藍(lán)鐵瓚 王代友 曹陽 楊亦萍 卿海云 曾祥林
巨自噬(macro-autophagy),簡稱自噬,是細(xì)胞通過雙層膜狀結(jié)構(gòu)包繞受損細(xì)胞器或大分子并將之運(yùn)送到溶酶體加以降解利用的現(xiàn)象[1]。自噬與某些細(xì)胞放射敏感性密切相關(guān)[2-3],與細(xì)胞凋亡相關(guān)。放射后唾液腺細(xì)胞大量凋亡[4-5]。對射線較為敏感的唾液腺的自噬情況以及自噬與凋亡關(guān)系,目前國內(nèi)尚無文獻(xiàn)報(bào)道。本研究觀察放射前后大鼠腮腺細(xì)胞自噬、凋亡情況,檢測分析 Bcl-2、Bax、Beclin1、LC3(microtubule associated protein 1 light chain3,LC3)表達(dá),探討放射對腮腺細(xì)胞自噬的影響及放射后腮腺自噬與凋亡的關(guān)系,為研究唾液腺放射損傷的防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。
60Co遠(yuǎn)距離治療機(jī)(GWXJ80型,中國核動力研究設(shè)計(jì)院設(shè)備制造廠),透射電鏡(Hitachi公司,H-7650型,日本)。正置熒光相差顯微鏡成像分析系統(tǒng)(OLYMPUS公司,日本)。Bax、Beclin1及LC3兔抗鼠多克隆抗體(北京博奧森);Bcl-2兔抗鼠多克隆抗體、通用型SP檢測試劑盒及DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋);粉劑型酸性抗原修復(fù)液(福州邁新)。
健康雄性SD大鼠54只(廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心),10周齡,體重210~250 g。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d,隨機(jī)分為9組,6只/組,對照組、6 Gy放射組及12 Gy放射組各3組。
頭頸部照射方式參照王代友等[4]方法。10%水合氯醛麻醉后,大鼠仰臥位固定,鎖骨之下用鉛塊遮擋,鎖骨以上部位暴露于射線。60Coγ射線放射源固定,射野約3.5 cm×5 cm,源皮距80 cm,放射中心在皮下10 mm,單次傳輸所需放射劑量,吸收劑量率為0.554 7 Gy/min。
放射后12、24和48 h,麻醉后處死不同放射劑量組各一組。隨機(jī)取3只/組,60 s內(nèi),將右側(cè)腮腺切成約1 mm3組織塊,迅速放入預(yù)冷3%戊二醛溶液中固定,4℃保存3 h,按電鏡常規(guī)要求處理,制超薄片,染色,觀察。剩余腮腺在10%中性福爾馬林中室溫固定24 h,制備蠟塊。
蠟塊連續(xù)切片,厚度4μm,烤片,脫蠟,復(fù)水,修復(fù)液(pH 6.0)高壓修復(fù)。用免疫組織化學(xué)SABC法檢測。一抗為Bcl-2、Bax、Beclin1、LC3兔抗鼠多克隆抗體(濃度分別1∶100、1∶100、1∶250、1∶250)。陽性對照標(biāo)本為正常腮腺,以PBS液代替一抗行空白對照。其它步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。蘇木精復(fù)染,胞漿胞膜出現(xiàn)棕黃色為目標(biāo)蛋白陽性信號。正置熒光相差顯微鏡成像分析系統(tǒng)觀察每張切片,在400倍光鏡下病理圖像分析系統(tǒng)(IPP軟件)按機(jī)械抽樣隨機(jī)選取5個視野,分析目標(biāo)蛋白表達(dá),表達(dá)強(qiáng)弱以平均吸光度值(A)表示。
透射電鏡下,每標(biāo)本隨機(jī)選取、觀察記錄25個非壞死細(xì)胞中凋亡細(xì)胞、自噬陽性細(xì)胞與自噬并凋亡細(xì)胞數(shù)量,計(jì)算自噬率與凋亡率。評判標(biāo)準(zhǔn):胞漿中至少含1個自噬體或自噬溶酶體細(xì)胞為自噬陽性細(xì)胞;細(xì)胞核縮小、變形、染色質(zhì)邊集、核周間隙增寬的細(xì)胞為凋亡細(xì)胞;1個細(xì)胞有自噬和凋亡特征時計(jì)為自噬陽性細(xì)胞、凋亡細(xì)胞。
數(shù)據(jù)用珋x±s表達(dá),采用SPSS 16.0軟件包進(jìn)行分析,方差齊性檢驗(yàn)后,如方差齊,用單因素方差分析,樣本均數(shù)兩兩比較,用LSD-t檢驗(yàn),方差不齊,用非參數(shù)檢驗(yàn)。P<0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
透射電鏡下,對照組和放射組均見到自噬細(xì)胞和凋亡細(xì)胞。細(xì)胞中見到不同時期的自噬體及自噬溶酶體(圖1A~C)。部分正常細(xì)胞及凋亡細(xì)胞存在自噬溶酶體或自噬體(圖1D~F)。與相應(yīng)時間對照組比較,各放射組細(xì)胞凋亡率顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),各放射組自噬陽性細(xì)胞所占比例無明顯變化,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖1、表1)。
2.2.1 Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)變化 與相應(yīng)時間點(diǎn)對照組比較,放射后12、24和48 h,6 Gy放射組或12 Gy放射組Bcl-2蛋白表達(dá)均顯著下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.003 和 0.010,0.006 和 0.000,0.002 和0.001,<0.05)。
放射后12 h,與對照組比較,6 Gy放射組Bax蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),而12 Gy放射組Bax蛋白表達(dá)顯著增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.003,P <0.05)。放射后24和48 h,6 Gy放射組或12 Gy放射組Bax蛋白表達(dá)水平高于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000 和0.002,0.004 和0.000,<0.05)(表 2,圖 2)。
2.2.2 Beclin1、LC3蛋白表達(dá) 放射后12、24及48 h,與對照組比較,各放射組的Beclin1及LC3白蛋表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表3,圖2)。
自噬消化降解細(xì)胞內(nèi)大分子物質(zhì)以及受損細(xì)胞器,在維護(hù)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境動態(tài)穩(wěn)定方面起重要作用[6],在自噬過程中,Beclin l分子及LC3分子起到重要作用。Beclin l是候選腫瘤抑制基因,LC3參與自噬膜的形成,是自噬形成的標(biāo)志性因子。Bcl-2是凋亡抑制蛋白、Bax蛋白是促凋亡蛋白,水平變化可反應(yīng)細(xì)胞凋亡的變化。目前,用透射電鏡觀察自噬和凋亡形態(tài)特征是檢驗(yàn)細(xì)胞自噬和凋亡的可靠手段。
A:對照組自噬體(Ap);B:放射組早期自噬溶酶體(AL);C:放射組晚期AL;D:正常腮腺細(xì)胞;E:對照組凋亡細(xì)胞;F:放射組凋亡細(xì)胞(×20 000);AL:自噬溶酶體;ER:內(nèi)質(zhì)網(wǎng);M:線粒體;N:細(xì)胞核;A~C:×50 000;D~F:×20 000圖1 透射電鏡下觀察腮腺細(xì)胞的自噬與凋亡A:Autophagosome(Ap)in control group;B:Early autolysosome(AL)in radiation group;C:Late AL in radiation group;D:Normal parotid gland cell;E:Apoptosis cell in control group;F:Apoptosis cell in radiation group;AL:Autophagolysosome;ER:Endoplasmic reticulum;M:Metochondria;N:Nucleus;A-C: ×50 000;D-F: ×20 000Fig 1 The autophagy and apoptosis of parotid gland cells observed by transmission electron microscope
表1 各組腮腺組織中細(xì)胞凋亡率及自噬陽性細(xì)胞在細(xì)胞中所占比例(珋x±s,n=3)Tab 1 The apoptosis rate and percentage of autophagy positive cells in parotid gland tissues of the groups(珋x±s,n=3)
本研究發(fā)現(xiàn),與對照組相比,各放射組腮腺中自噬陽性率、Beclin1、LC3的表達(dá)水平均無明顯變化,結(jié)果與Maria等[7]報(bào)道單次5 Gy60Coγ射線放射后4~8 h腮腺自噬水平無明顯變化的結(jié)果相似,說明放射后12~48 h,單次6 Gy或12 Gy60Coγ射線對腮腺細(xì)胞自噬的影響可能是有限的。有研究表明放射后心肌細(xì)胞[8]和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞[9]自噬水平均調(diào)高,自噬缺陷的腮腺細(xì)胞放射敏感性增加[7]。我們推測,腮腺細(xì)胞特性可能是放射后自噬水平無明顯變化的原因之一,放射后不能顯著提高自噬水平可能是腮腺放射敏感機(jī)制之一。
Maria等[7]認(rèn)為放射后腮腺自噬與凋亡可能 相互抑制。本研究結(jié)果示放射組細(xì)胞凋亡率顯著增加,Bcl-2蛋白/Bax蛋白比值變小,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,進(jìn)一步證實(shí)放射誘導(dǎo)腮腺細(xì)胞凋亡,自噬無變化,結(jié)果不支持Maria等觀點(diǎn),可能與放射劑量不同有關(guān)。放射后腮腺細(xì)胞同時存在自噬與凋亡現(xiàn)象,提示兩者之間可能存在某種關(guān)聯(lián);唾液腺細(xì)胞是先自噬后凋亡[10],
還是在損傷后先自噬以自救,當(dāng)損傷超過自噬承受力時,自噬才誘導(dǎo)凋亡[11],這有待進(jìn)一步研究。
表2 Bcl-2、Bax蛋白在各組腮腺組織的表達(dá)(珋x±s,n=6)Tab 2 The expression of Bcl-2 and Bax protein in parotid gland tissues of the groups(珋x±s,n=6)
表3 Beclin1及LC3蛋白在各組腮腺組織中的表達(dá)(珋x±s,n=6)Tab 3 The expression of Beclin1 and LC3 protein in parotid gland tissues of the groups(珋x±s,n=6)
圖2 Bcl-2、Bax、Beclin1、LC3蛋白在腮腺組織中的表達(dá) (免疫組化SABC,×400)Fig 2 The expression of Bcl-2,Bax,Beclin1 and LC3 protein in parotid gland tissues (IHC SABC,×400)
綜上述,60Coγ射線能激活腮腺細(xì)胞凋亡,但其對腮腺細(xì)胞自噬的影響可能是微弱的;放射后腮腺細(xì)胞的凋亡可能與自噬相關(guān)。
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