馬 興，董星晨，張 健，羅超越，鄧德雷，張春紅，王友玲，邱慧珍

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院/甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070)

黃瓜是具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的重要蔬菜作物[1]，中國(guó)的黃瓜種植面積和總產(chǎn)量一直位于世界首位。甘肅省是我國(guó)北方黃瓜的主要種植區(qū)[2]，2014年種植面積達(dá)到2.33萬hm2[3]。近年來，黃瓜高密度、高復(fù)指數(shù)的種植模式使其土傳病害頻繁發(fā)生，尤其是由尖孢鐮刀菌黃瓜?；?FOC,Fusariumoxysporumf.sp.cucumerinum)侵染引起的黃瓜枯萎病，是一種極具毀滅性的土傳真菌病害[4-5]，在我國(guó)北方黃瓜主要種植區(qū)該病造成黃瓜產(chǎn)量下降10%～30%，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)80%～90%，給種植者帶來極大的經(jīng)濟(jì)損失[6-7]。

目前黃瓜枯萎病的防治方法主要采用化學(xué)防治[8]、物理防治[9]、農(nóng)業(yè)防治[10]及生物防治[11]等方法，其中以藥劑為主導(dǎo)的化學(xué)防治是控制黃瓜枯萎病的重要手段，但是長(zhǎng)期的化學(xué)防治會(huì)使病原菌產(chǎn)生抗性，導(dǎo)致防治效果衰退，而且化學(xué)藥劑在使用過程中易在土壤中殘留，會(huì)造成土壤微生物區(qū)系的破壞和多樣性下降等一系列土壤健康問題，其嚴(yán)重阻礙了黃瓜產(chǎn)業(yè)的健康和可持續(xù)發(fā)展[12-14]。

相對(duì)于化學(xué)防治，生物防治是利用高效功能微生物對(duì)黃瓜枯萎病進(jìn)行防治，是一種對(duì)環(huán)境無污染，對(duì)人畜無毒，對(duì)土壤中有益微生物無影響，對(duì)黃瓜無副作用，且尖孢鐮刀菌不易產(chǎn)生抗性，使用成本較低的防治方法[15-17]。目前已有許多生防菌劑用于植物病蟲害的防治，取得了可觀的成效，其中研究最多的高效功能微生物類群有：熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)、芽孢桿菌屬(Bacillusspp.)、木霉屬(Trichodermaspp.)[18]。據(jù)研究報(bào)道枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)制成的生物有機(jī)肥對(duì)棉花黃萎病的防治效果達(dá)到39%以上[19]；俞魯?shù)萚20]篩選的芽孢桿菌，其生物有機(jī)肥對(duì)香蕉枯萎病的防治效果達(dá)到74%；有學(xué)者用解淀粉芽孢桿菌Th-1防治西瓜枯萎病，其盆栽試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：添加菌株Th-1的處理與對(duì)照相比防治效果增加78.5%[21]；Perze-Vicente等的研究發(fā)現(xiàn)：功能微生物——哈茨木霉與抗病品種的結(jié)合，使香蕉枯萎病的防治效果達(dá)到95%[22]；有研究針對(duì)辣椒青枯病(Ralstoniasolanacarum)篩選拮抗菌，得到一株枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，其對(duì)辣椒青枯病的防治效果很好[23]。對(duì)于生物防治，高效功能微生物是其關(guān)鍵因子[1]。

本研究采集了黃瓜蔬菜大棚枯萎病發(fā)病地塊的健康植株根際土和根系，通過分離、篩選，得到2株對(duì)尖孢鐮刀菌黃瓜專化型有穩(wěn)定抑制作用的菌株QHZ-Yb1和QHZ-Yb2(以下簡(jiǎn)稱Yb1和Yb2)并對(duì)2株菌進(jìn)行了鑒定，探索了其潛在的拮抗促生因子，檢驗(yàn)了其對(duì)黃瓜種子萌發(fā)的影響及對(duì)植株防病和促生的效果，旨在為黃瓜枯萎病的生物防治及植株健壯生長(zhǎng)提供優(yōu)良菌株。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

黃瓜枯萎病病原菌：尖孢鐮刀菌黃瓜?；?FOC,Fusariumoxysporumf.sp.cucumerinum)由本實(shí)驗(yàn)室提供。

培養(yǎng)基LB、PDA、尖孢鐮刀菌選擇性培養(yǎng)基的配制，采用凌寧等的方法[24]。

菌株DNA提取試劑盒購(gòu)于上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 拮抗菌的篩選

2014年9月在甘肅省白銀市白銀區(qū)，采集黃瓜蔬菜大棚枯萎病發(fā)病地塊的健康植株根際土和根系。稱取根際土和根系共5 g，其中根系用無菌剪刀剪成1 mm的小段，進(jìn)行梯度稀釋，取10-4、10-5、10-6的稀釋液0.1 mL涂布，28 ℃恒溫培養(yǎng)3 d后挑選形態(tài)各異的菌落，純化后采用平板對(duì)峙法篩選拮抗菌，平板對(duì)峙法參照文獻(xiàn)[12]。

1.3 拮抗菌的鑒定

拮抗菌傳統(tǒng)的形態(tài)、生理生化鑒定參照《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》的方法[25-26]。

菌株16S rDNA序列測(cè)定及分析：采用Ezup柱式基因組細(xì)菌DNA抽提試劑盒(Sangon Biotech, Shanghai, China)，按照說明書的步驟提取細(xì)菌DNA。使用PCR對(duì)樣品16S rDNA進(jìn)行擴(kuò)增，引物為：27F、1492R[27]。PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min；94℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，30次循環(huán)；72 ℃ 7 min，4 ℃條件下，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化后交南京金斯瑞生物科技有限公司(Genscript，Nanjing，China)進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI基因數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對(duì)，同時(shí)使用軟件MEGA7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 拮抗菌拮抗促生因子檢測(cè)

1.4.1 拮抗菌脂肽類粗提取物的抑菌效果測(cè)定 打取直徑5 mm的黃瓜枯萎病病原菌菌餅接于PDA固體平板中央，將牛津杯放置于距中央2.5 cm處，每皿放置4個(gè)，每個(gè)牛津杯中加100 μL提取物，3次重復(fù)，25 ℃恒溫培養(yǎng)7 d后，計(jì)算其抑菌率，拮抗菌脂肽類物質(zhì)粗提取參照文獻(xiàn)[28]。

1.4.2 拮抗菌分泌IAA的測(cè)定 將活化后的菌株分別接種至LB液體培養(yǎng)基中(每升LB液體培養(yǎng)基中含色氨酸5 mmol)，28±2℃，170 r/min搖床培養(yǎng)2 d，取適量菌液，10 000 r·min-1離心10 min，取上清液1 mL于10 mL無菌離心管中，加入Salkawski’s顯色劑顯色，以不接菌的培養(yǎng)基為對(duì)照，30 min后對(duì)比觀察顏色變化。定量測(cè)定：將活化后的菌株分別接種至LB液體培養(yǎng)基中(每升LB液體培養(yǎng)基中含色氨酸5 mmol)，28±2 ℃，170 r/min搖床培養(yǎng)2 d，取適量菌液，10 000 r·min-1離心10 min，取上清液1 mL于10 mL無菌離心管中，加入PC顯色劑[29]2 mL，30 min后，測(cè)定OD530值，以空白培養(yǎng)基為對(duì)照，用純的IAA作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算菌株產(chǎn)IAA的量。

1.4.3 拮抗菌溶P能力測(cè)定 定性測(cè)定：將菌株點(diǎn)接于Pikovaskaia[30]固體平板上，每皿點(diǎn)接3次，3次重復(fù)，28±2 ℃恒溫培養(yǎng)7 d，觀察菌株是否形成溶磷圈。定量測(cè)定：制備108cell/mL的菌懸液，OD600≈ 2，分別接種各菌液1mL置100mL Pikovaskaia液體培養(yǎng)基中，28±2 ℃，170r/min搖床培養(yǎng)14d，取菌液于50mL的離心管，低溫4 ℃，10000r/min，離心20min，以不接菌的Pikovaskaia液體培養(yǎng)基作對(duì)照，用鉬銻抗比色法測(cè)定上清液中有效P含量[30]。

1.4.4 拮抗菌產(chǎn)嗜鐵素的測(cè)定 在LB液體培養(yǎng)基中，接種活化后的菌株，28±2 ℃，170 r/min搖床培養(yǎng)12 h，離心，獲取上清液，按1∶1比例取菌株上清液和CAS顯色液[31]混合，顯色2 h，以不接菌的培養(yǎng)基作對(duì)照，3次重復(fù)，若培養(yǎng)基顏色改變，則有嗜鐵素產(chǎn)生。

1.4.5 拮抗菌產(chǎn)酪蛋白酶的測(cè)定 將活化后的菌株點(diǎn)接于酪蛋白固體培養(yǎng)基[32]，每皿點(diǎn)接3次，3次重復(fù)，28±2 ℃恒溫培養(yǎng)，觀察菌株周圍有無透明圈產(chǎn)生。

1.5 菌液對(duì)黃瓜種子萌發(fā)的影響

將黃瓜種子置于60 ℃熱水中，緩慢攪拌10 min，再用1%次氯酸鈉溶液處理1 min，最后用無菌水反復(fù)沖洗。分別接種菌株Yb1和Yb2于LB液體培養(yǎng)基中，28±2 ℃，170 r/min搖床恒溫培養(yǎng)20 h，OD600≈ 2，分別吸取1 mL均勻置于墊有無菌濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿放置10粒大小均等的黃瓜種子，3次重復(fù)，再將培養(yǎng)皿置于28±2 ℃恒溫培養(yǎng)箱36 h(期間定期加1～2 mL無菌水保持培養(yǎng)皿內(nèi)濕度)，對(duì)照加等量LB液體培養(yǎng)基，觀察出芽長(zhǎng)度。

1.6 拮抗菌生物效應(yīng)研究

盆栽試驗(yàn)用土：用健康的大田土，土壤基本理化性狀：有機(jī)質(zhì)7.47 g·kg-1，堿解氮16.30 mg·kg-1，速效磷25.8 mg·kg-1，速效鉀350.84 mg·kg-1，pH為7.84。盆栽試驗(yàn)共設(shè)4個(gè)處理：T1,對(duì)照(CK)；T2,+Yb1菌懸液；T3,+Yb2菌懸液；T4,+(Yb1+Yb2)菌懸液。12盆/處理，3株/盆，5 kg土/盆，常規(guī)的水肥管理，所有處理均在黃瓜移栽前7 d接種3.29×104CFU/g尖孢鐮刀菌黃瓜?；玩咦?，移栽時(shí)各處理均勻拌入菌懸液，加菌量達(dá)到0.8×106CFU/g。

黃瓜種子用60 ℃溫水和5%過氧化氫消毒后催芽育苗，在育苗盤育苗30 d后移栽于盆缽，移栽后觀察記錄植株生長(zhǎng)和發(fā)病狀況，在移栽60d時(shí)，測(cè)定不同處理黃瓜植株的生物量[17]并計(jì)算各處理枯萎病的發(fā)病率及防治效果，測(cè)定根際可培養(yǎng)微生物的數(shù)量[20]。發(fā)病率(%)=發(fā)病植株/調(diào)查總株數(shù)×100%，防治效果=(對(duì)照發(fā)病率-處理發(fā)病率)/對(duì)照發(fā)病率×100%[14]。

采用SPSS 20進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選結(jié)果

通過7d對(duì)峙試驗(yàn)得到2株對(duì)黃瓜枯萎病病原菌具有顯著抑制作用的菌株Yb1和Yb2，抑菌帶寬度達(dá)3.37 mm和3.42 mm，抑菌圈直徑>2.7 cm，抑菌率分別達(dá)到61.9%和62.3%(圖1)。

2.2 菌株的鑒定結(jié)果

2.2.1 菌株的形態(tài)特征結(jié)果 菌株Yb1和Yb2在LB平板培養(yǎng)基上，28±2 ℃，培養(yǎng)24 h，均可呈現(xiàn)明顯菌落。Yb1菌落呈圓形、乳白色、不透明、表面褶皺、邊緣為波狀；Yb2菌落呈圓形、乳白色、不透明、表面有褶皺、邊緣不整齊；3 d后兩菌落均成褐色。菌株Yb1和Yb2革蘭氏染色均呈陽性，均為中生芽孢。

2.2.2 菌株生理生化特性的測(cè)定結(jié)果 對(duì)菌株Yb1和Yb2進(jìn)行生理生化特性的測(cè)定，結(jié)果見表1。通過自動(dòng)檢索數(shù)據(jù)庫比對(duì)測(cè)定結(jié)果，結(jié)果表明Yb1和Yb2均屬于芽孢桿菌屬。

2.2.3 菌株16S rDNA序列分析結(jié)果 菌株Yb1和Yb2的16SrDNA序列長(zhǎng)度分別為1412 bp和1417 bp。在NCBI基因數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對(duì)，繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)。結(jié)果表明：菌株Yb1與萎縮芽孢桿菌BacillusatrophaeusstrainJCM9070NR—024689.1的親緣性最高(圖3A)，菌株Yb2與萎縮芽孢桿菌BacillusatrophaeusstrainNBRC15539NR112723.1的親緣性最高(圖3B)，結(jié)合菌株的形態(tài)特征及生理生化測(cè)定結(jié)果，初步確定Yb1和Yb2均為萎縮芽孢桿菌(B.atrophaeus)。

圖1 菌株Yb1(a)和Yb2(b)對(duì)黃瓜枯萎病病原菌生長(zhǎng)的影響(7 d)Fig.1 Effects of Yb1 (a) and Yb2 (b) on the growth of Fusarium oxysporum f.sp. cucumerinum(7 d)

(a)Yb1菌落形態(tài)；(b)Yb1革蘭氏染色；(c)Yb1芽孢染色；(d)Yb2菌落形態(tài)；(e)Yb2革蘭氏染色；(f)Yb2芽孢染色(a)Colonial morphology of strainYb1; (b)Gram stain of strain Yb1; (c)Spore staining of strainYb1; (d)Colonial morphology of strain Yb2; (e)Gram stain of strain Yb2; (f)Spore staining of strain Yb2圖2 菌株Yb1和Yb2形態(tài)學(xué)鑒定Fig.2 Morphological identifications of Yb1 and Yb2

測(cè)定指標(biāo)Test index試驗(yàn)結(jié)果 ResultYb1Yb2測(cè)定指標(biāo)Test index試驗(yàn)結(jié)果 ResultYb1Yb2葡萄糖 Glucose++產(chǎn)H2S Sulfuretted hydrogen++果糖 Fructose++產(chǎn)吲哚乙酸 Indole++蔗糖 Sucrose++尿素水解 Urea hydrolysis+-淀粉 Starch++檸檬酸 Citric acid++甘油 Glycerol++苯丙氨酸 Phenylalanine+-V-P試驗(yàn) V-P test++色氨酸Tryptophane++M-R試驗(yàn) M-R test--酪氨酸 Tyrosine++淀粉水解 Amylolysis++接觸酶 Catalase++明膠液化 Gelatine liquefication++硝酸鹽還原 Nitrate reduction++產(chǎn)氨 Production of ammonia++石蕊牛奶試驗(yàn) Litmus milk test++

注：+：陽性反應(yīng)；-：陰性反應(yīng)。 Note:+:positive reaction;-:negative reaction.

圖3 Yb1(A)和Yb2(B)系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 The phylogenetic tree of Yb1 and Yb2

2.3 菌株拮抗促生因子檢測(cè)結(jié)果

2.3.1 菌株脂肽類粗提取物的抑菌效果 菌株Yb1和Yb2脂肽類粗提物的抑菌效果如圖4，抑菌率分別為57.4%和58.0%。

2.3.2 菌株分泌IAA的測(cè)定結(jié)果 如圖5結(jié)果顯示，加入Salkawski’s顯色劑，顯色30 min后，菌株Yb1和Yb2的上清液均較CK顏色變深，說明菌株Yb1和Yb2均分泌IAA。定量測(cè)定結(jié)果表明，菌株Yb1和Yb2分泌IAA的量分別為1.56 mg·L-1，3.69 mg·L-1。

圖4 Yb1(a)和Yb2(b)脂肽類粗提物對(duì)黃瓜枯萎病病原菌生長(zhǎng)的影響Fig.4 Effects of lipopeptide from Yb1(a) and Yb2(b)on the growth of pathogen of cucumber wilt

圖5 菌株Yb1(a)和Yb2(b)產(chǎn)IAAFig.5 IAA produced from Yb1(a) and Yb2(b)

2.3.3 菌株溶P能力測(cè)定結(jié)果 圖6結(jié)果顯示，在菌株Yb1和Yb2的菌落周圍有明顯的溶磷圈，且后者顯著大于前者，定量測(cè)定結(jié)果表明，菌株Yb1和Yb2的溶磷量分別為0.77 mg·L-1和1.19 mg·L-1。

2.3.4 菌株產(chǎn)嗜鐵素的測(cè)定結(jié)果 如圖7結(jié)果顯示，對(duì)比CK，菌株Yb1和Yb2的上清液顏色改變，說明菌株Yb1和Yb2均產(chǎn)嗜鐵素。

2.3.5 菌株產(chǎn)蛋白酶的測(cè)定結(jié)果 點(diǎn)接在酪蛋白培養(yǎng)基(圖8)上的Yb1和Yb2菌株周圍均有明顯的透明圈產(chǎn)生，說明兩菌株均有產(chǎn)酪蛋白酶的能力且Yb2菌株產(chǎn)酪蛋白酶的能力強(qiáng)于Yb1。

圖6 菌株Yb1和Yb2溶PFig.6 Phosphorus solubilization from Yb1 and Yb2

圖7 菌株Yb1(a)和Yb2(b)產(chǎn)嗜鐵素Fig.7 Siderophore produced from Yb1(a) and Yb2(b)

2.4 菌液對(duì)黃瓜種子萌發(fā)的影響結(jié)果

如圖9所示，黃瓜種子催芽36 h后，接種Yb1和Yb2菌液的黃瓜種子出芽長(zhǎng)度明顯長(zhǎng)于CK，說明菌株Yb1和Yb2均能促進(jìn)黃瓜種子的萌發(fā)及芽的生長(zhǎng)。

2.5 拮抗菌生物效應(yīng)研究結(jié)果

如表2所示，對(duì)比CK，Yb1、Yb2、Yb1+Yb2菌懸液的處理不僅對(duì)黃瓜枯萎病有不同程度的生防效果，而且均使植株生物量增加。對(duì)比CK，Yb1和Yb2菌懸液無論是單獨(dú)使用還是加和在一起使用，都使黃瓜枯萎病的發(fā)病率降低5.0%以上，防治效果達(dá)到6.0%以上，其中Yb1+Yb2菌懸液的處理使黃瓜枯萎病的發(fā)病率降低了11.11個(gè)百分點(diǎn)。黃瓜移栽后60 d，接種Yb1、Yb2和Yb1+Yb2菌懸液處理的株高分別比CK增加了52.1%、34.0%和73.7%，植株干重增加了17.9%、8.9%和56.7%，植株地上部和根系干重分別增加了15.97%和6.14%、53.07%和61.11%、77.78%和138.89%?？梢钥闯觯琘b1和Yb2無論對(duì)黃瓜植株地上部還是根系生長(zhǎng)的促進(jìn)作用，均具有明顯的加和效果。

各處理對(duì)黃瓜根際土中可培養(yǎng)微生物數(shù)量的計(jì)數(shù)結(jié)果如表3所示?？梢钥闯?，與CK相比，Yb1、Yb2和Yb1+Yb2菌懸液處理的黃瓜植株根際土中的細(xì)菌、放線菌數(shù)量明顯增加，真菌和尖孢鐮刀菌數(shù)顯著減少，說明拮抗菌Yb1和Yb2能夠抑制病原菌的數(shù)量，使根際微生物區(qū)系向健康轉(zhuǎn)變，有利于降低植株發(fā)病率而且加和效果突出。

圖8 菌株Yb1(a)和Yb2(b)產(chǎn)蛋白酶Fig.8 Casease produced from Yb1(a) and Yb2(b)

圖9 菌株Yb1(a)和Yb2(b)對(duì)黃瓜種子萌發(fā)的影響Fig.9 Effects of the strains of Yb1(a) and Yb2 (b) on cucumber seed germination

處理Treatment發(fā)病率Incidence of disease/%防治效果Control efficiency/%株高Plant height/cmPlant dry weight/g地上部干重Shootdry weight/g地下部干重Underground dry weight/gCK80.55±4.81a--48.50±2.52d4.25±0.10c4.07±0.11c0.18±0.03dYb175.00±0.00ab6.9073.75±2.87b5.01±0.08b4.72±0.06b0.29±0.02cYb272.22±4.81b10.3465.00±2.94c4.63±0.39b4.32±0.38b0.32±0.03bYb1+ Yb269.44±2.73b13.7984.25±3.78a6.66±0.12a6.23±0.14a0.43±0.02a

注：同列數(shù)值后不同字母表示差異達(dá)5%顯著水平。下同。

Note:Values followed by different small letters in the same column mean significant at 5% level. The same as below.

表3 不同處理對(duì)黃瓜根際土中可培養(yǎng)微生物數(shù)量的影響

3 結(jié)論與討論

芽孢桿菌是一類重要的生防菌，不僅對(duì)植物病害有防治作用而且能夠促進(jìn)植物的生長(zhǎng)發(fā)育[33]。有研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌B29，其菌劑(7×106CFU·mL-1)對(duì)黃瓜枯萎病的田間防效達(dá)84.9%，增產(chǎn)12.57%[34]。據(jù)研究報(bào)道生防菌CT205不僅對(duì)黃瓜生長(zhǎng)有促進(jìn)作用而且對(duì)黃瓜枯萎病的防治效果達(dá)到51.85%[35]。有研究者對(duì)幾株芽孢桿菌的促生能力進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其對(duì)溫室條件下的玉米和番茄有顯著的促生作用[36]。本研究通過平板對(duì)峙試驗(yàn)篩選到2株拮抗效果好的菌株：Yb1和Yb2，通過形態(tài)學(xué)結(jié)合生理生化及菌株16S rDNA序列分析，初步確定這兩株菌均為萎縮芽孢桿菌(Bacillusatrophaeus)。

生防芽孢桿菌通過產(chǎn)生抗菌物質(zhì)及其它生防機(jī)制共同或單獨(dú)作用發(fā)揮良好的生防效果[37]。生防芽孢桿菌發(fā)揮抗菌作用抑制病原菌主要源于其分泌的脂肽類抗生素，包括伊枯草素(Iturin)、泛革素(Fengycin)和表面活性素(Surfactin)三大類脂肽[38]。陳莉的研究發(fā)現(xiàn)萎縮芽孢桿菌(Bacillusatrophaeus)B44產(chǎn)生的iturin A是關(guān)鍵的抑菌活性物質(zhì)，菌株B44在田間條件下，對(duì)棉苗立枯病、棉花黃萎病、加工番茄根腐病均有良好的生防治效果[39]。生防菌Bs-916分泌的脂肽類化合物BacillomycinL，用500 μg·mL-1防治水稻紋枯病和苗瘟，防效分別為70.8%和56.3%[40]。生防芽孢桿菌也可以通過分泌細(xì)胞壁降解酶抑制病原菌的生長(zhǎng)[41]以及通過產(chǎn)嗜鐵素，在與病原菌競(jìng)爭(zhēng)鐵元素時(shí)占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，使病原菌因缺鐵而生長(zhǎng)異常，進(jìn)而起到生防作用[38]。研究發(fā)現(xiàn)菌株Yb1和Yb2的脂肽類粗提取物(用量：100 μL)對(duì)黃瓜枯萎病病原菌的抑菌率分別達(dá)到57.4%和58.0%，且均產(chǎn)蛋白酶和嗜鐵素，菌株Yb2產(chǎn)蛋白酶的能力較Yb1強(qiáng)，說明菌株Yb1和Yb2具有良好的生防潛力，Yb2的防治效果或許強(qiáng)于Yb1；盆栽試驗(yàn)檢驗(yàn)菌株Yb1和Yb2的生防能力發(fā)現(xiàn)：Yb1、Yb2及Yb1+Yb2菌懸液處理對(duì)黃瓜枯萎病的防治效果分別為6.9%、10.34%、13.79%，菌株Yb2的生防效果較Yb1好，這與菌株平板對(duì)峙試驗(yàn)和菌株脂肽類粗提取物的抑菌效果及酪蛋白酶的分泌量結(jié)果一致；Yb1+Yb2菌懸液處理的生防效果最好，說明兩菌株具有加和效應(yīng)。

有些生防芽孢桿菌通過促進(jìn)植物生長(zhǎng)間接的發(fā)揮其生防作用[42]，其促生機(jī)制包括：產(chǎn)生長(zhǎng)素(IAA)促進(jìn)植物生長(zhǎng)、產(chǎn)嗜鐵素將多余的鐵元素供給植物、溶磷使土壤中無效態(tài)磷轉(zhuǎn)化成有效態(tài)磷[43]等。菌株Yb1和Yb2既能分泌生長(zhǎng)素(IAA)，也可溶磷并產(chǎn)嗜鐵素，通過種子發(fā)芽試驗(yàn)及盆栽試驗(yàn)檢驗(yàn)其防病和促生能力發(fā)現(xiàn)：菌株Yb1和Yb2對(duì)黃瓜種子的萌發(fā)有促進(jìn)作用。盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明：對(duì)比CK，Yb1、Yb2及Yb1+Yb2菌懸液處理均使黃瓜植株生物量增加，株高分別增加了52.1%、34.0%、73.7%，植株干重增加了17.9%，8.9%和56.7%，植株地上部和根系干重分別增加了15.97%、6.14%、53.07%，61.11%、77.78%、138.89%。以上說明，菌株Yb1和Yb2對(duì)黃瓜植株地上部及根系生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用且有明顯的加和效應(yīng)；株高和植株地上部干重的增加量Yb1>Yb2，根系干重的增加量Yb2>Yb1，這可能與菌株促生機(jī)制的主要作用部位和產(chǎn)生量有關(guān)。

根際是病原微生物和有益微生物的運(yùn)動(dòng)場(chǎng)和戰(zhàn)場(chǎng)[44]，根際病原微生物和有益微生物的數(shù)量和密度對(duì)植物生長(zhǎng)和健康有非常重要的影響[45-46]。健康的根際體系，微生物群體相對(duì)平衡，這種平衡一旦被打破，有益微生物減少，病原微生物增加，從而導(dǎo)致植物病害產(chǎn)生及作物產(chǎn)量下降[47]。在土壤中添加有益微生物，不僅改善根際微生物群體的相對(duì)平衡，而且有利于防治植物病害。盆栽試驗(yàn)的結(jié)果表明：與CK相比，Yb1、Yb2及Yb1+Yb菌懸液處理尖孢鐮刀菌及真菌數(shù)量明顯減少，細(xì)菌和放線菌的數(shù)量增加，根際微生物區(qū)系明顯改善，結(jié)果與其防治效果一致，兩種菌的加和處理對(duì)尖孢鐮刀菌的抑制效果更好。

菌株Yb1和Yb2不僅具有多種拮抗促生因子，而且在實(shí)踐中表現(xiàn)了抗病促生能力，因此菌株Yb1和Yb2具有生防潛力，兩株菌配合應(yīng)用效果更好。

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