楊慧慈 江曉霞 張建 張庭華 周立成 張淳

【摘 要】目的：優(yōu)化GST-hEGF融合蛋白工程菌pGEX-EGF/BL21STAR（DE3）pLysS 30L發(fā)酵罐培養(yǎng)及表達條件。方法：上罐發(fā)酵采用M9-YT-Glu發(fā)酵培養(yǎng)基，IPTG誘導；通過還原SDS-PAGE法測定目標蛋白表達量、落計數(shù)法測定質(zhì)粒丟失率，以確定表達溫度、時間以及IPTG添加量等參數(shù)。結果與討論：hEGF重組菌誘導溫度為30℃、加入終濃度0.2M IPTG誘導，維持誘導時間4hr，目的蛋白表達量占菌體蛋白總量的30%左右，為后續(xù)rEGF融合蛋白純化奠定了基礎。

【關鍵詞】人表皮生長因子；融合蛋白；發(fā)酵條件優(yōu)化

【中圖分類號】R786 【文獻標識碼】A 【文章編號】2095-6851（2018）04-0-01

人表皮生長因子（hEGF）由Cohen等人于1975年從人體尿液中分離得到，又被稱為抑胃素（Urogastrone）[1]。hEGF在多種疾?。ㄈ缃悄p傷和糖尿病足等）的治療中體現(xiàn)出顯著的效果[2]，其藥用開發(fā)具有巨大的潛力；同時，EGF在美容方面的功效已被消費者廣泛認可，相關產(chǎn)品的市場需求日益增大。然而，天然提取高活性EGF售價近200萬美元/克，提取效率極低，無法大規(guī)模工業(yè)化制備，高質(zhì)量EGF原料的生產(chǎn)供應遠不能滿足市場需求。因此，開發(fā)一種高效的EGF生產(chǎn)工藝不僅具有巨大的經(jīng)濟價值，也為EGF進一步應用開發(fā)提供了最基本的保障。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株。pGEX-EGF/BL21STAR（DE3）工程菌由臨沂大學藥學院構建。

1.1.2 培養(yǎng)基。（1）LB液體培養(yǎng)基：1.0%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，1.0% NaCl，pH 7.0，121℃滅菌20 min ；（2）LB固體培養(yǎng)基：在LB液體培養(yǎng)基中補加1.0%瓊脂；（3）含氨芐青霉素的LB（LA）液體（或固體）培養(yǎng)基：待LB液體（或固體）培養(yǎng)基滅菌后降溫至50℃以下，加入氨芐青霉素（100 μg/mL）；（4）M9-YT-Glu發(fā)酵培養(yǎng)基：0.5%胰蛋白胨，0.3%酵母提取物，0.06%NaCl，0.5%KH2PO4，3%Na2HPO4·12H2O，1%葡萄糖，0.1%MgSO4，0.1%NH4Cl；（5）補料培養(yǎng)基：30%葡萄糖，5%胰蛋白胨，3%酵母提取物。

1.1.3 主要試劑。胰蛋白胨、酵母提取物購自英國Oxoid公司，中分子量蛋白質(zhì)Marker購自天根生化科技有限公司，IPTG購自索萊寶，無機鹽、葡萄糖等購自上海生工。

1.1.4 主要儀器設備。HSX-150恒溫恒濕箱，上海申賢恒溫設備廠； HNY恒溫培養(yǎng)振蕩器，天津市歐諾儀器儀表有限公司；ChampGel 5000數(shù)碼凝膠成像分析系統(tǒng)，北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司；TU-1810紫外可見分光光度儀，北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2 方法

1.2.1 菌密度測定。用紫外可見光光度法測定發(fā)酵液600nm波長時光吸收值[3]，以未接種培養(yǎng)基作參比。

1.2.2 目標蛋白表達水平的測定。采用還原SDS-PAGE電泳考馬斯亮蘭染色法[4]，電泳凝膠經(jīng)掃描后分析重組蛋白占菌體總蛋白的百分含量。

1.2.3 質(zhì)粒丟失率的檢測方法。將待測發(fā)酵液測OD600值，以無菌水稀釋，使培養(yǎng)液均達到OD600為0.2。然后取200μl涂LB平板，37℃培養(yǎng)48hr。從培養(yǎng)好的LB平板上挑一單菌落同時轉(zhuǎn)接到LB和LA平板上，37℃培養(yǎng)48hr。計算菌落數(shù)，LB平板上的菌落數(shù)為M，LA平板上的菌落數(shù)為N，則丟失率計算方法為（M-N）/M×100%。

1.2.4 工程菌的培養(yǎng)方法（30升發(fā)酵罐規(guī)格）。（1）種子菌的活化：取-80℃，12.5%甘油保存的生產(chǎn)種子庫菌種，劃線接種于含氨芐（100μg/ml）的LB斜面，37℃培養(yǎng)過夜，挑菌苔于含氨芐（100μg/ml）LB培養(yǎng)基中，37℃，200rpm振搖培養(yǎng)至OD600 為0.4-0.5時，作為活化種子4℃保存。（2）種子液培養(yǎng)：取活化種子，以1：100接種于400ml LB培養(yǎng)基中，30℃，150rpm，培養(yǎng)15hr，作為一級種子液。再以1：10接種于2L LB培養(yǎng)基的三角瓶中，37℃，250rpm，培養(yǎng)2hr，作為上罐種子液。（3）發(fā)酵工藝：發(fā)酵上罐培養(yǎng)基18L，培養(yǎng)基配方為 M9-YT-Glu。取種子液2000ml，加入發(fā)酵罐中，使終體積為20L。調(diào)整工藝參數(shù)：設定溫度37℃，轉(zhuǎn)速300rpm，pH用50%氨水自動調(diào)至7.0。當發(fā)酵至3-4hr，開始流加營養(yǎng)液。待菌體OD600達到8-12，溶氧值開始上升時，降溫至30℃，以不同IPTG終濃度（0.1M、0.2M、0.3M ）進行誘導，誘導時間2-6小時，每1小時取1次樣品。樣品離心、作SDS-PAGE電泳，觀察蛋白表達情況。

2 結果與分析

2.1 誘導溫度對蛋白表達的影響

溫度在發(fā)酵過程中的影響一方面表現(xiàn)在工程菌產(chǎn)物合成的數(shù)量，另一方面表現(xiàn)在工程菌自身數(shù)量的增長。大腸桿菌的最適生長溫度為37℃，是使比生長率達到最大值的溫度。將種子液以1：10接入發(fā)酵罐中，37℃培養(yǎng)至菌體OD600達到10-12，加入終濃度為0.2M IPTG誘導，同時控制溫度至25℃、30℃、37℃，誘導時間4hr，收集菌體進行SDS-PAGE分析。

M：marker；1：37℃表達菌體；2：37℃破菌溶解上清；3：30℃表達菌體；4：30℃破菌溶解上清；

5：25℃表達菌體；6：25℃破菌溶解上清

如圖1所示，三個溫度均可見明顯目標蛋白表達條帶，其中37℃和30℃對菌體數(shù)量增值及表達量明顯優(yōu)于25℃時表達量；37℃誘導表達后，破菌上清目標蛋白溶解度較低，提示溫度過高影響融合蛋白可溶性表達；30℃在不明顯降低目標蛋白表達量的同時，可溶性表達比例最高，綜上，選擇誘導溫度為30℃。

2.2 不同IPTG濃度對蛋白表達的影響

在發(fā)酵研究中，采用不同時間的多點抽樣，測定其菌體OD600值，逐點用計算機描繪出菌體生長曲線，當工程菌生長至對數(shù)中期（約4hr），降溫至30℃，用IPTG進行誘導，hEGF蛋白表達量可達30%左右。而IPTG作為一種不消耗的誘導物，僅需維持一定的濃度即可持續(xù)誘導。所以，本實驗篩選了終濃度分別為0.1M、0.2M和0.3M的IPTG進行誘導。

1.對照；2.0.1M IPTG；3.0.2M IPTG； 4.0.3M IPTG

實驗結果如圖2所示：除0.1M IPTG誘導目的蛋白表達量為20%外，其余兩種IPTG濃度誘導的目的蛋白表達量均為31%以上，無較大差別。三種不同IPTG濃度誘導獲得的目標蛋白破菌溶解性無較大差異。綜合考慮到成本和工藝的穩(wěn)定性，rEGF發(fā)酵IPTG終濃度選擇0.2M。

2.3 不同誘導時間對蛋白表達的影響

2.3.1 不同誘導時間質(zhì)粒丟失率測定 分別在誘導前和誘導后1hr、2hr、3hr、4hr、5hr、6hr取發(fā)酵液測定發(fā)酵液上清中乙酸的含量，并通過平板培養(yǎng)法計算不同誘導時間的質(zhì)粒的丟失率。結果如表1、圖3所示。

2.3.3 不同誘導時間蛋白表達量測定 分別取誘導前和誘導后1hr、2hr、3hr、4hr、5hr、6hr的發(fā)酵液樣品，進行SDS-PAGE電泳，灰度掃描，并分析誘導時間與蛋白表達量之間的關系。結果如圖4所示：①誘導時間為1hr時的目的蛋白表達量為12%；2hr為18%；3hr為25%；4hr為30%；5hr為28.5%；6hr為28.0%。即隨誘導時間延長，蛋白表達量呈先增加后降低的趨勢，且4hr以后蛋白表達量趨于基本穩(wěn)定。②誘導4hr后，質(zhì)粒丟失率為40%，5hr以后質(zhì)粒丟失顯著增加，達到68%，即4hr以后質(zhì)粒丟失率加快，穩(wěn)定性降低。

3 結論與討論

rEGF工程菌的發(fā)酵，選擇M9-YT-Glu鹽培養(yǎng)基作為生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)，維持溶氧不低于30%，當菌體密度OD600=10-12時，降低溫度為30℃并加入終濃度0.2M IPTG誘導，維持誘導時間4hr，最終菌體密度均可達到OD600值20以上，目的蛋白表達量占菌體蛋白總量的30%左右，為后續(xù)rEGF融合蛋白純化奠定了基礎。

參考文獻

Gregory，H.，Isolation and structure of urogastrone and its relationship to epidermal growth factor.Nature 1975，257 （5524），325-7.

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