楊智輝 ， 劉媛媛，劉 輝

1.北大醫(yī)療淄博醫(yī)院兒科(淄博 255069) ，2.山東省濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院呼吸科(濟(jì)寧 272011)

胎膜早破指臨產(chǎn)前胎膜自然破裂，為臨產(chǎn)前常見病理現(xiàn)象，與感染、胎膜發(fā)育不良、宮腔內(nèi)壓力異常、子宮頸功能不全、機(jī)械性刺激、創(chuàng)傷等因素密切相關(guān)[1]。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)若胎膜早破>24 h，可誘發(fā)新生兒敗血癥、多臟器功能損害、感染等，嚴(yán)重情況下危及母兒生命，而胎膜早破母體新生兒出生后感染率普遍高于足月正常分娩新生兒，其敗血癥、膿毒癥等感染率高達(dá)1%～10%[2]，故早期發(fā)現(xiàn)感染并予以及時(shí)救治，對(duì)改善患兒預(yù)后具有重要意義。目前，常規(guī)感染預(yù)測(cè)指標(biāo)C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)、白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)等對(duì)新生兒細(xì)菌感染具有較好的預(yù)測(cè)價(jià)值，但其靈敏度、特異度有所欠缺[3]。近年來，有報(bào)道稱[4]炎癥標(biāo)志物可溶性髓樣細(xì)胞觸發(fā)受體-1(Triggering receptor expressed on myeloid cells-1，TREM-1)、中性粒細(xì)胞CD64(Leukocyte surface antigens CD64，CD64)對(duì)新生兒細(xì)菌感染具有較好的診斷意義，但關(guān)于臍血單核細(xì)胞計(jì)數(shù)(Monocyte count，MONO)、中性粒細(xì)胞(Polymorphonuclear neutrophil，PMN)表面TREM-1、CD64的表達(dá)水平預(yù)測(cè)胎膜早破母體新生兒感染鮮有報(bào)道。本文主要探究胎膜早破時(shí)MONO、PMN含量對(duì)新生兒感染的預(yù)測(cè)價(jià)值，報(bào)道如下。

資料與方法

1 一般資料 納入2014年8月至2017年8月于我院收治的110例足月胎膜早破新生兒為觀察組，其中男58例，女52例，胎齡37～40(38.40±0.75)周，新生兒體重3.5～5.2(3.40±0.25)kg；產(chǎn)婦年齡21～34(27.42±1.38)歲；新生兒評(píng)分(Apgar評(píng)分)：1 min時(shí)為(9.75±0.52)分，5 min時(shí)為(9.90±0.35)分；并選取同期正常新生兒110例為對(duì)照組，其中男60例，女50例，胎齡38～40(38.68±0.45)周，新生兒體重3.7～5.4(3.52±0.27)kg；產(chǎn)婦年齡23～33(27.53±1.35)歲；Apgar評(píng)分：1 min時(shí)為(9.72±0.54)分，5 min時(shí)為(9.94±0.28)分。本研究獲我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，兩組新生兒性別、胎齡、體重等一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《臨床婦產(chǎn)科學(xué)》[5]中相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)，伴陰道流液，經(jīng)陰道窺器檢查發(fā)現(xiàn)羊水自宮頸口流出；微鏡下陰道液干燥涂片試驗(yàn)可見羊齒狀結(jié)晶；石蕊試紙測(cè)測(cè)試pH>7；②單胎頭位妊娠，胎齡≥37周；③新生兒家屬對(duì)本研究知情且簽署同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)： ①新生兒合并先天性免疫缺陷、先天性發(fā)育畸形、代謝障礙等疾??；②巨大兒或極低體質(zhì)量新生兒；③產(chǎn)婦伴臨床細(xì)菌感染、先天性心臟病或HPV感染陽性者。

2 研究方法

2．1 儀器與試劑：采用北京時(shí)代北利離心機(jī)DT5-1型(北京時(shí)代北利有限公司)，F(xiàn)ACScalibur型流式細(xì)胞儀、溶血素均購自美國(guó)Becton Dickinson公司，酶標(biāo)儀為美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品，37℃恒溫箱、微量加樣器、真空采血管(EDTA-K2抗凝)均源自德國(guó)Hereaus公司，TREM-1-PE單克隆抗體、CD45-Krome Orange單克隆抗體、CD64 PerCp-CY 5.5單克隆抗體、IgG1 Krome Orange、IgG1-PE、IgG1 PerCp-CY 5.5均購自美國(guó)Becton-Dickinson公司。

2.2 臍血標(biāo)本采集：待新生兒娩出后采集EDTA抗凝臍靜脈血3 ml，即刻送至流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室待測(cè)。準(zhǔn)備測(cè)定管與同型對(duì)照管，每管保持100 μl，將TREM-1-PE、CD45-Krome Orange、CD64 Per Cp-CY 5.5(均為10 μl)分別置入測(cè)定管中，并將IgG1-PE、IgG1 Krome Orange、IgG1 PerCp-CY 5.5(均為10 μl)分別置入同型對(duì)照管中。送至室溫孵育，維持20 min后添加溶血素，待振蕩混勻處理后送至室溫，待孵育10 min后加入無鈣離子PBS緩沖液3 ml，按照1500 r/min速度離心5 min。棄上清后將細(xì)胞懸浮于0.5 ml無鈣離子PBS緩沖液中，振蕩混勻于30 min內(nèi)予以上機(jī)檢測(cè)。注意每個(gè)樣本獲取≥10000個(gè)目標(biāo)細(xì)胞，應(yīng)用Kaluza軟件予以數(shù)據(jù)分析。

2.3 胎盤標(biāo)本采集：待胎盤盤娩出后留取胎膜組織、大小胎盤(約1cm×1cm)，立即將標(biāo)本置入4%多聚甲醛固定。待固定處理后予以脫水、浸蠟、石蠟包埋、切片處理，注意切片厚度維持5 μm。由3名經(jīng)過系統(tǒng)培訓(xùn)的檢驗(yàn)醫(yī)師行雙盲法閱片，判斷是否為絨毛膜羊膜炎。絨毛膜羊膜炎診斷標(biāo)準(zhǔn)：參考《臨床婦產(chǎn)科學(xué)》[5]，當(dāng)胎膜或胎盤任何一處中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)每高倍視野≥11個(gè)即可確診。

2.4 外周血炎癥指標(biāo)檢測(cè)方法 ： 嚴(yán)格參考《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》，由3名經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)的檢驗(yàn)醫(yī)師應(yīng)用酶聯(lián)免疫法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA)檢測(cè)血清CRP、IL-6、降鈣素原(Procalcitonin，PCT)、血小板計(jì)數(shù)(Peripheric platelet count，PLT)，并采用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀檢測(cè)外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)(White blood cell，WBC)。

2.5 TREM-1、CD64表達(dá)水平檢測(cè)方法：由3名通過專業(yè)培訓(xùn)的檢驗(yàn)醫(yī)師嚴(yán)格參照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》，采用雙抗體夾心法與流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TREM-1、CD64水平，比較MONO表面TREM-1 MFI比值、MONO表面CD64 MFI比值、PMN表面TREM-1 MFI比值、PMN表面CD64 MFI比值。

3 觀察指標(biāo) 觀察兩組外周血炎癥指標(biāo)變化，包括CRP、IL-6、WBC、PLT，并分析胎盤病理診斷結(jié)果、新生兒感染情況及臍血TREM-1、CD64表達(dá)水平。新生兒感染診斷標(biāo)準(zhǔn)：參考《實(shí)用新生兒學(xué)(第4版)》[6]，DNA或病原菌抗原檢測(cè)呈陽性；非特異性檢查≥2條：①于新生兒出生2 h后采血，WBC減少<5×109/L，或增多(其中>3 d者WBC>20×109/L，<3d者WBC>25×109/L)；②桿狀核細(xì)胞/中性粒細(xì)胞比值≥0.16；③炎癥發(fā)生6～8 h后CRP明顯升高；④微量血沉≥15 mrn/lh；⑤PLT≤100×109/L。存在感染臨床表現(xiàn)且具備以上任意一條即可確診。

結(jié) 果

1 兩組外周血炎癥指標(biāo)比較 觀察組CRP、WBC、PLT、IL-6、PCT水平較對(duì)照組顯著升高(t=12.595、3.043、4.446、106.043、13.265，P=0.000、0.003、0.000、0.000、0.000)，見表1。

表1 兩組外周血炎癥指標(biāo)比較

2 兩組胎盤病理診斷結(jié)果與新生兒感染率比較 經(jīng)胎盤組織病理診斷發(fā)現(xiàn)，觀察組絨毛膜羊膜炎發(fā)生率為34.55%，對(duì)照組為11.82%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=14.702，P=0.000)；于產(chǎn)后1周(圍產(chǎn)兒期)內(nèi)，觀察組新生兒感染率為22.73%(25/110)，對(duì)照組為6.36%(7/110)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.848，P=0.001)，見表2。

表2 兩組胎盤病理診斷結(jié)果與新生兒感染率比較[例(%)]

3 兩組臍血TREM-1、CD64表達(dá)水平比較 觀察組臍血MONO、PMN表面TREM-1、CD64 MFI比值顯著高于對(duì)照組(t=14.888、8.345、11.919、35.767，P=0.000、0.000、0.000、0.000)，見表3。

表3 兩組臍血TREM-1、CD64表達(dá)水平比較%)

4 感染組與未感染組TREM-1、CD64表達(dá)水平比較 感染組臍血MONO、PMN表面TREM-1、CD64 MFI比值顯著高于對(duì)照組(t=2.064、2.452、2.007、2.148，P=0.041、0.016、0.047、0.034)，見表4。

表4 感染組、未感染組臍血TREM-1、CD64表達(dá)比較%)

討 論

有報(bào)道稱新生兒，尤其是早產(chǎn)兒，其免疫系統(tǒng)發(fā)育尚未完全成熟，免疫功能并不完善，感染風(fēng)險(xiǎn)較高，嚴(yán)重情況下會(huì)出現(xiàn)膿毒血癥，具有較高的病死率[7]。伴隨著臨床診療技術(shù)的不斷發(fā)展，譬如各種內(nèi)鏡檢查、穿刺、導(dǎo)管插管留置、透析療法等在臨床得到了廣泛應(yīng)用，但新生兒感染發(fā)病率未明顯下降。目前，國(guó)內(nèi)外檢測(cè)技術(shù)較為成熟，外周血血常規(guī)、CRP、IL-6、PCT等炎癥檢測(cè)指標(biāo)在新生兒感染性疾病早期診斷中得到了廣泛推廣。

本文研究結(jié)果顯示，觀察組CRP、WBC、PLT、IL-6、PCT 水平較對(duì)照組明顯升高，絨毛膜羊膜炎、產(chǎn)后1周(圍產(chǎn)兒期)內(nèi)新生兒感染率明顯高于對(duì)照組，證實(shí)早期新生兒感染時(shí)上述外周血炎癥指標(biāo)異常升高，易誘發(fā)病原菌經(jīng)臍帶血侵入圍生兒機(jī)體，致使新生兒感染。CRP為感染預(yù)測(cè)及監(jiān)控的急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，正常狀況下其水平較低，一旦機(jī)體遭受傷害性刺激或微生物侵入時(shí)，于短時(shí)間內(nèi)該因子大量合成并釋放入血，待感染消退后逐漸恢復(fù)正常水平[8]。有報(bào)道稱IL-6與多種病原微生物、細(xì)菌、病毒等誘發(fā)的機(jī)體感染密切相關(guān)，一旦遭受病原微生物侵入即可激活轉(zhuǎn)化為蛋白，刺激IL-6基因啟動(dòng)因子，促使其表達(dá)水平異常激活，誘發(fā)促炎癥反應(yīng)[9]。黃麗嬌等[10]報(bào)道胎膜早破患者逆行宮內(nèi)感染能誘導(dǎo)血CRP、IL-6水平明顯上升，一定程度上會(huì)促使炎癥反應(yīng)加重。此外，對(duì)于宮內(nèi)感染的胎膜早破患者來講，胎兒遭受病原微生物侵入的風(fēng)險(xiǎn)較高，而胎兒娩出后新生兒感染風(fēng)險(xiǎn)隨之升高，故胎膜早破外周血CRP、IL-6對(duì)新生兒感染存在一定預(yù)測(cè)價(jià)值。WBC計(jì)數(shù)為臨床感染鑒別常用指標(biāo)，但部分新生兒感染W(wǎng)BC計(jì)數(shù)無明顯變化，單一依據(jù)WBC計(jì)數(shù)診斷是否出現(xiàn)感染，其結(jié)果準(zhǔn)確性欠佳。PCT屬于降鈣素前肽物質(zhì)，為一種無激素活性糖蛋白，由116個(gè)氨基酸組成，正常生理狀況下由甲狀腺C細(xì)胞形成，血漿內(nèi)含量較低，細(xì)菌感染時(shí)會(huì)由甲狀腺以外組織大量產(chǎn)生，PCT水平異常升高，這與本文結(jié)論吻合[11]。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)觀察組臍血MONO、PMN表面TREM-1、CD64 MFI比值明顯高于對(duì)照組，且感染組上述指標(biāo)較對(duì)照組明顯升高，證實(shí)胎膜早破及新生兒感染與臍血TREM-1、CD64表達(dá)水平密切相關(guān)，而胎膜早破>24 h，臍血PMN、MONO表面TREM-1、CD64表達(dá)可能被激活，CD64、TREM-1參與了胎膜早破與新生兒感染的炎癥反應(yīng)過程。TREM-1屬于免疫球蛋白超家族中重要成員，可在成熟單核細(xì)胞、CD14+單核/巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等髓系細(xì)胞中表達(dá)，為炎癥反應(yīng)上游因子。作為先天免疫效應(yīng)細(xì)胞模式識(shí)別受體，當(dāng)機(jī)體遭受病原微生物侵入后基于TREM-1刺激下可觸發(fā)并放大級(jí)聯(lián)反應(yīng)與宿主反應(yīng)，利用TREM-1表達(dá)水平能對(duì)機(jī)體感染嚴(yán)重程度進(jìn)行判斷，具有放大、激發(fā)炎癥反應(yīng)，并可促進(jìn)抗炎因子下調(diào)[12]。有研究證實(shí)，伴隨著細(xì)胞因子的參與與炎癥反應(yīng)的逐漸加劇，會(huì)促使機(jī)體出現(xiàn)急性失控性炎癥反應(yīng)，引起早期新生兒感染，這與本研究結(jié)果相符，證實(shí)臍血TREM-1對(duì)胎膜早破是否并發(fā)早期新生兒感染進(jìn)行預(yù)測(cè)[13]。CD64屬于免疫球蛋白IgG Fc段受體1，于MONO、樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞表面分布，對(duì)IgG單體的親和力較高，能對(duì)免疫球蛋白進(jìn)行識(shí)別，并依次作用于介導(dǎo)細(xì)胞免疫與體液免疫過程，調(diào)控二者平衡。正常狀況下，CD64于PMN表面呈低表達(dá)，機(jī)體感染下PMN表面CD64 表達(dá)呈明顯升高趨勢(shì)。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)新生兒感染與母血、胎盤組織、羊水中CD64表達(dá)升高有關(guān)，在胎膜早破孕產(chǎn)婦中，尤其是針對(duì)宮內(nèi)感染者，中性粒細(xì)胞表面CD64被異常激活，呈高度表達(dá)，故其對(duì)孕產(chǎn)婦早期感染與新生兒感染中存在一定預(yù)測(cè)價(jià)值[14]。有報(bào)道稱胎膜早破孕產(chǎn)婦基于病原微生物侵襲下容易出現(xiàn)宮內(nèi)感染，母血TREM-1、CD64水平呈過度表達(dá)，而病原微生物經(jīng)臍血直接作用于胎兒，進(jìn)一步增加了圍生兒感染風(fēng)險(xiǎn)，證實(shí)母血TREM-1、CD64表達(dá)水平與胎膜早破孕產(chǎn)婦新生兒存在明顯關(guān)聯(lián)，這與本文研究結(jié)論吻合。

本文雖證實(shí)胎膜早破及新生兒感染與臍血PMN、MONO表面TREM-1、CD64表達(dá)密切相關(guān)，但本文仍存在一些不足之處，如選取樣本量有限，可能存在抽樣誤差；于入院后即刻檢測(cè)母血CRP、PLT、IL-6、CD64、TERM-1等水平，關(guān)于其水平變化趨勢(shì)是否對(duì)新生兒感染產(chǎn)生影響仍需深入研究；胎膜早破發(fā)生孕周是否對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響，尚需大樣本數(shù)據(jù)進(jìn)一步驗(yàn)證

綜上所述，臍血PMN、MONO表面TREM-1、CD64表達(dá)對(duì)胎膜早破及新生兒感染具有預(yù)測(cè)價(jià)值，值得臨床積極推廣。

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