趙 楠，辛 華，張樂(lè)寧，聶海英

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 胸外科，吉林 長(zhǎng)春130033)

肺癌血行轉(zhuǎn)移是一個(gè)高度選擇性的非隨機(jī)生物學(xué)過(guò)程，包括肺癌細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)之間一系列復(fù)雜的生物學(xué)作用。其中肺癌細(xì)胞向血管外游走是肺癌血行轉(zhuǎn)移的重要步驟。為此，我們?cè)隗w外模擬構(gòu)建了肺癌細(xì)胞血行轉(zhuǎn)移中的血管外游走過(guò)程，并對(duì)肺癌細(xì)胞的血管外游走狀況加以探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞

在包被有明膠的細(xì)胞培養(yǎng)皿上培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cell，HUVEC)；4種肺癌細(xì)胞分別為：VMRC-LCD、LK-2、A549、RERF-LC-KJ。

1.2 血管內(nèi)皮單細(xì)胞層的制備

將3×104個(gè)HUVEC加入預(yù)先制備膠原凝膠層的細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)[1]，培養(yǎng)1周，將細(xì)胞培養(yǎng)皿放入裝有正負(fù)電極的培養(yǎng)容器內(nèi)，與電阻測(cè)定儀相連，記錄血管內(nèi)皮單細(xì)胞層的電阻值。

1.3 肺癌細(xì)胞血管外游走實(shí)驗(yàn)

制成血管內(nèi)皮單細(xì)胞層后，分別將1×105個(gè)肺癌細(xì)胞(VMRC-LCD、LK-2、A549、RERF-LC-KJ)加入細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)；分別在血管內(nèi)皮單細(xì)胞層上加入肺癌細(xì)胞1 h、3 h、6 h、12 h后除去細(xì)胞培養(yǎng)液，將膠原凝膠層及其表面的細(xì)胞完整取出，石蠟包埋，制成組織切片，蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining)后在光鏡(100×)下分別觀察各種肺癌細(xì)胞與HUVEC粘附及游走至膠原凝膠中的狀態(tài)，同時(shí)記錄單位長(zhǎng)度(5 mm)中穿過(guò)HUVEC游走至膠原凝膠中的肺癌細(xì)胞數(shù)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 血管內(nèi)皮單細(xì)胞層的確認(rèn)

血管內(nèi)皮單細(xì)胞層的電阻值為9.68±2.05 ohm/cm2，與相關(guān)研究報(bào)道的數(shù)值基本一致[2]，可以認(rèn)為HUVEC已完全融合生長(zhǎng)，在膠原凝膠表面制備成血管內(nèi)皮單細(xì)胞層。

2.2 各種肺癌細(xì)胞的血管外游走狀況

分別在血管內(nèi)皮單細(xì)胞層上加入肺癌細(xì)胞(VMRC-LCD、LK-2、A549、RERF-LC-KJ)1 h、3 h、6 h、12 h后，觀察肺癌細(xì)胞與HUVEC粘附及游走至膠原凝膠中的狀況。我們觀察到LK-2、A549、RERF-LC-KJ能夠穿過(guò)血管內(nèi)皮單細(xì)胞層游走浸潤(rùn)至膠原凝膠層(圖1)，伴隨時(shí)間的推移游走至膠原凝膠中的細(xì)胞數(shù)量也越來(lái)越多；發(fā)現(xiàn)VMRC-LCD與LK-2、A549、RERF-LC-KJ不同，它幾乎不與血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生粘附，也更不能穿過(guò)血管內(nèi)皮細(xì)胞游走浸潤(rùn)至膠原凝膠層(圖2)；分別觀察不同時(shí)間段穿過(guò)血管內(nèi)皮單細(xì)胞層游走至膠原凝膠中的肺癌細(xì)胞數(shù)，LK-2均較A549、RERF-LC-KJ更多地游走至血管外，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，證明了與A549、RERF-LC-KJ相比LK-2具有更強(qiáng)的穿過(guò)血管內(nèi)皮的能力(表1)。

圖1 肺癌細(xì)胞的血管外游走狀況(LK-2)

圖2 肺癌細(xì)胞VMRC-LCD的血管外游走狀況

VMRC-LCDRERF-LC-KJA549LK-21 h03.65±1.213.17±1.157.26±2.18?3 h09.06±2.3510.62±3.8236.07±9.85?6 h021.87±7.3120.69±6.5857.93±11.37?12 h043.92±11.1740.53±11.64102.74±18.64?

注：*LK-2與VMRC-LCD、A549、RERF-LC-KJ相比P<0.05(n=6)

3 討論

肺癌血行轉(zhuǎn)移是一個(gè)高度選擇性的非隨機(jī)生物學(xué)過(guò)程，包括肺癌細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)之間一系列復(fù)雜的生物學(xué)作用。大部分進(jìn)入血液循環(huán)的肺癌細(xì)胞受到機(jī)體的免疫系統(tǒng)殺滅和血流的破壞，殘余的很小一部分肺癌細(xì)胞到達(dá)轉(zhuǎn)移靶器官后會(huì)停滯在微血管中，與血管內(nèi)皮細(xì)胞相互作用，穿過(guò)血管內(nèi)皮，游走至血管外，形成轉(zhuǎn)移灶。

肺癌的血行轉(zhuǎn)移具有器官組織特異性，按發(fā)生率遞減的順序，容易出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的器官有腦、骨骼、肝臟、腎上腺。這是因?yàn)檫M(jìn)入血液循環(huán)的肺癌細(xì)胞在靶器官穿過(guò)血管內(nèi)皮的前提是肺癌細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性粘附[3]。這種特異性粘附的分子基礎(chǔ)是靶器官的內(nèi)皮細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)所表達(dá)的粘附分子。粘附分子(adhesion molecules)是介導(dǎo)細(xì)胞之間及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間粘附作用的一類糖蛋白，與腫瘤細(xì)胞的侵襲及血行轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。根據(jù)粘附分子的結(jié)構(gòu)和功能，可分為:選擇素(selectins)、鈣依賴粘合蛋白(cadherins)、整合蛋白(integrins)、透明質(zhì)酸受體家族(hyaluronic acid receptor family)、免疫球蛋白超家族(immunoglobulin superfamily)及CD44、血管細(xì)胞粘附分子VCAM-l、PECAM-l(CD31)等。這些粘附分子大部分為分布在細(xì)胞膜表面的跨膜糖蛋白，還有少部分脂質(zhì)。所有的粘附分子都是以配體-受體相互作用的形式發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)[4]。實(shí)驗(yàn)中我們證實(shí)肺癌細(xì)胞VMRC-LCD與其他的肺癌細(xì)胞(LK-2、A549、RERF-LC-KJ)不同，它幾乎不與血管內(nèi)皮細(xì)胞相粘附，更不能穿過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞游走至膠原凝膠中，這說(shuō)明VMRC-LCD可能不表達(dá)與血管內(nèi)皮細(xì)胞相對(duì)應(yīng)粘附分子的配體。

肺癌細(xì)胞與靶器官的血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附著床后的下一步就是穿過(guò)血管內(nèi)皮游走至血管外。實(shí)驗(yàn)中我們證實(shí)肺癌細(xì)胞LK-2、A549、RERF-LC-KJ均可以穿過(guò)HUVEC單細(xì)胞層游走至膠原凝膠中，并發(fā)現(xiàn)在不同的時(shí)間段，LK-2均較A549、RERF-LC-KJ更多地游走至血管外，這說(shuō)明與A549、RERF-LC-KJ相比LK-2具有更強(qiáng)的穿過(guò)血管內(nèi)皮的能力。但肺癌細(xì)胞是如何進(jìn)行血管外游走的目前尚未完全闡明，希望通過(guò)我們的研究能夠初步揭示肺癌細(xì)胞的血管外游走狀況，并為以后的研究打下基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

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