張 靜，仲 亮，李 智，李秀男，范峻豪，劉春羽，張七斤

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018）

羊口瘡（ORF）又稱羊傳染性膿皰?。–E）、接觸傳染性膿皰性口炎，是由羊口瘡病毒（ORFV）引起的一種接觸性人獸共患病[1-2]。ORFV屬痘病毒科副痘病毒屬，基因全長139 kb，是痘病毒屬中最小的病毒。該屬成員還有偽牛痘病毒、牛丘疹性口炎病毒、新西蘭馬鹿副痘病毒[3-4]。ORFV基因組末端區(qū)域有許多免疫調(diào)節(jié)基因，其編碼的蛋白決定了病毒的宿主范圍、發(fā)病機(jī)理和毒力[5]。到目前為止，在GenBank數(shù)據(jù)庫中，具有全基因組序列的ORFV毒株有：美國株OV-SA00（登錄號(hào)AY386264）、OV-IA82（登錄號(hào)AY386263），德國株D1701（登錄號(hào)HM133903）和新西蘭標(biāo)準(zhǔn)株NZ2（登錄號(hào)DQ184476）[6]。這些毒株編碼132個(gè)基因[7]。ORFV基因編碼的含有毒力的蛋白主要有：病毒干擾素抑制蛋白（OVIFNR、ORF020），趨化因子結(jié)合蛋白（CBP、ORF112），GM-CSF/IL-2抑制蛋白（GIF、ORF117），病毒白細(xì)胞介素10（vIL-10、ORF127）和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF，ORF132）等。最近還有樣細(xì)胞凋亡抑制劑（Bcl-2、ORFV125）與信號(hào)通路抑制劑（NF-κB、ORF024）等被鑒定出來。由于兩頭末端區(qū)域的大多基因編碼的是與病毒

致病機(jī)制有關(guān)的蛋白，因此對(duì)ORFV相關(guān)毒力基因的了解與研究是其免疫學(xué)研究的基礎(chǔ)。研究清楚這些基因是否發(fā)生重組及非必須基因的替換等有助于其毒力基因生物學(xué)特性和病毒致病機(jī)制的研究。

本研究通過對(duì)ORFV/QD/2015強(qiáng)毒株與傳90代后毒株毒力相關(guān)基因的對(duì)比分析，為毒力相關(guān)基因在強(qiáng)弱毒株之間造成的差異提供試驗(yàn)基礎(chǔ)，為解釋ORFV的免疫逃避機(jī)制與構(gòu)建新的基因工程疫苗提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病毒株

ORFV/QD/2015分離株[8]，由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院傳染病教研室分離保存。

1.2 細(xì)胞系

山羊皮膚成纖維細(xì)胞，由中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)昆明細(xì)胞庫提供。

1.3 主要試劑

DMEM、胰酶和胎牛血清等：購自Gibco公司；病毒DNA提取試劑盒，膠回收試劑盒，DL2000Marker、2×Easy Taq SuperMix、質(zhì)粒DNA提取試劑盒等：購自TIANGEN公司等。

1.4 主要儀器

凝膠成像系統(tǒng)Alph imager HPr（美國）、梯度PCR儀TAdvanced 96G（德國）、電泳儀（DYCP-328）等。

1.5 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank上發(fā)表的毒株OV-SA00全基因參考序列，參照已編碼的含有毒力的4組基因序列片段，用Primer 5.0生物軟件設(shè)計(jì)并合成特異性引物（表1）。引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 含有毒力的基因及其特異引物

1.6 PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物回收

在ORFV/QD/2015株與傳90代產(chǎn)生穩(wěn)定病變分離株的細(xì)胞培養(yǎng)液中提取病毒DNA。以提取的病毒DNA為模版，用2×Easy Taq Super Mix試劑盒配制 25 μL普通PCR反應(yīng)體系：2×Easy Taq Super Mix 12.5 μL， 上 游 引 物（10 μmol/L）1 μL，下游引物（10 μmol/L）1 μL，c DNA 模板1 μL，dd H2O 9.5 μL。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)退火條件為：ORF020：59 ℃ 45 s；ORF112：51.1 ℃ 45 s；ORF117：55 ℃ 45 s；ORF127：57 ℃ 45 s。

1.7 基因測(cè)序及生物信息學(xué)分析

將電泳檢測(cè)結(jié)果中條帶最亮的樣品送至上海生工生物工程股份有限公司測(cè)序。用DNA Star軟件將測(cè)序結(jié)果拼接，并用其中的Edit Seq軟件和MegAlign軟件，將強(qiáng)弱毒株相關(guān)毒力基因序列與網(wǎng)上已經(jīng)公布的序列進(jìn)行比對(duì)，用DNAMAN軟件分析強(qiáng)毒株ORFV/QD/2015株與傳90代毒株的變化。

2 結(jié)果

2.1 強(qiáng)毒株與傳90毒株4組毒力有關(guān)基因的擴(kuò)增成功擴(kuò)增出強(qiáng)毒株與QD90株020、112、

117、127毒力相關(guān)基因擴(kuò)增片段，目的片段大小與預(yù)期相符（表2、圖1）。

表2 擴(kuò)增出的毒力相關(guān)基因目片段大小

圖1 QD強(qiáng)毒株與傳90代毒株基因目的片段PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 強(qiáng)毒株與傳90代毒株與已公布毒株相關(guān)毒力基因核苷酸同源性對(duì)比

將ORFV/QD/2015強(qiáng)毒株與傳90代后毒株質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果的核苷酸與Genebank公布的9組ORFV全基因序列中的ORF020、ORF112、ORF117、ORF127基因核苷酸進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果顯示：ORFV/QD/2015強(qiáng)毒株ORF020基因與9組公布基因的相應(yīng)核苷酸序列同源性為97.2%～99.1%，而傳90代毒株ORF020基因相應(yīng)核苷酸序列同源性為96.9%～98.9%（圖2）；ORF112基因與9組基因的相應(yīng)核苷酸序列同源性為93.1%～95%，傳90代 后 毒 株 則 為92.8%～94.9%（ 圖3）；ORF117基因與7組基因的相應(yīng)核苷酸序列同源性為96.1%～98.9%，而傳90代后毒株相應(yīng)核苷酸序列同源性為95.5%～96.7%（圖4）；ORF127基因與9組基因的相應(yīng)核苷酸序列同源性為95.5%～97.9%，而傳90代后毒株相應(yīng)核苷酸序列同源性為93.9%～95.7%（圖5）。

圖2 QD強(qiáng)毒株與傳代90代毒株ORF020基因核苷酸同源性分析結(jié)果

圖3 QD強(qiáng)毒株與傳代90代毒株ORF112基因核苷酸同源性分析結(jié)果

圖4 QD強(qiáng)毒株與傳代90代毒株ORF117基因核苷酸同源性分析結(jié)果

2.3 強(qiáng)毒株與傳90代毒株毒力相關(guān)基因的氨基酸序列比對(duì)

根據(jù)測(cè)序結(jié)果，用DNA Star軟件推導(dǎo)出ORFV/QD/2015強(qiáng)毒株與傳90代毒株間各毒力相關(guān)基因?qū)?yīng)的編碼氨基酸序列，并與其他毒株毒力相關(guān)基因進(jìn)行比對(duì)分析。

圖5 QD強(qiáng)毒株與傳90代毒株ORF127基因核苷酸同源性分析結(jié)果

結(jié)果顯示，兩個(gè)毒株的ORF020基因推導(dǎo)出的編碼氨基酸個(gè)數(shù)均為181個(gè)，且發(fā)生了7處變異（圖6）；兩個(gè)毒株的ORF112基因推導(dǎo)出的編碼氨基酸個(gè)數(shù)均為278個(gè)，且發(fā)生了52處變異（圖7）；兩個(gè)毒株的ORF117基因推導(dǎo)出的編碼氨基酸個(gè)數(shù)均為265個(gè)，并發(fā)生了14處變異（圖8）；兩個(gè)毒株的ORF127基因組推導(dǎo)出的編碼氨基酸個(gè)數(shù)均為186個(gè)，并發(fā)生了15處變異（圖9）。

圖6 QD強(qiáng)毒株與傳90代毒株及其他公布毒株的ORF020基因氨基酸序列比對(duì)結(jié)果

2.4 蛋白抗原指數(shù)分析

圖7 QD強(qiáng)毒株與傳90代毒株及其他公布毒株的ORF112基因氨基酸序列比對(duì)結(jié)果

圖8 QD強(qiáng)毒株與傳90代毒株及其他公布毒株的ORF117基因氨基酸序列比對(duì)結(jié)果

運(yùn)用DNA Star中的Protean軟件，分析QD強(qiáng)毒株與傳90代毒株間各毒力相關(guān)基因編碼蛋白的抗原指數(shù)?？乖笖?shù)分析表明，4組毒力相關(guān)基因的抗原指數(shù)較高，說明抗原性較好。強(qiáng)毒株與傳90代毒株間的抗原指數(shù)發(fā)生了明顯變異（圖10）。

圖9 QD強(qiáng)毒株與傳90代毒株及其他公布毒株的ORF127基因氨基酸序列比對(duì)結(jié)果

圖10 QD強(qiáng)毒株與傳90代毒株之間抗原指數(shù)的比較

3 討論與結(jié)論

在病毒感染早期，ORF020作為毒力因子能夠抑制宿主干擾素（IFN）誘導(dǎo)的dsRNA依賴的酶的激活，從而阻止IFN誘導(dǎo)的病毒蛋白翻譯的終止，即可抑制干擾素的抗病毒機(jī)制[9]。ORF112（CBP）是早期表達(dá)的病毒復(fù)制編碼產(chǎn)物[10-11]。GIF是ORF117編碼的蛋白，是病毒感染晚期表達(dá)的蛋白，能夠抑制宿主免疫活性，在機(jī)體的抗病毒感染過程中發(fā)揮著相當(dāng)重要的作用[12]。ORF127是ORFV作為痘病毒科中唯一一個(gè)發(fā)現(xiàn)含有IL-10編碼基因的病毒。該基因也是病毒感染早期表達(dá)的基因之一[13]。

從相關(guān)毒力基因的角度出發(fā)，本試驗(yàn)提取強(qiáng)毒株ORFV/QD/2015與傳90代毒株的4組與毒力相關(guān)的的基因組DNA，通過擴(kuò)增ORF020、ORF112、ORF117和 ORF127的 目 的 基 因， 并對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，通過測(cè)序找出兩毒株相同毒力基因片段，并分析其對(duì)應(yīng)關(guān)系。ORFV/QD/2015強(qiáng)毒株與傳90代毒株的質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果與Genebank公布的9組ORFV全基因序列中的ORF020、ORF112、ORF117、ORF127基因的比對(duì)結(jié)果顯示，強(qiáng)毒株的4組毒力相關(guān)基因同源性比傳代毒株的同源性高，傳90代毒株的這4組毒力相關(guān)的基因發(fā)生了明顯變異。這個(gè)變化可能導(dǎo)致病毒致弱，后續(xù)將進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，以驗(yàn)證傳90代毒株的毒力是否致弱。ORFV毒力相關(guān)基因的變異可能與其毒力有很大聯(lián)系，這個(gè)變化可能與傳代過程中基因發(fā)生多處變異有關(guān)，也可能是這些毒力基因共同作用的結(jié)果。在今后，制備ORFV弱毒疫苗是否可以根據(jù)這幾個(gè)主要毒力基因的變異去研究，還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

[1] 黎攝兒. 羊傳染性膿皰病毒（ORFV）不同毒力毒株功能基因比較基因組學(xué)的相關(guān)研究[D]. 長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

[2] 趙魁. 羊傳染性膿皰病毒重組DNA疫苗的構(gòu)建與實(shí)驗(yàn)免疫研究[D]. 長春：吉林大學(xué)，2010. 11-12.

[3] MARTINS M，CARGNELUTTI J F，WEIBLEN R，et al. Pathogenesis in lambs and sequence analysis ofputative virulence genes of Brazilian Orf virus isolates[J].Veterinary microbiology，2014，174（1/2）：69-77.

[4] 張佳純. 快速篩選重組羊口瘡病毒NA1/11Δ132以及構(gòu)建表達(dá)EV71 VP1蛋白的重組羊口瘡病毒NA1/11-VP1[D]. 廣州：南方醫(yī)科大學(xué)，2016.

[5] 劉媛. IL-2基因佐劑對(duì)羊口瘡病毒核酸疫苗免疫效果的影響研究[D]. 貴陽：貴州大學(xué)，2016.

[6] 成偉偉，張克山，劉永杰. 羊傳染性膿皰病毒基因組結(jié)構(gòu)和主要基因功能研究進(jìn)展[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2014，35（7）：82-85.

[7] MERCER A A，UEDA N，F(xiàn)RIEDERICHS S M，et al. Comparative analysis of genome sequences of three isolates of Orf virus reveals unexpected sequence variation.[J]. Virus research，2006，116（1/2）：146-158.

[8] 涂明亮. 羊口瘡病毒生物學(xué)特性研究[D]. 呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016.

[9] MERCER A，HAIG D. Parapoxviruses（Poxviridae）[J]. Encyclopedia of virology，1999，18（2）：1140-1146.

[10] LI J，SONG D，HE W，et al. Rapid detection of Orf virus by loop-mediated isothermal amplification based on the DNA polymerase gene[J]. Archives of virology，2013，158（4）：793-789.

[11] 龐方圓，高日明，李旭東，等. 羊口瘡病毒的分離與鑒定[J]. 中國畜牧獸醫(yī)，2015，42（2）：467-471.

[12] 劉永杰，張克山，孔漢金，等. 羊傳染性膿皰診斷技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013，34（2）：96-99.

[13] 劉其昌，宋德榮，彭華，等. 羊口瘡研究進(jìn)展[J]. 當(dāng)代畜牧，2015（6）：79-80.