王霞霞， 徐智明， 朱德建， 李 巖， 李 楊

(安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)院，安徽合肥 230031)

獸用抗生素、重金屬、農(nóng)藥污染是目前全球面臨的三大主要污染。而對(duì)于集約化動(dòng)物養(yǎng)殖來(lái)說(shuō)，動(dòng)物養(yǎng)殖廢棄物是獸用抗生素和重金屬殘留雙重污染的主要載體之一[1]。劉榮樂(lè)等調(diào)查指出，我國(guó)商品有機(jī)肥重金屬含量超標(biāo)現(xiàn)象嚴(yán)重，且與生產(chǎn)原料中的重金屬含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系[2]?？股貧埩糇粉欙@示，60%～90%的獸用抗生素隨動(dòng)物分泌、排泄排出體外，且殘留抗生素的代謝產(chǎn)物具有較高活性[3]。農(nóng)田施肥是動(dòng)物廢棄物處理的唯一途徑，因此也就成為抗生素和重金屬環(huán)境暴露的主要途徑，尤其對(duì)前者而言。大量的抗生素和重金屬殘留，污染環(huán)境，不僅影響農(nóng)作物的正常生長(zhǎng)，更重要的是會(huì)直接進(jìn)入食物鏈，對(duì)食品造成不可估量的安全隱患。因此，動(dòng)物廢棄物綠色回田須得解決抗生素和重金屬雙重污染的問(wèn)題。抗生素和重金屬殘留分別處理的時(shí)效性較差，不僅延長(zhǎng)了動(dòng)物廢棄物回田的周期，更加大了經(jīng)濟(jì)成本。

植物修復(fù)被認(rèn)為是重金屬污染防治最為環(huán)保的措施之一。植物修復(fù)指借助植物和植物生長(zhǎng)及與其共存的微生物作為媒介來(lái)凈化環(huán)境中的污染物，其本質(zhì)是依靠植物及其根際微生物菌群自然發(fā)生的進(jìn)程達(dá)到控制、隔離、去除或降解污染物的目的。繼重金屬污染處理之后，殘留抗生素的快速降解也受到多方面的重視，提出微生物降解、光降解、臭氧降解、化學(xué)降解和輻射降解等途徑。但抗生素的體外降解受環(huán)境影響較大。實(shí)驗(yàn)室模擬堆制腐熟8個(gè)月仍不能完全消除泰樂(lè)菌素A及其降解產(chǎn)物[4]。吳銀寶等研究推測(cè)，恩諾沙星在常溫避光下水解的半衰期甚至可超過(guò)1年[5]。Kim等多個(gè)研究者指出，堆肥過(guò)程中影響抗生素降解率的因素很多，其中包括抗生素種類、抗生素濃度、溫度、通氣量、堆肥底物和微生物等[6-7]。此外，以堆肥為主要措施的養(yǎng)殖廢棄物處理不僅要占用大量的空間場(chǎng)地，而且對(duì)周遭環(huán)境有較大影響，例如廢液外滲、不良?xì)馕兜膿]發(fā)可引起蚊蟲(chóng)滋生等后果，更重要的是堆肥處理忽略了動(dòng)物廢棄物重金屬污染的事實(shí)，且大部分抗生素因被設(shè)計(jì)成口服藥物而抗水解。因此以可富集重金屬物種的非農(nóng)業(yè)性種植為紐帶，將重金屬植物修復(fù)與動(dòng)物養(yǎng)殖廢棄物中抗生素殘留降解相聯(lián)系。植物在修復(fù)殘留重金屬的同時(shí)，其生長(zhǎng)環(huán)境為殘留抗生素的生物降解、光降解等途徑提供場(chǎng)所，最終達(dá)到減少甚至避免重金屬和抗生素殘留物直接進(jìn)入人類食物鏈的目的。

空心蓮子草(Alternantheraphiloxeroides)屬莧科(Amaranthaceae)蓮子草屬，別稱喜旱蓮子草、水花生等，原產(chǎn)于巴西?？招纳徸硬萆L(zhǎng)快，易繁殖，其根莖營(yíng)養(yǎng)繁殖能力非常旺盛；莖葉柔嫩多汁，蛋白含量高，可達(dá)20%以上[8]?？招纳徸硬?0世紀(jì)30年代作為牧草種質(zhì)資源引入我國(guó)，由于優(yōu)化的生長(zhǎng)環(huán)境以及沒(méi)有自然天敵制約等原因，在我國(guó)大部分地區(qū)，包括華東、華南、西南等約20個(gè)省(市、自治區(qū))內(nèi)迅速大面積生長(zhǎng)，甚至形成了單一優(yōu)勢(shì)群落[9-10]?？招纳徸硬?003年被列入國(guó)家環(huán)保總局公布的《中國(guó)第一批外來(lái)入侵生物名單》，可水陸兩生，抗逆能力強(qiáng)，甚至能適應(yīng)長(zhǎng)期富營(yíng)養(yǎng)化的水漬、泥沼、鹽分脅迫等惡性環(huán)境，且其對(duì)部分重金屬具有較強(qiáng)的富集作用[11]，已被列為優(yōu)質(zhì)的重金屬污染植物修復(fù)物種之一。

鑒于此，探析空心蓮子草對(duì)抗生素的耐受性對(duì)于解決動(dòng)物廢棄物重金屬、抗生素殘留的雙重污染尤為重要。目前關(guān)于空心蓮子草對(duì)重金屬富集的研究較多，但關(guān)于其對(duì)抗生素脅迫耐受性的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本試驗(yàn)展開(kāi)空心蓮子草營(yíng)養(yǎng)繁殖根系發(fā)育對(duì)5種抗生素耐受性的研究，探析空心蓮子草修復(fù)環(huán)境中殘留抗生素的可能性，以期為畜禽養(yǎng)殖糞污綠色回田尋求經(jīng)濟(jì)、易操作的途徑提供科學(xué)依據(jù)和理論支持。

1 材料與方法

供試抗生素為磺胺二甲嘧啶、恩諾沙星、青霉素、鏈霉素和四環(huán)素，均為分析純。

抗生素濃度處理梯度為200.0、100.0、50.0、25.0、12.5、0 mg/L，其中0 mg/L為對(duì)照。處理液分裝于250 mL的錐形瓶，100 mL/瓶。

1.1 供試材料培養(yǎng)與處理

選取供試空心蓮子草健壯、無(wú)病蟲(chóng)葉、無(wú)根須的當(dāng)年生莖，選取自頂生葉數(shù)6個(gè)節(jié)的莖，去除頂部2個(gè)幼嫩莖節(jié)后，其下4個(gè)莖節(jié)作為1個(gè)獨(dú)立供試材料。莖基部留1～2 cm插入處理液中，保證基部莖節(jié)的2張葉沒(méi)入處理液，其余3個(gè)莖節(jié)暴露于空氣中。每處理4株/瓶，重復(fù)3次。

1.2 測(cè)定指標(biāo)和方法

以新生根萌出長(zhǎng)度達(dá)2 mm作為有效根系的標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計(jì)根系萌發(fā)初始時(shí)間、根條數(shù)和根長(zhǎng)度。自處理開(kāi)始12 h后，每3 h統(tǒng)計(jì)1次莖萌發(fā)新根情況，于處理后66 h統(tǒng)計(jì)該莖節(jié)的新生根條數(shù)和根長(zhǎng)度，每處理隨機(jī)測(cè)5株。

按照公式IR=T/C-100計(jì)算根系發(fā)生和根系伸長(zhǎng)的抑制率，其中T為處理值，C為對(duì)照值。當(dāng)IR>0時(shí)，表現(xiàn)為促進(jìn)效應(yīng)；當(dāng)IR<0時(shí)，表現(xiàn)為抑制效應(yīng)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2007和SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析和多重比較分析抗生素種類和濃度對(duì)空心蓮子草營(yíng)養(yǎng)繁殖的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 5種抗生素對(duì)空心蓮子草根系萌發(fā)初始時(shí)間的影響

快速形成有效新根是營(yíng)養(yǎng)繁殖完成的標(biāo)志性指標(biāo)。根系萌發(fā)初始時(shí)間指自處理開(kāi)始到根系萌發(fā)的時(shí)間，萌發(fā)初始時(shí)間長(zhǎng)短可指示植株?duì)I養(yǎng)繁殖的難易程度。由表1可知，濃度處理對(duì)于空心蓮子草營(yíng)養(yǎng)繁殖根系的發(fā)生具有延緩作用，且多與對(duì)照差異顯著。整體上隨著抗生素濃度的增大，根系萌發(fā)經(jīng)歷的時(shí)間延長(zhǎng)，甚至造成根系萌發(fā)停止。雖然高濃度(200.0 mg/L)青霉素處理的根系發(fā)生較低濃度處理略快，但差異不顯著，且與對(duì)照相比仍表現(xiàn)為萌發(fā)延緩。鏈霉素和恩諾沙星對(duì)空心蓮子草營(yíng)養(yǎng)繁殖根系發(fā)生的抑制作用較強(qiáng)，四環(huán)素、磺胺二甲嘧啶和青霉素的延緩作用較弱。由此可見(jiàn)，抗生素處理對(duì)空心蓮子草營(yíng)養(yǎng)繁殖的根系萌發(fā)具有一定程度的抑制作用，且其抑制強(qiáng)度因抗生素類型和濃度的不同而不同。

表1 5種抗生素對(duì)空心蓮子草根系萌發(fā)初始時(shí)間的影響Table1 Effect of 5 kinds of antibiotics on the initial root germination time of A. philoxeroides

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫(xiě)字母表示在0.05水平上差異顯著?！啊北硎緹o(wú)根系萌發(fā)。

2.2 5種抗生素對(duì)空心蓮子草根系數(shù)量的影響

由圖1、圖2可知，隨藥劑濃度的增大，空心蓮子草新生根數(shù)量減少，抑制效應(yīng)增強(qiáng)。其中磺胺二甲嘧啶和青霉素對(duì)根系發(fā)生能力的抑制作用較四環(huán)素、鏈霉素、恩諾沙星弱。200.0 mg/L磺胺二甲嘧啶、青霉素處理根條數(shù)分別是14.4、14.7條，可達(dá)對(duì)照的60%以上。而四環(huán)素、鏈霉素、恩諾沙星等3種抗生素在處理濃度為25.0 mg/L時(shí)，根條數(shù)分別為5.0、7.0、8.4條，僅及對(duì)照的21.1%、29.6%、31.2%；當(dāng)濃度增至50.0 mg/L時(shí)，甚至沒(méi)有有效根系。說(shuō)明抗生素類型對(duì)空心蓮子草營(yíng)養(yǎng)繁殖的根系形成具有一定的差異性作用。

2.3 5種抗生素對(duì)空心蓮子草根系長(zhǎng)度的影響

根系伸長(zhǎng)是擴(kuò)大根系表面積，增強(qiáng)根系吸附功能的基礎(chǔ)。由圖3、圖4可知，除青霉素外，其他4種抗生素對(duì)空心蓮子草根系的伸長(zhǎng)有較強(qiáng)的抑制作用，隨處理濃度的增加，抑制效應(yīng)整體增強(qiáng)，且不同藥劑的抑制強(qiáng)度不同。其中四環(huán)素、鏈霉素、恩諾沙星等3種抗生素對(duì)根系生長(zhǎng)表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用，磺胺二甲嘧啶次之。25.0 mg/L四環(huán)素、鏈霉素、恩諾沙星、磺胺二甲嘧啶處理根長(zhǎng)分別僅及對(duì)照的19.5%、16.8%、52.6%、69.7%；當(dāng)濃度增至50.0 mg/L時(shí)，前3者處理的空心蓮子草根系生長(zhǎng)十分緩慢，幾乎停止生長(zhǎng)，而磺胺二甲嘧啶高濃度(200.0 mg/L)處理根長(zhǎng)仍可達(dá)對(duì)照的49.3%，甚至略長(zhǎng)于青霉素處理。青霉素處理表現(xiàn)為中低濃度促進(jìn)根系伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，高濃度抑制根系生長(zhǎng)。50.0 mg/L 青霉素處理空心蓮子草根系長(zhǎng)度是對(duì)照的131.3%，而高濃度(200.0 mg/L)處理空心蓮子草根長(zhǎng)僅為對(duì)照的40.6%。由此可見(jiàn)，四環(huán)素、鏈霉素、恩諾沙星等3種抗生素對(duì)空心蓮子草根系生長(zhǎng)有較強(qiáng)的抑制作用，其次是磺胺二甲嘧啶；而空心蓮子草根系伸長(zhǎng)生長(zhǎng)對(duì)青霉素耐受性較強(qiáng)，中濃度(50.0 mg/L)青霉素處理對(duì)根系生長(zhǎng)仍表現(xiàn)為促進(jìn)作用。

3 討論

為防治疾病，各類抗生素在現(xiàn)代養(yǎng)殖業(yè)中大量使用，因此造成養(yǎng)殖廢棄物抗生素污染日益加劇。有研究指出，畜禽糞便中抗生素暴露程度也比較嚴(yán)重，如四環(huán)素類的暴露濃度為0.4～183.5 mg/kg，磺胺類的暴露濃度為0.1～46.7 mg/kg[12]。大量的抗生素殘留進(jìn)入農(nóng)業(yè)環(huán)境，勢(shì)必引起農(nóng)業(yè)環(huán)境的二次污染，嚴(yán)重威脅食品的安全性。目前，植物修復(fù)是環(huán)境污染治理最經(jīng)濟(jì)、最溫和且收益最佳的途徑。

空心蓮子草生長(zhǎng)快，易繁殖，已有研究表明其對(duì)大部分重金屬有良好的富積作用[13]。本試驗(yàn)進(jìn)一步通過(guò)水培的方式展開(kāi)了空心蓮子草對(duì)獸用抗生素脅迫環(huán)境耐受性的研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，供試的5種抗生素的不同濃度對(duì)空心蓮子草營(yíng)養(yǎng)繁殖根系萌發(fā)進(jìn)程、萌發(fā)質(zhì)量具有不同程度的抑制作用。這與Pan等的研究結(jié)果類似，磺胺二甲嘧啶和四環(huán)素等多種獸藥對(duì)黃瓜、萵苣和番茄等種子萌發(fā)和根系伸長(zhǎng)具有顯著的抑制效應(yīng)[13]。肖明月等報(bào)道，10 mg/L磺胺二甲嘧啶即可顯著抑制小白菜種子的發(fā)芽率，且抗生素暴露濃度與小白菜根、芽伸長(zhǎng)抑制率之間具有良好的劑量效應(yīng)[14]。研究發(fā)現(xiàn)，抗生素對(duì)植物根系的影響大于地上部分，可能是由于根部是植株與土壤接觸的部分，植物的主動(dòng)吸收和表面吸附作用導(dǎo)致根部的抗生素累積量遠(yuǎn)高于其他部分，從而對(duì)根的影響明顯高于莖葉部分[15-16]。因此，根系發(fā)育好壞是植物對(duì)抗生素耐受性強(qiáng)弱的的最佳指標(biāo)之一。

在本試驗(yàn)中，25.0、50.0 mg/L青霉素處理對(duì)根系萌發(fā)進(jìn)程具有抑制效應(yīng)，但對(duì)根系伸長(zhǎng)生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用。這與水芹的水培試驗(yàn)結(jié)果[15]有相似之處。鮑陳燕等指出，當(dāng)抗生素濃度較低(小于0.1 mg/L)時(shí)，抗生素對(duì)水芹根系的生長(zhǎng)和根系活力有較為明顯的促進(jìn)作用；當(dāng)濃度高于 0.1 mg/L 時(shí)，隨濃度的增大，根系生長(zhǎng)量和活力顯著降低[15]。本試驗(yàn)通過(guò)用濃度高于1 mg/L的抗生素處理空心蓮子草發(fā)現(xiàn)，供試抗生素處理對(duì)植株根系發(fā)育具有不同程度的抑制作用，但其強(qiáng)度具有藥劑類型和濃度上的差異。

抗生素對(duì)植株生長(zhǎng)發(fā)育有較大的負(fù)面效應(yīng)。金彩霞等對(duì)作物根尖細(xì)胞的觀察發(fā)現(xiàn)，抗生素對(duì)植物細(xì)胞具有毒性，能夠誘發(fā)微核效應(yīng)[17]。安婧等指出，短期低濃度抗生素可誘導(dǎo)小麥中可溶性蛋白質(zhì)的合成[18]。而劉琳等進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，抗生素介入植株生長(zhǎng)體系會(huì)使得其可溶性蛋白質(zhì)、非可溶性蛋白質(zhì)含量受到不同程度的影響，其中非可溶性蛋白質(zhì)含量在不同濃度抗生素介入時(shí)，表現(xiàn)出明顯的毒性抑制效應(yīng)，且隨著脅迫濃度的增加，抑制效應(yīng)增強(qiáng)；可溶性蛋白質(zhì)含量在低濃度抗生素刺激下表現(xiàn)為激活效應(yīng)，而在高濃度下表現(xiàn)為毒性抑制效應(yīng)[19]。肖明月等報(bào)道，抗生素的存在可顯著抑制植株葉綠素、可溶性蛋白質(zhì)含量的增加，且可破壞植物抗氧化酶系統(tǒng)的平衡[14，18-20]。Farkas等通過(guò)分析植物對(duì)抗生素耐受性的差異與過(guò)氧化物酶表達(dá)的關(guān)聯(lián)度，推測(cè)氧化脅迫很可能是抗生素的植物毒性機(jī)制之一，但是這方面還缺少直接的證據(jù)[21]。因此，關(guān)于抗生素影響空心蓮子草營(yíng)養(yǎng)繁殖根系發(fā)育的生理機(jī)制還須進(jìn)一步試驗(yàn)分析。

4 結(jié)論

獸用抗生素對(duì)空心蓮子草根系發(fā)育具有抑制作用，抑制效應(yīng)整體隨濃度的增大而增強(qiáng)。

空心蓮子草對(duì)抗生素的耐受性具有種類差異，對(duì)磺胺二嘧啶和青霉素脅迫具有較強(qiáng)的適應(yīng)能力，對(duì)恩諾沙星、鏈霉素和四環(huán)素比較敏感。

空心蓮子草在濃度低于25 mg/L的抗生素脅迫下能完成營(yíng)養(yǎng)繁殖，說(shuō)明空心蓮子草對(duì)供試抗生素脅迫環(huán)境具有較強(qiáng)的適應(yīng)能力，可以作為植物修復(fù)動(dòng)物廢棄物抗生素污染的備選物種。

參考文獻(xiàn)：

[1]湯貝貝，張振華，盧 信，等. 養(yǎng)殖廢水中抗生素的植物修復(fù)研究進(jìn)展[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2017，33(1)：224-232.

[2]劉榮樂(lè)，李書(shū)田，王秀斌，等. 我國(guó)商品有機(jī)肥料和有機(jī)廢棄物中重金屬的含量狀況與分析[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2005，24(2)：392-397.

[3]Aust M O，Godlinski F，Travis G R，et al. Distribution of sulfamethazine，chlortetracycline and tylosin in manure and soil of Canadian feedlots after subtherapeutic use in cattle[J]. Environmental Pollution，2008，156(3)：1243-1251.

[4]Kolz A C，Moorman T B，Ong S K，et al. Degradation and metabolite production of tylosin in anaerobic and aerobic swine-manure lagoons[J]. Water Environment Research，2005，77(1)：49-56.

[5]吳銀寶，廖新俤，汪植三，等. 獸藥恩諾沙星(enrofloxacin)的水解特性[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2006，17(6)：1086-1090.

[6]Kim K R，Owens G，Ok Y S，et al. Decline in extractable antibiotics in manure - based composts during composting [J]. Waste Management，2012，32(1)：110-116.

[7]劉元望，李兆君，馮 瑤，等. 微生物降解抗生素的研究進(jìn)展[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2016，35(2)：212-224.

[8]田 兵，冉雪琴，薛 紅，等. 貴州42種野生牧草營(yíng)養(yǎng)價(jià)值灰色關(guān)聯(lián)度分析[J]. 草業(yè)學(xué)報(bào)，2014，23(1)：92-103.

[9]張格成，李繼祥，陳秀華. 空心蓮子草主要生物學(xué)特性研究[J]. 雜草科學(xué)，1993(2)：10-12.

[10]曹坳程，郭美霞，張向才，等. 我國(guó)主要的外來(lái)惡性雜草及防治技術(shù)[J]. 中國(guó)植保導(dǎo)刊，2004，24(3)：4-7.

[11]宋志忠，王 莉，金 曼，等. 重金屬脅迫條件下空心蓮子草的生長(zhǎng)和營(yíng)養(yǎng)特征分析(英文)[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2011，30(5)：614-619.

[12]郭欣妍，王 娜，許 靜，等. 獸藥抗生素的環(huán)境暴露水平及其環(huán)境歸趨研究進(jìn)展[J]. 環(huán)境科學(xué)與技術(shù)，2014，37(9)：76-86.

[13]Pan M，Chu L M. Phytotoxicity of veterinary antibiotics to seed germination and root elongation of crops[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety，2016，126：228-237.

[14]肖明月，安 婧，紀(jì)占華，等. 六種常見(jiàn)抗生素對(duì)小白菜種子萌發(fā)及生理特性的影響[J]. 生態(tài)學(xué)雜志，2014，33(10)：2775-2781.

[15]鮑陳燕，顧國(guó)平，章明奎. 獸用抗生素脅迫對(duì)水芹生長(zhǎng)及其抗生素積累的影響[J]. 土壤通報(bào)，2016，47(1)：164-172.

[16]王 磊，王金花，王 軍，等. 四種抗生素對(duì)小麥玉米高粱三種作物種子芽與根伸長(zhǎng)的影響[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2017，36(2)：216-222.

[17]金彩霞，毛 蕾，司曉薇. 3種磺胺類獸藥單一及復(fù)合污染對(duì)不同作物根尖細(xì)胞的微核效應(yīng)研究[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2015，34(4)：666-671.

[18]安 婧，周啟星，劉維濤. 土霉素對(duì)小麥種子發(fā)芽與幼苗生長(zhǎng)發(fā)育的生態(tài)毒性[J]. 環(huán)境科學(xué)，2009，30(10)：3022-3027.

[19]劉 琳，向 衡，劉玉洪，等. 人工濕地中土霉素脅迫對(duì)雜交狼尾草及土壤特征的影響[J]. 環(huán)境工程，2014，32(5)：20-24.

[20]李亞寧，陳 春，李國(guó)東，等. 磺胺甲惡唑?qū)π←溔~片蛋白和葉綠素含量及SOD酶活性的影響[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào)，2013，8(4)：543-548.

[21]Farkas M H，Berry J O，Aga D S. Chlortetracycline detoxification in maize via induction of glutathione S-transferases after antibiotic exposure[J]. Environmental Science and Technology，2007，41(4)：1450-1456.