMapping 4.0對具有多態(tài)性且應(yīng)用到F2代基因分型的分子標(biāo)記進(jìn)行遺傳圖譜構(gòu)建并分析，用“map”命令打開記錄F2代條帶類型的表格，設(shè)定LOD值為3.0，使用完備區(qū)間作圖（ICIM）構(gòu)建遺傳連鎖圖譜。利用MapChart 2.2 繪制遺傳連鎖圖譜，根據(jù)CAPS標(biāo)記在染色體上的位置，依次將連鎖群命名為LG1～LG12。

2結(jié)果與分析

2.1白粉病抗性調(diào)查

顯微鏡觀察白粉病病原菌無性世代，均觀察到有纖維狀體，證實(shí)致病白粉病菌是P. xanthii。對13個(gè)鑒別寄主的抗病調(diào)查發(fā)現(xiàn)，8種鑒別寄主在不同程度上表現(xiàn)為抗病，分別是PMR45、PMR5、WMR29、Edisto47、PI124111、PI124112、PMR6和MR-1。其余5個(gè)鑒別寄主均表現(xiàn)為感病，說明試驗(yàn)地的優(yōu)勢小種是生理小種1。

F1代植株表現(xiàn)出與母本性狀相似的抗性性狀，對354株F2代進(jìn)行田間抗病性調(diào)查，發(fā)現(xiàn)其中30株F2免疫、212株高抗、62株中抗、14株抗病、13株感病、5株中感和2株高感。計(jì)算統(tǒng)計(jì)得到抗病植株為268株、感病86株，抗病 ∶ 感病=3.12，符合3 ∶ 1的分離比例，F(xiàn)1全部抗病，BC1P1抗病，BC1P2感病 ∶ 抗病=1 ∶ 1。通過F2代群體中白粉病病情指數(shù)在群體中的頻次分布圖可以發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)2代群體的354個(gè)單株中，表現(xiàn)出明顯的偏分離，大部分單株偏向于低值病情指數(shù)，病情指數(shù)11.11時(shí)可以將F2代群體明顯地分為抗病和感病2類。病情指數(shù)為31.057～40.613時(shí)，存在小峰分布，證明還存在一些微效基因與抗白粉病基因連鎖。證明甜瓜抗白粉病基因由顯性單基因控制并同時(shí)受到微效基因調(diào)控。調(diào)查分級結(jié)果為質(zhì)量性狀（圖1）。用Excel繪制的病情指數(shù)頻次分布圖見圖2。

2.2CAPS標(biāo)記多態(tài)性

用Primer5設(shè)計(jì)并選用316對CAPS引物，對兩親本進(jìn)行擴(kuò)增篩選，共篩選出在親本間有多態(tài)性的CAPS引物157對，多態(tài)率為49.80%。其中帶型清晰用于構(gòu)建圖譜的標(biāo)記有142個(gè)，分布在1號連鎖群上的標(biāo)記14個(gè)，2號連鎖群13個(gè)，3號連鎖群8個(gè)，4號連鎖群22個(gè)，5號連鎖群15個(gè)，6號連鎖群14個(gè)，7號連鎖群10個(gè)，8號連鎖群9個(gè)，9號連鎖群8個(gè)，10號連鎖群9個(gè)，11號連鎖群10個(gè)，12號連鎖群10個(gè)。部分篩選引物見圖3。具有多態(tài)性引物對F2群體基因型檢測見圖4。

2.3連鎖圖譜構(gòu)建與基因定位

運(yùn)用QTL IciMapping軟件在LOD值≥3的條件下對 142個(gè)多態(tài)性標(biāo)記進(jìn)行連鎖分析，獲得一張包含有142個(gè)CAPS標(biāo)記、覆蓋12個(gè)連鎖群的遺傳連鎖圖譜（圖5）。圖譜總長度2 065.47 cM，圖譜標(biāo)記平均距離14.55 cM。含標(biāo)記最多的為第四連鎖群，分布22個(gè)標(biāo)記，標(biāo)記間平均距離為 11.61 cM。最長的為第五連鎖群，總長277.98 cM，最短的為第三連鎖群，總長65.6 cM。甜瓜CAPS引物在連鎖群上呈均勻分布。結(jié)合田間數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，在第七連鎖群與抗白粉病緊密相關(guān)的位點(diǎn)，距離上端7-4E標(biāo)記17.00 cM，距離下端 7-1H標(biāo)記12.35 cM。

3結(jié)論與討論

3.1接種方法

試驗(yàn)群體采用風(fēng)媒接種法模仿自然發(fā)病，不僅大大降低了工作量，而且能真實(shí)反映植株對白粉病的抗性程度，對鑒別寄主接種采用孢子懸浮液噴霧法是為了使鑒別寄主快速感染白粉病進(jìn)行鑒別，避免因枯萎病等其他病菌侵染植株成為主要病菌而不感染白粉病的發(fā)生。

3.2生理小種的鑒定

甜瓜是否感染白粉病很大程度上受環(huán)境影響，地點(diǎn)不同、種植季節(jié)不同都會影響植株是否感病及感病程度，盛夏及秋季種植的甜瓜感病概率及程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于春季栽培的甜瓜；覆蓋物過厚潛在地加大甜瓜周圍環(huán)境濕度，使甜瓜更易感病；菌液不純含有其他病菌使供試植株不感白粉病而感染其他病。試驗(yàn)嚴(yán)格執(zhí)行采集、純化及接種步驟，依照病級分類標(biāo)準(zhǔn)對試驗(yàn)中侵染的生理小種進(jìn)行鑒別，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。在鑒定生理小種時(shí)，為防止空間差異影響植株感病試驗(yàn)采用對角線位置種植，設(shè)置重復(fù)使調(diào)查結(jié)果準(zhǔn)確。

3.3CAPS標(biāo)記

目前，SRAP、AFLP、SSR作為甜瓜抗病育種常用的標(biāo)記方法。CAPS為酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列技術(shù)，即在已知 DNA序列兩端設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用限制性內(nèi)切酶切割特異序列，得到大小不一的DNA片段，用瓊脂糖電泳分析產(chǎn)物片段，即可區(qū)分基因型。CAPS相對RFLP操作簡便、酶切多態(tài)性高；相對RAPD穩(wěn)定性、可靠性、重復(fù)性強(qiáng)；相對AFLP工作量小，統(tǒng)計(jì)條帶容易；相對SSRs引物設(shè)計(jì)容易。CAPS對DNA濃度及純度要求不高，大大減少了對F2代DNA的提取。試驗(yàn)對重測序的兩親本開發(fā)CAPS標(biāo)記使得引物更有針對性，設(shè)計(jì)的CAPS引物具有在基因組上的座位號，便于在基因組層面上對各個(gè)標(biāo)記進(jìn)行定位，遺傳圖譜中的連鎖群代號就是染色體順序。

3.4連鎖圖譜與基因定位

本試驗(yàn)用CAPS分子標(biāo)記構(gòu)建甜瓜抗白粉病基因遺傳連鎖圖譜在世界范圍內(nèi)都很罕見。在全基因組測序的基礎(chǔ)上，有針對性地自行開發(fā)設(shè)計(jì)引物，結(jié)合田間調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)MR-1 對瓜單囊殼白粉菌生理小種1的抗性基因是單顯性基因，與Jagger等的研究結(jié)論[13-15]一致。試驗(yàn)群體數(shù)量足夠大，但標(biāo)記數(shù)量還有待增多。Wang等對Ano2 × Hami413 和Ano2 × Queen 2組雜交組合得到的F2代，構(gòu)建出2張遺傳連鎖圖譜，包括SSR標(biāo)記、GRA標(biāo)記和AFLP標(biāo)記，結(jié)合分離群體分組分析法（BSA）和比較基因組學(xué)（RGA），在抗病材料Ano2中定位出抗病基因Pm-AN，該基因在RPW 和 MRGH63B 2個(gè)標(biāo)記中間 [16]。王建設(shè)以1A151（抗）×恒進(jìn)紅瓤酥（感）構(gòu)建6世代群體，運(yùn)用RAPD分子標(biāo)記結(jié)合抗性遺傳分析找到1個(gè)由1對不完全顯性抗病基因控制的抗病位點(diǎn)RAPD-S329，其遺傳距離為（6.81±l.67） cM[17]。Yuste-Lisbona等利用AFLP對抗病材料TGR-1551和感病材料 Bola de Oro配制雜交組合構(gòu)建分子標(biāo)記體系，構(gòu)建出1張包含14個(gè)連鎖群的遺傳圖譜，發(fā)現(xiàn)主效QTL位點(diǎn)Pm-R在第五連鎖群上[18]。Teixeira等使用AFLP法找到與抗病基因Pm-1距離為4.9 cM的分子標(biāo)記M75/H35_155，所用抗病材料為 AF426-R [19]。Fukino等為比較甜瓜生長在子葉和第一片真葉期，pxA、pxB 2種白粉病菌株對其是否發(fā)病產(chǎn)生不同影響，利用高抗AR5和高感Harukei配制重組自交系，用157個(gè)SSR標(biāo)記和7 個(gè)SCARs/CAPSs標(biāo)記構(gòu)建遺傳圖譜，檢測QTL位點(diǎn)[20]。Liu等在抗性材料PI 134198中發(fā)現(xiàn)了1個(gè)單顯性抗性基因，并且在距離該基因3.9 cM處獲得了1個(gè)SRAP標(biāo)記[21]。Ning等用抗病材料Edisto47和感病材料Queen構(gòu)建BC1群體，發(fā)現(xiàn)抗病基因Pm-Edisto47-1在SSR標(biāo)記CMGA36 和 SSR252089之間，與兩標(biāo)記距離均為 2.1 cM[22]。由此可見使用抗病材料不同也會導(dǎo)致抗病位點(diǎn)不同。

研究發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)材料MR-1所含有的甜瓜白粉病基因?yàn)閱物@性基因。通過對MR-1×Topmark所構(gòu)建的F2代群體進(jìn)行分析，共檢測到1個(gè)與白粉病抗性有關(guān)的位點(diǎn)，位于7號染色體上，距離上端7-4E標(biāo)記17.00 cM，距離下端7-1H標(biāo)記12.35 cM，為今后甜瓜白粉病抗性基因的精細(xì)定位及克隆奠定了基礎(chǔ)。

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