崔詩曼 張清彬 左志向 曹威 賴世翔

口腔頜骨缺損或吸收常伴有局部炎癥反應(yīng)，其中腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)是公認(rèn)的炎癥因子，亦是造成組織破壞的主要因素，影響骨組織的再生［1］。

近年來長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，LncRNA)是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200 nt的RNA分子，雖不直接參與蛋白質(zhì)的編碼，但可通過表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后等途徑調(diào)控靶基因的表達(dá)［2］。已有研究分析骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、牙周膜干細(xì)胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)骨向分化中LncRNA的表達(dá)特征［3－4］，證實 LncRNA 與細(xì)胞分化機體發(fā)育有著密切聯(lián)系。而TNF-α作用下PDLSCs骨向分化中 LncRNA的表達(dá)特征，目前還未見報道。本研究旨在探究TNF-α對PDLSCs骨向分化的作用，并應(yīng)用高通量測序技術(shù)分析其中LncRNA的差異表達(dá)情況。

1 資料與方法

1.1 樣本來源

由本醫(yī)院頜面外科門診提供所需樣本，選取18～25歲、即將正畸治療的患者所拔除的健康第一或第二前磨牙。本研究已獲得醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)(編號:000120150701)及患者的知情同意。

1.2 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基、Ⅰ型膠原酶、青霉素、鏈霉素(Gibco，美國);胎牛血清(FBS，Hyclone，美國);β-甘油磷酸鈉、地塞米松、維生素 C、TNF-α、茜素紅(Sigma，美國);PBS溶液、兔抗鼠二抗(上海博士德公司);TRIzol Reagent(Invitrogen，美國);抗人堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)抗體、抗人骨鈣蛋白(osteocalcin，OCN)抗體、抗人核心結(jié)合蛋白因子2(runt-related transcription factor2，Runx2) 抗體(Abcam，美國);高通量測序由深圳恒創(chuàng)基因科技有限公司測試完成。

1.3 實驗方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將拔除的新鮮牙齒樣本迅速置于培養(yǎng)液(90%DMEM、10%FBS、100 μg/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素)內(nèi)浸泡。于超凈臺內(nèi)用PBS沖洗，刀片刮取根中下1/3的牙周膜，剪碎，1 000 r/min離心5 min。棄上清，加入Ⅰ型膠原酶(3 mg/ml)1 ml，吹打混勻，37℃水浴45 min。取出后加入培養(yǎng)液終止消化，1 000 r/min離心5 min，棄上清，1 ml培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)。置于 CO2(5%)、37℃的細(xì)胞孵育箱，2～3 d更換培養(yǎng)液。傳至第3代作為實驗用細(xì)胞。實驗組:加入TNF-α(10 ng/ml)［5］的成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng);對照組:單純成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)，包括DMEM(90%)、FBS(10%)、青霉素(100 μg/ml)、鏈霉素(100 μg/ml)、β-甘油磷酸鈉(10 mmol/L)、地塞米松(100 nmol/L)及維生素 C(50 μg/ml)。培養(yǎng)至不同時間點獲取細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)檢測。

1.3.2 茜素紅染色及定量 連續(xù)培養(yǎng)21 d，吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定20 min，吸去多聚甲醛，PBS洗滌3次，加入茜素紅染液，室溫靜置30 min，吸去茜素紅，PBS洗滌2次，顯微鏡下觀察并拍照。吸去PBS，加入氯化十六烷吡啶1 ml，室溫靜置15 min，于540 nm波長下對溶液的吸光值(A)進(jìn)行測定。

1.3.3 RT-PCR檢測 連續(xù)培養(yǎng)7 d，采用酚 －氯仿提取法提取2組細(xì)胞總RNA，根據(jù)Prime ScriptTMRTPCR Kit”及“SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒說明完成RNA的反轉(zhuǎn)錄和熒光實時定量PCR測定。檢測相關(guān)成骨基因ALP、OCN及RUNX2，內(nèi)參為GAPDH，引物由上海捷銳生物工程公司設(shè)計合成(表1)。

1.3.4 Western blot檢測 連續(xù)培養(yǎng)7 d，提取2組細(xì)胞總蛋白，經(jīng)Bradford蛋白濃度試劑盒及BAC蛋白定量試劑盒對樣品進(jìn)行檢測定量，按1∶3的比例加入蛋白上樣緩沖液，煮沸5 min，置于－80℃冰箱待用。制備SDS-PAGE膠，依照蛋白分子量大小進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后，洗膜后加入一抗，4℃靜置過夜。次日洗膜后加入二抗，4℃靜置2 h，洗膜后于暗室中將ECL熒光劑滴置轉(zhuǎn)移膜上，最后進(jìn)行顯影定影及曝光。

表1 RT-PCR引物序列Tab 1 Primer sequences for RT-PCR

1.3.5 高通量測序分析 連續(xù)培養(yǎng)7 d，選擇酚－氯仿提取法提取細(xì)胞總RNA，質(zhì)檢合格后樣本送檢。利用Illumina PE150進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)第二代高通量測序。根據(jù) LncRNA的測序結(jié)果，經(jīng)折疊倍率(Fold change，F(xiàn)C)篩選出差異表達(dá)顯著的LncRNA，參數(shù)選擇標(biāo)準(zhǔn)為P＜0.05，F(xiàn)C≥2或≤－2。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

各實驗均設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)，并平行處理3次。數(shù)據(jù)的分析使用SPSS 17.0，采用單因素方差分析，不同組別間的差異性分析使用t檢驗，當(dāng)P＜0.05時表示結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞的分離培養(yǎng)

PDLSCs培養(yǎng)5～10 d后，顯微鏡下見細(xì)胞沿著組織塊4周生長，呈放射狀、貼壁生長;培養(yǎng)7～14 d后細(xì)胞開始融合;傳代之后呈快速增長趨勢，3～5 d后融合度大概為90%。細(xì)胞鑒定已于前期實驗完成［6］。

2.2 TNF-α對PDLSCs骨向分化作用的影響

分別對2組細(xì)胞進(jìn)行茜素紅染色，并于倒置顯微鏡下觀察，見細(xì)胞基質(zhì)內(nèi)有礦化結(jié)節(jié)形成，呈紅褐色、散在分布。與對照組相比，實驗組生成的結(jié)節(jié)面積更小、顏色更淺(圖1A、1B)。這與礦化結(jié)節(jié)的定量檢測結(jié)果一致(圖1C)。在后續(xù)RT-PCR和Western blot實驗中，實驗組相關(guān)成骨基因和蛋白的表達(dá)均明顯低于對照組(圖2～3)。說明TNF-α抑制PDLSCs的骨向分化能力。

2.3 TNF-α調(diào)控PDLSCs骨向分化中差異表達(dá)的Ln-cRNA

測序結(jié)果的散點圖顯示兩組樣本差異基因的分布情況，紅色點為有統(tǒng)計學(xué)意義的差異表達(dá)的LncRNA(圖4)。其中差異表達(dá)顯著上調(diào)的有57條，顯著下調(diào)的有26條。分別選取差異表達(dá)顯著上調(diào)的2條LncRNA(LINC00473、GK-AS1)和顯著下調(diào)的2條LncRNA(SGOL1-AS1、ZNF385D-AS1)(表 3)，利用RT-PCR技術(shù)進(jìn)行驗證，驗證結(jié)果具有較高的一致性 (圖5)。結(jié)合miRcode注釋分析發(fā)現(xiàn)，LINC00473位于人類第6條染色體上，為miR-23a等microRNA的前體。

A:對照組(×40);B:實驗組(×40);C:茜素紅染色定量圖1 茜素紅染色及定量A:Control group(×40);B:Test group(×40);C:Quantification analysisFig 1 Alizarin red staining and quantification analysis

圖2 相關(guān)成骨基因的表達(dá)Fig 2 Expression of osteogenesis relatied gene(RT-PCR)

3 討論

自PDLSCs發(fā)現(xiàn)以來，國內(nèi)外很多研究已在體內(nèi)或體外證實了其骨向分化能力，能促進(jìn)骨組織再生［7－8］，而干細(xì)胞的骨向分化能力很可能受炎癥環(huán)境影響［9］。TNF-α在牙周炎骨喪失過程中扮演著重要作用，并參與啟動炎癥反應(yīng)［10］。在本研究中，我們通過茜素紅染色、RT-PCR、Western blot檢測，證實了TNF-α對PDLSCs骨向分化能力的抑制作用。

圖3 相關(guān)成骨蛋白的表達(dá)Fig 3 Expression of osteogenesis relatied protein(Western blot)

PDLSCs骨向分化作用受多種因素調(diào)控，包括生長因子(TGF-β 等)、轉(zhuǎn)錄因子(Runx2、NF-κB 等)、細(xì)胞因子 (IL-6、IFN-γ 等)、機制通路 (Wnt/β-catenin、BMP)以及 microRNA 等［11－13］。以上機制的研究已有顯著進(jìn)展，而近期有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，lncRNA與人類的成骨進(jìn)程密切相關(guān)［14］。Jia 等［4］證明 LncRNA-ANCR 是PDLSCs增殖和骨向分化的關(guān)鍵調(diào)控因子。

表2 差異表達(dá)顯著的LncRNATab 2 Differential expression of LncRNA

圖4 差異表達(dá)的LncRNA分布情況Fig 4 Distribution of differentially expressed LncRNA

圖5 RT-PCR驗證測序結(jié)果中LncRNA表達(dá)趨勢Fig 5 Comparison between sequencing data and RT-PCR result for LncRNA

本研究采用高通量測序技術(shù)，探索TNF-α調(diào)控PDLSCs骨向分化過程中l(wèi)ncRNA的差異表達(dá)。結(jié)果顯示，差異表達(dá)顯著上調(diào)的lncRNA有57條，顯著下調(diào)的有 26條，說明 lncRNA與 TNF-α作用下的PDLSCs骨向分化具有相關(guān)關(guān)系。同時通過miRode注釋分析發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)顯著上調(diào)的lncRNA:LINC00473為miR-23a等microRNA的前體。有研究發(fā)現(xiàn)miR-23a可通過抑制 Runx2的翻譯來抑制成骨分化［15］。而lncRNA可作為microRNA的前體進(jìn)一步加工處理成為成熟的microRNA，進(jìn)而抑制基因的表達(dá)［16］?；谝陨媳尘埃覀兲岢黾僭O(shè)，LINC00473可能參與抑制PDLSCs的骨向分化，但具體機制尚需進(jìn)一步驗證。本研究為探索TNF-α調(diào)控PDLSCs骨向分化的機制研究提供新的靶點和方向，為頜面部骨組織缺損修復(fù)提供理論依據(jù)。

［1］ Cochran DL，Jones A，Heijl L，et al.Periodontal regeneration with a combination of enamel matrix proteins and autogenous bone grafting［J］.J Periodontol，2003，74(9):1269－1281.

［2］ Wang KC，Chang HY.Molecular mechanisms of long noncoding RNAs［J］.Mol Cell，2011，43(6):904 －914.

［3］ Dong R，Du J，Wang L，et al.Comparison of long noncoding RNA and mRNA expression profiles in mesenchymal stem cells derived from human periodontal ligament and bone marrow［J］.Biomed Res Int，2014，2014:317853.

［4］ Jia Q，Jiang W，Ni L，et al.Down-regulated non-coding RNA(lncRNA-ANCR)promotes osteogenic differentiation of periodontal ligament stem cells［J］.Arch Oral Biol，2015，60(2):234－241.

［5］ Kong X，Liu Y，Ye R，et al.GSK3β is a checkpoint for TNF-α-mediated impaired osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells in inflammatory microenvironments［J］.Biochim Biophys Acta，2013，1830(11):5119－5129.

［6］ Um S，Choi JR，Lee JH，et al.Effect of leptin on differentiation of human dental stem cells［J］.Oral Dis，2011，17(7):662－669.

［7］ Seo BM，Miura M，Gronthos S，et al.Investigation of multipotent postnatal stem cells from human periodontal ligament.［J］.Lancet，2004，364(9429):149 －155.

［8］ 張清彬，張兆強，曹威，等.Sirtuin 1促進(jìn)牙周膜干細(xì)胞骨向分化的實驗研究［J］.口腔醫(yī)學(xué)研究，2014，30(6):531－533.

［9］ Pluchino S，Muzio L，Imitola J，et al.Persistent inflammation alters the function of the endogenous brain stem cell compartment［J］.Brain，2008，131(Pt 10):2564 － 2578.

［10］ Zhang S，Barros SP，Moretti AJ，et al.Epigenetic regulation of TNFA expression in periodontal disease［J］.J Periodontol，2013，84(11):1606 －1616.

［11］ Hakki SS，F(xiàn)oster BL，Nagatomo KJ，et al.Bone morphogenetic protein-7 enhances cementoblast function in vitro［J］.JPeriodontol，2010，81(11):1663 －1674.

［12］ 陳小燕，丁寅，金巖，等.TNF-α通過NF-κB信號通路對人牙周膜干細(xì)胞成骨分化調(diào)控作用的研究［J］.口腔生物醫(yī)學(xué)，2015，6(3):124－128.

［13］ 楊倩娟，劉文佳，陸群，等.miR-20a對人炎癥牙周膜干細(xì)胞成骨分化能力的影響［J］.實用口腔醫(yī)學(xué)雜志，2016，32(2):186－189.

［14］ Bergmann JH，Li J，Eckersley-Maslin MA，et al.Regulation of the ESC transcriptome by nuclear long noncoding RNAs［J］.Genome Res，2015，25(9):1336 －1346.

［15］ Zhang Y，Xie RL，Croce CM，et al.A program of microRNAs controls osteogenic lineage progression by targeting transcription factor Runx2［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2011，108(24):9863－9868.

［16］ Kim VN.MicroRNA biogenesis:Coordinated cropping and dicing［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2005，6(5):376 －385.