張志平，李元清，劉建國(guó)，宋麗麗

（1.鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院煙草行業(yè)煙草工業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州 450001；2.浙江中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，浙江杭州 310024）

0 引言

煙梗是煙葉的重要組成部分，經(jīng)過(guò)梗葉分離后可制得占煙葉質(zhì)量25%～30%的煙梗，我國(guó)每年可生產(chǎn)約70×104t煙梗[1]。目前，煙梗主要被用于制造在卷煙中添加的煙用梗絲和再造煙葉[2]，但由于煙梗自身的特點(diǎn)，在卷煙中使用率并不高，仍有1/3被廢棄[3]。煙梗與煙葉中的化學(xué)成分基本相同，但含量差異顯著[4]，其中煙堿是煙梗中含有的一種生物堿，為二元弱堿，多與檸檬酸或蘋(píng)果酸形成化合物存在于煙草和煙梗中[5]。煙堿在醫(yī)藥[6-8]、農(nóng)業(yè)[7-9]、化工、煙草工業(yè)等領(lǐng)域有較大的應(yīng)用價(jià)值，目前市場(chǎng)中的煙堿產(chǎn)品主要有純度為40%的硫酸煙堿和95%以上的純煙堿[10]。國(guó)內(nèi)外對(duì)煙堿的提取工藝與應(yīng)用有較多研究，大部分報(bào)道均是采用煙葉作為提取原料[11-12]，而有關(guān)煙梗中煙堿的提取工藝鮮有報(bào)道。

目前，從煙草中提取煙堿的方法有離子交換法、水蒸氣蒸餾法、萃取法等[13]。為了優(yōu)化煙梗中煙堿的提取工藝，以煙堿提取量為考查指標(biāo)，以水為提取溶劑，通過(guò)水浴時(shí)間、水浴溫度、溶劑pH值、提取次數(shù)、料液比等單因素試驗(yàn)，進(jìn)一步采用PB試驗(yàn)對(duì)試驗(yàn)因素進(jìn)行篩選，在最陡爬坡試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，完成中心組合試驗(yàn)（CCD），確定水提取煙梗中煙堿的最佳提取工藝，為煙梗中煙堿的提取提供工藝參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

煙梗，來(lái)自福建地區(qū)，為2016年長(zhǎng)梗；煙堿標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma公司，純度＞99%）；NaOH（AR）、甲醇（SR）、超純水、磷酸氫二鈉（AR）、磷酸（AR）等。

BS201S型分析天平、BCD-275MBC型冰箱、ST-07B型粉碎機(jī)、離心機(jī)、鼓風(fēng)干燥機(jī)、PHS-3C型pH計(jì)、Agilent7820A型高效液相色譜儀、DZKW-4型電熱恒溫水浴鍋等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 原料的預(yù)處理

將煙梗去除雜質(zhì)，放入干燥箱中于105℃條件下干燥至恒質(zhì)量。

1.2.2 煙堿的提取

準(zhǔn)確稱(chēng)取干燥至恒質(zhì)量的煙梗5 g于250 mL的三角瓶中，加入提取溶劑水，在一定條件下進(jìn)行水浴提取，然后常規(guī)濾紙過(guò)濾、定容，取2 mL濾液，以轉(zhuǎn)速12 000 r/min離心10 min，取上清液1 mL經(jīng)0.45 μm水系濾膜過(guò)濾，然后進(jìn)行高效液相色譜測(cè)定。

1.2.3 煙堿的測(cè)定

（1） 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制。以煙堿標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照，采用高效液相色譜法測(cè)定煙堿，色譜條件為色譜柱：Symmetry C18（250.0 mm×4.6 mm，5.0 μm)；流動(dòng)相為V1（甲醇）：V2（0.02 mol/L磷酸氫二鈉緩沖溶液pH值6.0） =70∶30；檢測(cè)波長(zhǎng)259 nm；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；柱溫30℃。煙堿質(zhì)量濃度X與色譜峰面積Y建立回歸方程為：Y=13 162X（R2=0.999 6）。

（2）樣品中煙堿提取量的測(cè)定。取1.2.2中過(guò)水系濾膜后的濾液進(jìn)行液相色譜測(cè)定，記錄峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)求出濾液中煙堿的質(zhì)量濃度C，進(jìn)而求出煙堿的提取量。煙堿的提取量按公式（1）計(jì)算。

式中：C——提取液中煙堿的質(zhì)量濃度，mg/mL；

V——提取液的體積，mL；

m——樣品的質(zhì)量，g。

1.2.4 煙堿提取條件的初步確定

采用單因素試驗(yàn)研究溶劑pH值、水浴溫度、水浴時(shí)間、料液比對(duì)煙堿提取量的影響。按照1.2.2中的提取步驟，分別進(jìn)行試驗(yàn)測(cè)定。

1.2.5 響應(yīng)面優(yōu)化煙梗中煙堿的提取條件

（1） 全因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)（DOE）[14]。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行全因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)溶劑pH值、水浴溫度、水浴時(shí)間、料液比4個(gè)因素，以煙堿提取量為響應(yīng)值進(jìn)行二水平的試驗(yàn)，篩選對(duì)提取率有顯著影響的因素。

全因子試驗(yàn)的因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 全因子試驗(yàn)的因素與水平設(shè)計(jì)

（2）最陡爬坡試驗(yàn)[15]。根據(jù)全因子試驗(yàn)的結(jié)果，選擇顯著因素，根據(jù)方程的回歸系數(shù)的符號(hào)和大小，設(shè)計(jì)關(guān)于顯著因素的最陡爬坡方向與步長(zhǎng)，有效逼近最大理想?yún)^(qū)域。

（3） 中心組合設(shè)計(jì)[16]。以全因子試驗(yàn)確定的顯著因素，結(jié)合最陡爬坡確定的最佳試驗(yàn)組合，以該組合為中心點(diǎn)進(jìn)行響應(yīng)面分析。

中心組合設(shè)計(jì)的因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

表2 中心組合設(shè)計(jì)的因素與水平設(shè)計(jì)

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 溶劑pH值對(duì)煙堿提取量的影響

單因素試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。

煙堿的提取量在酸性和堿性條件下均具有較高的提取量，在酸性條件下，煙堿以煙堿鹽的形式存在，酸性越強(qiáng)，溶解在水中的煙堿鹽越多，在堿性條件下，煙堿鹽可解離為游離煙堿，增大溶液的堿性，有利于煙堿鹽解離成游離煙堿[4]。由圖1（a） 可知，在堿性條件下，隨著溶劑pH值的增大而提高，當(dāng)溶劑pH值超過(guò)11后，煙堿的提取量趨于平衡。最佳溶劑pH值為11時(shí)煙堿的最大提取量為4.012 mg/g。

2.1.2 水浴溫度對(duì)煙堿提取量的影響

由圖1（b）可知，煙堿提取量隨著水浴溫度的升高而提高，當(dāng)水浴溫度超過(guò)50℃后煙堿的提取量反而下降，因?yàn)闇囟瘸^(guò)一定值后，煙堿和水溶液的互溶效果降低，導(dǎo)致提取量的下降，因此最佳水浴溫度為50℃時(shí)煙堿的最大提取量為4.101 mg/g。

2.1.3 水浴時(shí)間對(duì)煙堿提取量的影響

由圖1（c） 可知，煙堿的提取量隨水浴時(shí)間的增加而提高，在1 h后煙堿的提取量趨于平衡，根據(jù)固液傳質(zhì)理論，在提取初期，也就是在0～1 h擴(kuò)散作用居主導(dǎo)地位，固液傳質(zhì)中存在濃度平衡，在1 h之后，煙堿的提取量趨于平衡，因此，最佳水浴時(shí)間為1 h時(shí)煙堿的最大提取量為4.101 mg/g。時(shí)間（C）、料液比4個(gè)因素對(duì)煙堿提取量的影響，以煙堿提取量為響應(yīng)值。

圖1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

全因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 全因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

根據(jù)表3中的結(jié)果進(jìn)行回歸模型方差分析，得到的回歸方程為Y=3.816 8-0.056 7A+0.200 6B+0.167 1C+0.144 1D，其中，p<0.001，R2=0.916 4，因此該模型擬合效果較好。

全因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)的主效應(yīng)分析見(jiàn)表4。

表4 全因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)的主效應(yīng)分析

2.1.4 料液比對(duì)煙堿提取量的影響

由圖1（d）可知，料液比對(duì)煙堿提取量有較大的影響，隨著料液比的增加，煙堿提取量也逐漸增大。推測(cè)原因：隨著料液比加大，料液之間的濃度差也逐漸加大，導(dǎo)致煙堿向溶劑中轉(zhuǎn)移。料液比超過(guò)1∶25后，煙堿提取量趨于平緩，考慮節(jié)約溶劑的因素，選擇最佳料液比為1∶25，煙堿提取量為4.348 mg/g。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化煙梗中煙堿的提取工藝

2.2.1 全因子試驗(yàn)（DOE） 設(shè)計(jì)結(jié)果

依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行全因子試驗(yàn)（DOE）設(shè)計(jì)，考查溶劑pH值（A）、水浴溫度（B）、水浴

由表4可以得到，對(duì)煙堿提取量影響顯著的因素分析為水浴溫度、水浴時(shí)間和料液比。

2.2.2 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)2.2.1得到的回歸方程和表3的分析結(jié)果設(shè)計(jì)最陡爬坡的方向和步長(zhǎng)，水浴溫度、水浴時(shí)間、料液比對(duì)煙堿提取量的影響顯著，而且三者的系數(shù)均為正，說(shuō)明增加三者的水平可以增加煙堿的提取量，以單因素試驗(yàn)的中心點(diǎn)為出發(fā)點(diǎn)，設(shè)計(jì)最陡爬坡試驗(yàn)。

煙堿提取的最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表5。

2.2.3 中心旋轉(zhuǎn)組合（CCD）試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

以最陡爬坡試驗(yàn)的最優(yōu)值所對(duì)應(yīng)的組合為中心點(diǎn)，進(jìn)行中心旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)，共20個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)。

中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)（CCD）結(jié)果見(jiàn)表6。

利用Minitab對(duì)表中數(shù)據(jù)做回歸分析和擬合優(yōu)化，得到響應(yīng)面回歸模型為：

表5 煙堿提取的最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表6 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)（CCD）結(jié)果

式中：Y——煙堿提取量。

中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)（CCD）方差分析見(jiàn)表7。

由表7可知，模型的F值為8.77，p<0.001，模型極顯著，失擬項(xiàng)p值為0.252，失擬項(xiàng)不顯著，其R2為0.887 6，響應(yīng)值的變化有88.76%來(lái)源于所選因素，表明方程擬合度較好，因此模型具有實(shí)際應(yīng)用意義。

從表7中可以看出，B，C，D，B2，D2對(duì)Y值有顯著影響，可見(jiàn)試驗(yàn)因素對(duì)煙堿提取量的影響不是簡(jiǎn)單的線(xiàn)性關(guān)系，各因素對(duì)煙堿提取量的影響大小順序?yàn)榱弦罕龋舅囟龋舅r(shí)間。

2.2.4 響應(yīng)曲面擬合和最佳試驗(yàn)點(diǎn)的確定

為了更直觀(guān)地觀(guān)察各因素和各因素間的交互作用，利用Minitab軟件做出回歸方程中交互項(xiàng)的響應(yīng)曲面圖與等值線(xiàn)圖。

水浴溫度和水浴時(shí)間對(duì)煙堿提取量的影響見(jiàn)圖2，水浴溫度與料液比對(duì)煙堿提取量的影響見(jiàn)圖3，水浴時(shí)間與料液比對(duì)煙堿提取量的影響見(jiàn)圖4。

表7 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)（CCD）方差分析

圖2 水浴溫度和水浴時(shí)間對(duì)煙堿提取量的影響

由圖2可知，在料液比不變的前提下，水浴時(shí)間一定，隨水浴溫度的提高，煙堿提取量迅速增大，然后迅速減?。凰囟纫欢?，隨著水浴時(shí)間的延長(zhǎng)，煙堿的提取量先增加后緩慢降低，說(shuō)明水浴時(shí)間對(duì)煙堿提取量的影響比水浴溫度大。由圖3可知，在水浴時(shí)間不變的前提下，水浴溫度一定，隨著料液比的增大，煙堿的提取量先增加后緩慢降低；料液比一定，隨著水浴溫度的升高，煙堿的提取量先增加后迅速降低，說(shuō)明料液比對(duì)煙堿提取量的影響比水浴溫度大。由圖4可知，在水浴溫度不變的前提下，料液比一定，隨著水浴時(shí)間的延長(zhǎng)，煙堿的提取量先增加后降低；水浴時(shí)間一定，隨著料液比的增大，煙堿的提取量先增加后緩慢降低，說(shuō)明料液比對(duì)煙堿提取量的影響比水浴時(shí)間大。3個(gè)因素對(duì)煙堿提取量影響的先后順序?yàn)榱弦罕?、水浴時(shí)間和水浴溫度。

圖3 水浴溫度與料液比對(duì)煙堿提取量的影響

圖4 水浴時(shí)間與料液比對(duì)煙堿提取量的影響

通過(guò)中心旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)對(duì)試驗(yàn)進(jìn)行結(jié)果優(yōu)化，利用Minitab軟件求解響應(yīng)面方程最大值，結(jié)果見(jiàn)圖5，得出最佳提取工藝為水浴溫度52.3℃，水浴時(shí)間69.01 min，料液比1∶29.8（g∶mL），溶劑pH值為11。在此條件下得到煙堿的提取量預(yù)測(cè)值為4.591 1 mg/g。

響應(yīng)面方程最優(yōu)組合見(jiàn)圖5。

圖5 響應(yīng)面方程最優(yōu)組合

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

為檢驗(yàn)響應(yīng)面所得結(jié)果的可靠性，采用上述得到的最佳提取工藝組合進(jìn)行煙梗煙堿成分的提取。考慮到試驗(yàn)的進(jìn)行，將最佳工藝條件修改為水浴溫度 52℃，水浴時(shí)間 70 min，料液比 1∶30（g∶mL），pH值11，在此條件下對(duì)煙梗中的煙堿進(jìn)行提取，煙堿的提取量為4.522±0.051 mg/g，與預(yù)測(cè)值相差僅為1.5%，預(yù)測(cè)值可靠，說(shuō)明試驗(yàn)結(jié)果與模型符合良好，基于響應(yīng)面法分析所得的優(yōu)化提取工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)際參考價(jià)值。

3 結(jié)論

以煙梗為原料，通過(guò)單因素試驗(yàn)，系統(tǒng)研究溶劑pH值、水浴時(shí)間、水浴溫度和料液比對(duì)煙梗煙堿提取量的影響。利用Minitab進(jìn)行全因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)（DOE）、最陡爬坡試驗(yàn)和中心旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)（CCD），得出水溶劑提取煙梗中煙堿成分的最佳提取工藝為水浴溫度52℃，水浴時(shí)間70 min，料液比1∶30（g∶mL），溶劑pH值11，在此條件下，煙堿提取量為4.522±0.051 mg/g，與預(yù)測(cè)值基本相符，因此經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化后的提取條件是可行的。試驗(yàn)為煙梗資源化利用提供了一條途徑。

[1]李曉，紀(jì)曉楠，姚二民，等.煙用梗絲加工工藝研究進(jìn)展 [J]．貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（8）：182-186．

[2]于建軍．卷煙工藝學(xué) [M]．北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2009：75-80．

[3]張永良，周曉微，梁萌．煙梗綜合利用研究進(jìn)展 [J]．現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2016（8）：232-234．

[4]韓富根．煙草化學(xué) [M]．第2版．北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2010：33-40．

[5]馬俊勃．煙堿提取的研究進(jìn)展 [J]．廣東化工，2011，38（10）：72-73．

[6]White H E.Four-week nicotine skin patch treatment effects on cognitive performance in Alzheimer's disease[J].Psychopharmacology，1999 （7）：158-165.

[7]Levin E J.Nicotine-haloperidol interactions and cognitive performance in schizophrenia[J].Neuropsychopharmacology，1996，15 （5）：429-436.

[8]Masato S，Mari S，Hirofumi M.Nicotinic regulation of experience-dependent plasticity in visual cortex[J].Journal of Physiology，Paris，2016 （1/2）：29-36.

[9]劉智.淺析煙堿類(lèi)殺蟲(chóng)劑及其市場(chǎng)走勢(shì) [J].農(nóng)藥市場(chǎng)信息，2017（22）：34-34.

[10]袁菊如，徐國(guó)良.煙堿提取方法探討 [J].江西化工，2013 （2）：12-14.

[11]吳映捷，呂新美，閆兵兵，等.響應(yīng)面法優(yōu)化酶輔助提取廢棄煙葉中煙堿 [J].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2017（2）：203-209.

[12]米爾扎提·麥麥提，爾西丁·買(mǎi)買(mǎi)提，喀日耶姆·艾海提，等.正交試驗(yàn)優(yōu)化逆三相膜萃取煙堿的工藝研究 [J].新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2016（11）：1 436-1 439.

[13]張先海，史麗巖，史景明.煙堿的研究現(xiàn)狀 [J].海峽藥學(xué)，2010，22（11）：16-18.

[14]Deka D，Bhargavi P，Sharma A，et al.Enhancement of cellulase activity from a new strain of bacillus subtilis by medium optimization and analysis with various cellulosic substrates[J].Enzyme Research，2011（5）：151 656-151 662.

[15]顧華杰，孫燕，李良智，等.響應(yīng)面法優(yōu)化熱水浸提灰樹(shù)花多糖的工藝研究 [J].食品工業(yè)科技，2013（19）：234-238，243.

[16]張霞忠，王丹，董垠紅，等.中心組合設(shè)計(jì)優(yōu)化超聲提取檸檬籽中的檸檬苦素 [J].中成藥，2016（7）：1 500-1 504.◇