吳婷 朱洪建

【摘 要】文章利用免疫膠體金的生物化學(xué)特性，吸附反應(yīng)體系中的DNA，通過離心將其分離，并經(jīng)過洗滌再離心，沉淀可直接用于PCR反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：5μL和10μL免疫膠體金在室溫下振蕩孵育15 min對(duì)接觸性DNA有足夠的吸附能力。

【關(guān)鍵詞】抗-DNA多克隆抗體;膠體金;接觸性DNA

【中圖分類號(hào)】D919.2 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1674-0688（2018）12-0041-02

當(dāng)前公安實(shí)戰(zhàn)中，現(xiàn)勘人員提取到的接觸類檢材越來越多，而接觸類檢材樣本中DNA含量很少，甚至存在大量PCR抑制劑，使得這類檢材檢出成功率很低。因此，我們需要探索一種能有效提高接觸類檢材檢測(cè)成功率與準(zhǔn)確性的方法。

膠體金是氯金酸（chLoroaurie acid，）在還原劑如抗壞血酸、白磷、鞣酸和枸櫞酸鈉等作用下，由于靜電作用而成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，聚合成帶負(fù)電的疏水膠溶液。金顆粒為核，表面吸附和雙層離子，能與蛋白質(zhì)分子以及其他非共價(jià)生物大分子如酶、抗生素、多肽、激素、毒素等正電荷基團(tuán)形成靜電結(jié)合，且不影響其生物特性[1]。膠體金具有膠體的多種特性，特別是對(duì)電解質(zhì)的敏感性，膠體金標(biāo)記技術(shù)實(shí)質(zhì)上就是蛋白質(zhì)分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程，吸附機(jī)理是利用膠體金顆粒表面帶負(fù)電荷，與蛋白質(zhì)的正電荷基團(tuán)因靜電吸附而形成牢固結(jié)合[2]。在膠體金的制備過程中，所使用的玻璃容器需要絕對(duì)清潔，否則污染物會(huì)干擾膠體金的生成，產(chǎn)生凝集顆粒，還原劑的用量和強(qiáng)弱可以決定膠體金的大小，一般為5～150 nm，還原劑量越大，所制備的膠體金顆粒越小[3]。

本研究選用的是將抗-DNA多克隆抗體標(biāo)記到直徑為35 nm的膠體金顆粒上，制備而成免疫膠體金（immune coLLoidaL-goLd）。利用免疫膠體金的生物化學(xué)特性，吸附反應(yīng)體系中的DNA，通過離心將其分離，并經(jīng)過洗滌再離心，沉淀可直接用于PCR反應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 試劑及其來源

10 ng/uL DNA標(biāo)準(zhǔn)品：本實(shí)驗(yàn)室?？?DNA多克隆抗體免疫膠體金凍干粉劑：北京博奧森生物技術(shù)有限公司。滅菌純水：屈臣氏。PCR反應(yīng)試劑：PowerPLex21試劑盒，Promega公司。電泳試劑：Hi-DiTM甲酰胺（AB公司）;PPLex21 ALLeLic Ladder（Promega公司）;CC5 ILS500（Promega公司）。

1.2 主要儀器

恒溫混勻儀Thermomixer comfort：德國(guó)Eppendorf。5424小型臺(tái)式離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司。3130xL型遺傳分析儀：美國(guó)AB公司。9700型PCR擴(kuò)增儀：美國(guó)AB公司。

1.3 針對(duì)接觸性DNA孵育條件的建立

（1）抗-DNA多克隆抗體免疫膠體金溶液的配置：取免疫膠體金凍干粉劑，加滅菌純水溶解，配置成濃度為0.4 mg/mL的免疫膠體金溶液備用。

（2）模擬接觸性DNA溶液的制備：提取DNA的標(biāo)準(zhǔn)品2 800 M（10 ng/μL）加入滅菌純水制成終濃度為0.025 ng/μL DNA溶液備用。

（3）分組：將濃度為0.025 ng/μL DNA溶液按DNA的量分為A、B 2組，每組11個(gè)樣本，進(jìn)行3組平行試驗(yàn)，記錄并編號(hào)。1號(hào)：取濃度0.025 ng/μL DNA溶液10μL，DNA的量為0.25 ng;2號(hào)：取濃度0.025 ng/μL DNA溶液20μL，DNA的量為0.5 ng;3號(hào)：取濃度0.025 ng/μL DNA溶液40μL，DNA的量為1.0 ng;4號(hào)：取濃度0.025 ng/μL DNA溶液60μL，DNA的量為1.5 ng;5號(hào)：取濃度0.025ng/μL DNA溶液80μL，DNA的量為2.0 ng;6號(hào)：取濃度0.025ng/μL DNA溶液100μL，DNA的量為2.5 ng;7號(hào)：取濃度0.025 ng/μL DNA溶液120μL，DNA的量為3.0 ng;8號(hào)：取濃度0.025 ng/μL DNA溶液140μL，DNA的量為3.5 ng;9號(hào)：取濃度0.025 ng/μL DNA溶液160μL，DNA的量為4.0 ng;10號(hào)：取濃度0.025 ng/μL DNA溶液180μL，DNA的量為4.5 ng;11號(hào)：取濃度0.025 ng/μL DNA溶液200μL，DNA的量為5.0 ng;

（4）分別往A組的各個(gè)樣本里加入免疫膠體金5μL，分別往B組的各個(gè)樣本里加入免疫膠體金10μL，振蕩孵育15 min，13 000 r離心10min使免疫膠體金顆粒沉淀，吸取各樣本離心后上清液，轉(zhuǎn)移至另一0.5 mL管備檢，留沉淀并取2.5μL沉淀，直接用于PCR反應(yīng)。剩余沉淀存放于4 ℃冰箱用于復(fù)檢。這樣分組實(shí)驗(yàn)，保證了每種濃度留沉淀的樣本在同一種實(shí)驗(yàn)方法下至少可以被獨(dú)立驗(yàn)證6次，每種留上清液的樣本在同一種實(shí)驗(yàn)方法下可以被獨(dú)立驗(yàn)證3次，便于后續(xù)檢測(cè)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)與分析。

（5）PCR擴(kuò)增及擴(kuò)增產(chǎn)物檢驗(yàn)：使用GeneAmp PCR System 9700型擴(kuò)增儀（AB公司）和PowerPLex21試劑盒（Promega公司），PCR反應(yīng)液（4×模板）;引物混合物（2×Primer，2×Mix）;去離子水（2×water）。進(jìn)行30次循環(huán)。擴(kuò)增程序?yàn)椋?6 ℃，1min，循環(huán)0次;94 ℃，10 s，59 ℃，1 min，72 ℃，30 s，30次循環(huán);60 ℃，10 min，4 ℃，forever。其余操作過程按照試劑和儀器說明書進(jìn)行。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物2μL加入8μL甲酰胺和2μL ILS500（Promega公司）經(jīng)熱變性后，使用3130XL Genetic AnaLyzer（ABI公司）進(jìn)行毛細(xì)管電泳，用Genemapper軟件進(jìn)行分析，得出等位基因分型。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

（1）分別加入5μL膠體金，孵育15 min后離心，沉淀及上清液檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1（“+”代表檢出，“-”代表未檢出）。

（2）分別加入10μL膠體金，孵育15 min后離心，沉淀及上清液檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2（“+”代表檢出，“-”代表未檢出）。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：200μL體系加入5μL免疫膠體金室溫下振蕩孵育15 min對(duì)接觸性DNA有足夠的吸附能力，可獲得相對(duì)較好的PCR擴(kuò)增結(jié)果，本研究建立了應(yīng)用免疫膠體金技術(shù)提取接觸性DNA的孵育條件，為后續(xù)運(yùn)用抗-DNA多克隆抗體免疫膠體金，與DNA特異性結(jié)合，用于不同類接觸性檢材DNA提取的研究奠定了基礎(chǔ)。

參 考 文 獻(xiàn)

[1]康熙雄.免疫膠體金技術(shù)臨床應(yīng)用[M].北京：軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社，2010.

[2]許欣，王鋒，等.免疫膠體金技術(shù)及其在臨床診斷上的研究進(jìn)展[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2009，21（6）.

[3]朱文釧，孔繁德，林祥梅，等.免疫膠體金技術(shù)的應(yīng)用及展望[J].生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2010（4）.